專利名稱：東方百合種球脫毒方法
技術領域：
本發(fā)明屬于在播種或種植前測試或處理種子的方法，具體涉及一種百合種球脫毒的方法。
背景技術：
東方百合是百合雜種類中花朵最大而又最美麗的一大類，能散發(fā)出怡人的香味， 故又稱之為香水百合，深受人們的喜愛，是世界上廣泛栽培的一大類百合雜種系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但長期的無性繁殖使病毒在體內積累，引發(fā)各種病毒病，嚴重影響種球和切花的產品品質，近年來，隨著我國百合引種數(shù)量和種植面積的迅速增加，以及不規(guī)范的種球自繁，病毒病開始在我國各百合種植區(qū)發(fā)生流行，病毒病一般發(fā)病率在40 50%，二代種球帶毒率有的達到90%以上，嚴重地制約了我國百合產業(yè)的提質增效。目前，國內外有關百合的脫毒處理主要是單獨采用熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒及相互間的組合脫毒，這些方法單獨使用時效率低，脫毒效果差，其普遍采用較好的是莖尖培養(yǎng)脫毒法，其常規(guī)的步驟是；通過植物頂端分生組織切取O. 2 O. 3mm莖尖，誘導愈傷組織，然后從愈傷組織分化產生鱗莖芽，長成小植株得到脫毒苗。例如，專利號為200410079513. 2的中國專利公開了一種“東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法”，是采用莖尖作為外植體，經滅菌，誘導培養(yǎng)后獲得東方百合脫毒鱗莖；該脫毒組織培養(yǎng)法存在的問題是切取很小的莖尖分生組織，在添加6-BA I. O 2. O mg / L和NAA O. 2 O. 5mg / L的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 25d，莖尖會同時形成愈傷組織和不定芽，但從愈傷組織分化的不定芽易發(fā)生遺傳變異；且未對病毒進行進一步的檢測和監(jiān)控，難于了解脫毒情況。也有如專利號為200910091972. 5的中國專利公開了 “一種百合種球病毒的脫除方法”，是采用暗培養(yǎng)，對無性繁殖系的組培苗兩次剝取莖尖進行消毒并脫毒，莖尖的脫毒方式為莖尖熱處理結合化學藥劑脫毒，變溫處理種球球芯3 5周，溫度范圍為25 38°C， 同時用病毒唑脫毒，濃度為5 7mg/ml，莖尖大小為O. 4 I. 2mm。該方法是對組培苗進行脫毒，組培苗需在無菌條件下獲取，獲取環(huán)境要求嚴格。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種綜合運用熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒的東方百合種球脫毒方法，該方法能有效減少病毒交叉感染的機會，脫毒率高，成活率高，能有效縮短種球培養(yǎng)周期。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)東方百合種球脫毒方法，包括以下步驟
A、外植體生長點的剝取選優(yōu)質種球，用濃度為20 40%的多菌靈600倍溶液浸泡30 分鐘；將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為45 55%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種20 25個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭45 55%的水分；在溫度為21 23°C，濕度為70 80%，光照強度1500 2000Lx，光照時間8 12h/d的條件下，經過5 7天后，芽
4長到5 6cm時進行熱處理脫毒。B、熱處理脫毒將溫度控制在35 38°C之間，濕度為70 85%，光照強度1500Lx， 光照時間8 12h/d的環(huán)境條件下，經過7 15天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。C、外植體清洗消毒①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗5分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為O. 1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為75%的酒精浸泡8 15秒；@吐溫80無菌水浸泡2 3分鐘； 再用無菌水洗5 7遍至無泡沫。D、生長點采集誘導培養(yǎng)采集長度為O. 3 O. 5 _的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度21 23°C，光照強度1500 3000Lx，光照時間8 12h/d，培養(yǎng)40 60天后，生長點膨大成直徑2 3cm的葉叢。其中，誘導培養(yǎng)基為1/ 2MS+BA2. 5 5mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+ 糖 40g/l+ 瓊脂
5.5g/L。E、脫毒培養(yǎng)將誘導出的葉叢切成O. 5cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為 21 23°C，光照時間為8 12h/d，光照強度為2000 3000Lx的環(huán)境條件下，經過40 60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。脫毒培養(yǎng)基為MS+ ΝΑΑ0. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+病毒唑5 mg/L+瓊脂
6.O g/Lo其中，病毒唑的添加方法如下
a.用無菌蒸懼水配制好濃度為O. 2mg/ml的病毒唑母液。b.將無菌注射器的針頭換成直徑小于O. 2納米的濾篩，用帶濾篩的無菌注射器吸取病毒唑母液。c.將高溫滅菌后的培養(yǎng)基MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+瓊脂6. O g/L，冷至35 40°C時，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后搖勻，分裝入無菌瓶中，待冷卻凝固后用于藥物脫毒接種。F、病毒檢測將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。優(yōu)選的，步驟A是用濃度為40%的多菌靈600倍溶液浸泡種球30分鐘。步驟D是采集長度為O. 3 O. 4 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。有益效果
①本發(fā)明采用綜合脫毒技術，即將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結合的方法，有效解決了單獨使用一種方法存在的不足，縮短了培養(yǎng)周期，減少病毒交叉感染，植株成活率高，脫毒率明顯提高，百合脫毒率達到80%以上，脫毒率較只采用高溫處理提高了 25 70%。②本發(fā)明的脫毒方法，采用了 35 38°C的高溫，在該高溫下病毒出現(xiàn)鈍化，其復制明顯減弱或不再繁殖，該期間生產的嫩梢?guī)Р《据^少，且該溫度能保證植株的成活率。
