一種百合種球脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種百合種球脫毒方法，包括以下步驟：(1)將百合種球在3?8℃放置40?50天；(2)選取芽長(zhǎng)為4?8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3?5個(gè)內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖盤放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為：光照強(qiáng)度1500?2000Lux，溫度35?40℃，處理時(shí)間2?5天；(3)選擇生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4?0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在23?25℃下暗培養(yǎng)1?2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為1500?2000Lux，光照時(shí)間為12?16小時(shí)/天，并以1?5℃/d的速度升溫，溫度升至35?45℃后，保持該溫度培養(yǎng)35?45天。本發(fā)明將熱處理和化學(xué)處理結(jié)合脫除百合種球病毒，不僅縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點(diǎn)，為培育百合無(wú)病毒植株，推廣無(wú)毒化栽培的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種百合種球脫毒方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物組培快繁技術(shù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種百合種球脫毒方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合是單子葉植物綱百合科(Li Iiaceae)百合屬(Li Iium)的總稱，為多年生宿根 草本花卉。百合屬在世界上有90余種，原產(chǎn)我國(guó)的約有47種，占世界總數(shù)的51%。百合栽培 品種繁多，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應(yīng)用，且 大多數(shù)百合可以食用，是上等的滋補(bǔ)佳品。百合素有"百年好合"之意，深受人們的喜愛(ài)。百 合主要分布在中國(guó)、日本、北美和歐洲等溫帶地區(qū)，我國(guó)近年來(lái)的百合切花生產(chǎn)發(fā)展較快， 在昆明、上海、深圳已形成三大生產(chǎn)基地。但其繁殖主要還是采用常規(guī)分球、分珠芽鱗片扦 插，鱗片包埋等繁殖的方式。長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖使百合體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使百合患病 毒病，影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003] 在已報(bào)道的十余種侵染百合的病毒中，發(fā)生最為普遍，危害最為嚴(yán)重的病毒有3 種：黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)、百合無(wú)癥病毒（Lily symptomless virus，LSV)和百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LMoV)，它們常表現(xiàn)為復(fù)合侵染，造成植 株的莖、葉或花出現(xiàn)斑駁或畸形，嚴(yán)重的導(dǎo)致植株矮小、退化甚至死亡，而且隨著病毒的傳 播，常導(dǎo)致百合大面積感病，嚴(yán)重影響了百合鮮切花的產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0004] 龍牙百合的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，種球繁殖是關(guān)鍵。在百合規(guī)?；N植中，我國(guó)百合種球繁 殖尚處于探索階段，繁殖方法可分為有性繁殖(種子繁殖)和無(wú)性繁殖兩種。其中有性繁殖 因?yàn)榉敝持芷谛枰?-4年，因?yàn)槎鄶?shù)百合雜種系不易結(jié)實(shí)，而且百合繁殖的后代容易發(fā)生變 異，不能完全保持原品種的優(yōu)良性狀，所以在實(shí)際生產(chǎn)中，百合較少用有性繁殖，而以無(wú)性 繁殖為主。其中無(wú)性繁殖主要采取的繁殖方式包括莖生小鱗莖繁殖、珠芽繁殖、鱗片扦插繁 殖和組織培養(yǎng)等。莖生小鱗莖繁殖獲得的種球質(zhì)量好，但繁殖系數(shù)低;珠芽繁殖形成商品球 的時(shí)間較長(zhǎng)，一般要經(jīng)過(guò)2-3年;鱗片扦插繁殖成本低、操作方便，且繁殖系數(shù)高，是快速繁 殖百合的有效方法。小鱗莖、珠芽、鱗片扦插的無(wú)性繁殖方法，均導(dǎo)致后代容易積累病毒，品 種退化現(xiàn)象十分嚴(yán)重。
[0005] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在以無(wú)性繁殖為主的植物上應(yīng)用廣泛，技術(shù)也相對(duì)成熟。采用 組織培養(yǎng)快繁龍牙百合，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量保持原有品種優(yōu)良性狀的優(yōu)質(zhì)種苗，如能 推行組織培養(yǎng)工廠化育苗，還能產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。目前，針對(duì)龍牙百合組織培養(yǎng)快繁的 專利還未見(jiàn)報(bào)道，文獻(xiàn)研究也主要集中在以獲得種苗形式的組織培養(yǎng)上，對(duì)種球形式的組 織培養(yǎng)產(chǎn)品研究較少，對(duì)于生長(zhǎng)于地下的龍牙百合鱗莖，帶菌多，外植體消毒十分困難，存 在污染率較高的問(wèn)題仍未得到較好的解決。
[0006] 百合病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法主要有指示植物法、電鏡檢測(cè)法、血清學(xué)方法等，1990年 以來(lái)，國(guó)外逐漸開展了針對(duì)百合病毒的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究。RT-PCR技術(shù)用于百合病毒檢 測(cè)在便捷性、靈敏度、特異性等方面均優(yōu)于上述幾種方法。而在傳統(tǒng)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái) 的多重RT-PCR技術(shù)，因其快速、靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)(Bertolini et al.，2001; Nie and Singh，2001)，近年來(lái)在百合病毒檢測(cè)方面得到了一定的研究。多重RTPCR又稱復(fù) RT-PCR，指將多對(duì)引物加入到一個(gè)反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列。應(yīng)用該技術(shù)可以一次檢 測(cè)多種病毒。
[0007] 目前國(guó)際上阻斷病毒傳播獲得脫毒苗的基本方法有:莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、化學(xué)處 理、熱處理。
[0008] 因此建立簡(jiǎn)便易行、脫毒率高的脫毒體系是減少病毒對(duì)百合的危害、恢復(fù)種性的 關(guān)鍵問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種百合種 球脫毒方法。
[0010] 本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] -種百合種球脫毒方法，包括以下步驟：