③本發(fā)明脫毒培養(yǎng)基內添加病毒唑的方法能使脫毒更徹底。④熱處理后剝取O. 3 O. 5 _的莖尖生長點進行培養(yǎng)，此操作簡單，易于操作，脫毒效果好。
具體實施例實施例I:東方百合種球脫毒方法，包括以下步驟A、外植體生長點的剝取選優(yōu)質種球，用濃度為20%的多菌靈600倍溶液浸泡30分鐘； 將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為45%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種20個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭45%的水分；在溫度為21°C，濕度為70%，光照強度1500Lx，光照時間8h/d的條件下，經過5 7天后，芽長到5cm時進行熱處理脫毒。B、熱處理脫毒將溫度控制在35°C之間，濕度為70%，光照強度1500Lx，光照時間 8h/d的環(huán)境條件下，經過7 15天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。C、外植體清洗消毒①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗5分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為O. 1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為75%的酒精浸泡8秒吐溫80無菌水浸泡2分鐘； 再用無菌水洗5遍至無泡沫。D、生長點采集誘導培養(yǎng)采集長度為O. 3 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度21 °C，光照強度1500Lx，光照時間8h/d，培養(yǎng)40 60天后，生長點膨大成直徑2cm的葉叢。E、脫毒培養(yǎng)將誘導出的葉叢切成O. 5cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為 21°C，光照時間為8h/d，光照強度為2000LX的環(huán)境條件下，經過40 60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。F、病毒檢測將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。實施例2 :東方百合種球脫毒方法，包括以下步驟
A、外植體生長點的剝取選優(yōu)質種球，用濃度為30%的多菌靈600倍溶液浸泡30分鐘； 將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為50%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種22個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭50%的水分；在溫度為22°C，濕度為75%，光照強度1800Lx，光照時間10h/d的條件下，經過5 7天后，芽長到5. 5cm時進行熱處理脫毒。B、熱處理脫毒將溫度控制在36°C之間，濕度為80%，光照強度1500Lx，光照時間 10h/d的環(huán)境條件下，經過7 15天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。C、外植體清洗消毒①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗5分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為O. 1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為75%的酒精浸泡11秒吐溫80無菌水浸泡3分鐘； 再用無菌水洗6遍至無泡沫。D、生長點采集誘導培養(yǎng)采集長度為O. 4 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度22°C，光照強度2000Lx，光照時間10h/d，培養(yǎng)40 60天后，生長點膨大成直徑3cm的葉叢。其中，誘導培養(yǎng)基為I/ 2MS+BA 4mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+糖 40g/l+瓊脂 5. 5g/ L。E、脫毒培養(yǎng)將誘導出的葉叢切成O. 5cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為 220C，光照時間為10h/d，光照強度為2500LX的環(huán)境條件下，經過40 60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。F、病毒檢測將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。
實施例3:東方百合種球脫毒方法，包括以下步驟
A、外植體生長點的剝取選優(yōu)質種球，用濃度為40%的多菌靈600倍溶液浸泡30分鐘； 將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為55%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的泥炭中，每箱下種25個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持泥炭55%的水分；在溫度為23°C，濕度為80%，光照強度2000Lx，光照時間12h/d的條件下，經過5 7天后，芽長到6cm時進行熱處理脫毒。B、熱處理脫毒將溫度控制在38°C之間，濕度為85%，光照強度1500Lx，光照時間 12h/d的環(huán)境條件下，經過7 15天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀。C、外植體清洗消毒①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗5分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為O. 1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為75%的酒精浸泡14秒吐溫80無菌水浸泡2分鐘； 再用無菌水洗7遍至無泡沫。D、生長點采集誘導培養(yǎng)采集長度為O. 5 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度23°C，光照強度3000Lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)40 60天后，生長點膨大成直徑2cm的葉叢。其中，誘導培養(yǎng)基為I/ 2MS+BA 4mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+糖 40g/l+瓊脂 5. 5g/ L。E、脫毒培養(yǎng)將誘導出的葉叢切成O. 5cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為 230C，光照時間為12h/d，光照強度為3000LX的環(huán)境條件下，經過40 60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。脫毒培養(yǎng)基為MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+病毒唑5 mg/L+瓊脂