[0012 ](1)將百合種球在3-8 °C放置40-50天；
[0013] (2)選取芽長(zhǎng)為4-8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3-5個(gè)內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將 鱗莖盤放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為:光照強(qiáng)度1500-2000LUX，溫度35-40°C，處 理時(shí)間2-5天；
[0014] (3)選擇預(yù)處理后生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4-0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中， 先在23-25°C下暗培養(yǎng)1-2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為1500-2000Lux，光照時(shí)間 為12-16小時(shí)/天，并以1-5 °C/天的速度升溫，溫度升至35-45°C后，保持該溫度培養(yǎng)35-45 天。
[0015] 優(yōu)選地，所述的分化培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+6-BA1.2-1.8mg/L+NAA 0.35- 0 · 65mg/L+抗病毒劑 5_15mg/L。
[0016] 優(yōu)選地，所述的抗病毒劑為二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中一種或多種的 混合物。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍混合而成，所 述二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍的質(zhì)量比為（I-3): (1 -3): (1 -3)。
[0018] 具體的，在本發(fā)明中：
[0019] MS培養(yǎng)基的成份：
[0020] (1)大量元素：NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.90g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、MgS〇4 · 7H20 0 · 37g/L、CaCl2(2H20)0 · 44g/L;
[0021] (2)微量元素：MgS〇4 · 4H20 22.3mg/L、N3B03 6.2mg/L、ZnS〇4 · 7H208.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo〇4· 2H20 0.25g/L、CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L、CoCl · 6H2O 0.025mg/L、 FeS〇47H20 27 · 8mg/L、Na2-EDTA，37 · 3mg/L;
[0022] (3)有機(jī)成分:肌醇10〇11^凡、煙酸0.511^凡、1^-甘氨酸211^凡、維生素136 0.511^凡、維 生素 BI 0.1mg/L;
[0023] (4)蔗糖 3〇g/L;
[0024] (5)瓊脂 12g/L。
[0025] 6-BA，即6-芐氨基腺嘌呤，CAS號(hào)：1214-39-7。
[0026] NAA，即 1-萘乙酸，CAS 號(hào)：86-87-3。
[0027] 二氫尿嘧啶，CAS 號(hào)：504-07-4。
[0028] 2-硫脲嘧啶，CAS 號(hào)：141-90-2。
[0029]鹽酸嗎啉胍，CAS 號(hào)：3160-91-6。
[0030]本發(fā)明百合種球脫毒方法，將熱處理和化學(xué)處理結(jié)合脫除百合種球病毒，不僅縮 短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點(diǎn)，為培育百合無(wú)病毒植株，推廣無(wú) 毒化栽培的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 百合種球脫毒方法，包括以下步驟：
[0034] (1)將百合種球（品種為西伯利亞，Siberia)在4°C放置45天；
[0035] (2)選取芽長(zhǎng)為5cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留4個(gè)內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖 盤放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為:光照強(qiáng)度1600LUX，溫度38°C，處理時(shí)間3天； [0036] (3)選擇預(yù)處理后生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在 24°C下暗培養(yǎng)1天（即在24 °C黑暗無(wú)光的條件下放置1天），然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng) 度為1500LUX，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，移入培養(yǎng)箱中第1天溫度為24°C，并以2°C/天的速度 升溫，溫度升至36 °C后，以36 °C培養(yǎng)35天。
[0037] 所述的分化培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+抗病毒劑 9mg/L〇
[0038] 所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍按質(zhì)量比為1: 1:1混合而 成。
[0039] 實(shí)施例2
[0040]與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0041 ] 實(shí)施例3
[0042] 與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、鹽酸嗎啉胍 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] 與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于:所述的抗病毒劑由二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶 按質(zhì)量比為1:1混合而成。
[0045] 實(shí)施例5
[0046] 與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟(3)為:選擇生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度 為1500LUX，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，并保持溫度為24 °C培養(yǎng)30天。
[0047] 實(shí)施例6
[0048]與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟（3)為:選擇生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度 為1500Lux，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，并保持溫度為30 °C培養(yǎng)30天。
[0049] 實(shí)施例7
[0050] 與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于，所述步驟（3)為:選擇生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝 取0.6cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度 為1500Lux，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，并保持溫度為36 °C培養(yǎng)30天。
[0051] 測(cè)試?yán)?