6.O g/L。其中，病毒唑的添加方法如下
a.用無菌蒸懼水配制好濃度為O. 2mg/ml的病毒唑母液。b.將無菌注射器的針頭換成直徑小于O. 2納米的濾篩，用帶濾篩的無菌注射器吸取病毒唑母液。c.將高溫滅菌后的培養(yǎng)基MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+瓊脂6. O g/L，冷至40°C時，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后搖勻，分裝入無菌瓶中，待冷卻凝固后用于藥物脫毒接種。F、病毒檢測將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。
權利要求
1.東方百合種球脫毒方法，其特征在于，包括以下步驟A、外植體生長點的剝取選優(yōu)質種球，用濃度為20 40%的多菌靈600倍溶液浸泡30 分鐘；將消過毒的泥炭用水拌濕，使其含水量為45 55%，備用；再將多菌靈浸泡后的種球種在拌濕的基質中，每箱下種20 25個種球，澆定根水，然后將泡過種球的多菌靈溶液灑在表面；按切花種植方法正常管理，保持基質45 55%的水分；在溫度為21 23°C，濕度為70 80%，光照強度1500 2000Lx，光照時間8 12h/d的條件下，經過5 7天后，芽長到5 6cm時進行熱處理脫毒；B、熱處理脫毒將溫度控制在35 38°C之間，濕度為70 85%，光照強度1500Lx，光照時間8 12h/d的環(huán)境條件下，經過7 15天培養(yǎng)，芽長高并綻開成蓮座狀；C、外植體清洗消毒①用清水沖洗后，剝去部分葉片，用中性肥皂水洗5分鐘，用紗布包好，清水沖洗12小時；②用濃度為0. 1%的升汞浸泡8分鐘；③再用濃度為75%的酒精浸泡8 15秒；④吐溫80無菌水浸泡2 3分鐘； 再用無菌水洗5 7遍至無泡沫；D、生長點采集誘導培養(yǎng)采集長度為0.3 0. 5 mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度21 23°C，光照強度1500 3000Lx，光照時間8 12h/d，培養(yǎng)40 60天后，生長點膨大成直徑2 3cm的葉叢；E、脫毒培養(yǎng)將誘導出的葉叢切成0.5cm小塊，接種于脫毒培養(yǎng)基中，在溫度為21 230C，光照時間為8 12h/d，光照強度為2000 3000Lx的環(huán)境條件下，經過40 60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗；F、病毒檢測將瓶苗采用RT-PCR檢測法檢測，經檢測確認無任何病蟲害現(xiàn)象，并不帶百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒等病毒，即為百合脫毒種苗。
2.根據(jù)權利要求I所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟A是用濃度為40% 的多菌靈600倍溶液浸泡種球30分鐘。
3.根據(jù)權利要求I所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟D是采集長度為0.3 0. 4mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求2所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟D是采集長度為0.3 0. 4mm的百合莖尖生長點接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求I 4中任一項所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟D中的誘導培養(yǎng)基為I / 2MS+BA2. 5 5mg/L+ NAA0. 25 mg/L+ 糖 40g/l+ 瓊脂 5. 5g/L。
6.根據(jù)權利要求I 4中任一項所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟E中的脫毒培養(yǎng)基為MS+ NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+病毒唑5 mg/L+瓊脂6.0 g/ L0
7.根據(jù)權利要求5所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟E中的脫毒培養(yǎng)基為MS+ NAAO. 2mg/L+ 0. 4% 糖 + 活性炭 0. 5%+ 病毒唑 5 mg/L+ 瓊脂 6. 0 g/L。
8.根據(jù)權利要求6所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟E中病毒唑的添加方法如下a.用無菌蒸懼水配制好濃度為0.2mg/ml的病毒唑母液；b.將無菌注射器的針頭換成直徑小于0.2納米的濾篩，用帶濾篩的無菌注射器吸取病毒唑母液；c.將高溫滅菌后的培養(yǎng)基MS+NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+瓊脂6.0 g/L,冷至35 40°C時，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后搖勻，分裝入無菌瓶中，待冷卻凝固后用于藥物脫毒接種。
9.根據(jù)權利要求7所述的東方百合種球脫毒方法，其特征在于，步驟E中病毒唑的添加方法如下a.用無菌蒸懼水配制好濃度為0.2mg/ml的病毒唑母液；b.將無菌注射器的針頭換成直徑小于0.2納米的濾篩，用帶濾篩的無菌注射器吸取病毒唑母液；c.將高溫滅菌后的培養(yǎng)基MS+NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+瓊脂6.0 g/L, 冷至35 40°C時，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后搖勻，分裝入無菌瓶中，待冷卻凝固后用于藥物脫毒接種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種東方百合種球脫毒方法，具體通過以下步驟完成A、外植體生長點的剝取，B、熱處理脫毒，C、外植體清洗消毒，D、生長點采集誘導培養(yǎng)，E、脫毒培養(yǎng)，F(xiàn)、病毒檢測。該發(fā)明克服了現(xiàn)有技術存在的不足，綜合運用熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒的脫毒方法，解決了單獨使用一種方法存在的不足，該方法能有效減少病毒交叉感染的機會，脫毒率高，成活率高，能有效縮短種球培養(yǎng)周期。
文檔編號A01H4/00GK102577965SQ20121005097
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權日2012年3月1日
發(fā)明者吳梅, 梁曉紅, 陳朋從 申請人:玉溪明珠花卉股份有限公司