[0052] 將實(shí)施例1-7中步驟(3)的莖尖在分化培養(yǎng)基中成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。具體測(cè)試結(jié)果見(jiàn) 表1。
[0053] 表1:成活率結(jié)果表
L 〇〇55 J 比較實(shí)施例1和實(shí)施例2-4,實(shí)施例1(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍復(fù)配） 成活率明顯高于實(shí)施例2-4(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中任意二者復(fù)配）。比較 實(shí)施例1與實(shí)施例5-7,實(shí)施例1(采用以2°C/天的速度升溫)成活率明顯高于于實(shí)施例2-4 (保持恒定溫度）。
[0056] 測(cè)試?yán)?
[0057]將實(shí)施例1-7中培養(yǎng)得到的莖尖脫毒率進(jìn)行測(cè)試。
[0058]利用多重RT-PCR檢測(cè)百合三種病毒（百合無(wú)癥病毒、黃瓜花葉病毒、百合斑駁病 毒)具體參照陳進(jìn)等發(fā)表在《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》上的文獻(xiàn)《百合三種主要病毒的RT-PCR檢 測(cè)及脫毒技術(shù)研究》中的方法。脫毒率結(jié)果見(jiàn)表2。
[0059] 表2:三種病毒脫毒率結(jié)果表
[0062]比較實(shí)施例1和實(shí)施例2-4，實(shí)施例1 (二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍復(fù)配） 三種病毒脫毒率明顯高于實(shí)施例2_4(二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中任意二者復(fù) 配）。比較實(shí)施例1與實(shí)施例5-7,實(shí)施例1(采用以2°C/天的速度升溫)三種病毒脫毒率明顯 高于于實(shí)施例2-4(保持恒定溫度）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種百合種球脫毒方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將百合種球在3-8 °C放置40-50天； (2) 選取芽長(zhǎng)為4-8cm的百合種球，剝?nèi)ネ鈱喻[片，留3-5個(gè)內(nèi)層鱗片的鱗莖盤，將鱗莖 盤放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為:光照強(qiáng)度1500-2000LUX，溫度35-40°C，處理時(shí) 間2-5天； (3) 選擇預(yù)處理后生長(zhǎng)正常的鱗莖盤，剝?nèi)?.4-0.7cm的莖尖移入分化培養(yǎng)基中，先在 23-25°C下暗培養(yǎng)1-2天，然后移入光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為1500-2000Lux，光照時(shí)間為 12-16小時(shí)/天，并以1-5 °C/天的速度升溫，溫度升至35-45 °C后，保持該溫度培養(yǎng)35-45天。2. 如權(quán)利要求1所述的百合種球脫毒方法，其特征在于:所述的分化培養(yǎng)基的配方為： MS培養(yǎng)基+6-BA 1 · 2-1 · 8mg/L+NAA 0 · 35-0 · 65mg/L+抗病毒劑5-15mg/L。3. 如權(quán)利要求2所述的百合種球脫毒方法，其特征在于：所述的抗病毒劑為二氫尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍中一種或多種的混合物。4. 如權(quán)利要求3所述的百合種球脫毒方法，其特征在于：所述的抗病毒劑由二氫尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍混合而成，所述二氫尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、鹽酸嗎啉胍的質(zhì)量比 為(1-3):(1-3):(1-3)〇
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105941143SQ201610268132
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】鄒聲達(dá), 鄒先佼, 鄒先佑, 張美鳳, 吳楊, 李曉紅, 胡雪華, 賀根和, 吳政元
【申請(qǐng)人】江西綠百合生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司