專利名稱：一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生，尤其涉及一種利用幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法。
背景技術(shù)：
百合是百合科百合屬多年生草本球根植物，主要分布在亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區(qū)，全球已發(fā)現(xiàn)有百多個品種，中國是其最主要的起源地，原產(chǎn)五十多種，是百合屬植物自然分布中心。近年更有不少經(jīng)過人工雜交而產(chǎn)生的新品種，如亞洲百合、麝香百合、香水百合等。百合的主要應(yīng)用價值在于觀賞，有些品種可作為蔬菜食用和藥用。百合花素有“云裳仙子”之稱。由于其外表高雅純潔，天主教以百合花為瑪利亞的象征，而梵蒂網(wǎng)以百合花象征民族獨立，經(jīng)濟(jì)繁榮并把它做為國花。百合的鱗莖由鱗片抱合而成，有“百年好合” “百事合意”之意，中國人自古視為婚禮必不可少的吉祥花卉。百合在插花造型中可做焦點花，骨架花。它屬于特殊型花材。產(chǎn)地分布產(chǎn)地及分布中國、日本、北美和歐洲等溫帶地區(qū)。百合花花姿雅致，葉片青翠娟秀，莖干亭亭玉立，是名貴的切花新秀。百合新品種的培育多數(shù)是通過種間或種系間遠(yuǎn)緣雜交實現(xiàn)的，要使雜交組合獲得成功，不僅要有足夠數(shù)量的雜交種子，而且必須保證雜種后代植株有足夠的生活力與生育力。雜種胚的挽救培養(yǎng)技術(shù)作為組織培養(yǎng)的一個重要領(lǐng)域己有近百年的歷史，雜交子房、胚珠和雜交幼胚的離體培養(yǎng)，是目前克服受精后發(fā)育障礙的有效方法，在植物育種工作中發(fā)揮著極為重要的作用，己廣泛運用于水稻、小麥、玉米等糧食作物的育種工作中。當(dāng)前世界各國培育的亞洲百合和東方百合雜種系，多數(shù)是屬于不同的種群和雜種間雜交育成的，由于是遠(yuǎn)緣雜交，雜交胚的胚乳發(fā)育不正?；蚴桥吲c胚乳之間生理上的不協(xié)調(diào)而使雜種胚早期敗育。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述問題，本發(fā)明提供了一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，該方法能夠提高東方百合雜交后代的雜種成活率，縮短育種周期。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，包括以下步驟
A、果實消毒將授粉后30 60天的未完全發(fā)育子房切割下來，在2 7°C溫度條件下，存放24 72小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2 3次后帶到超凈工作臺。B、剝胚用分析純酒精浸泡25 35秒，放在酒精燈上燒10 30秒，然后選取膨大部位，將子房沿著心皮線切開，選出有胚種子剝離出胚，接入1/2MS+糖60g/L+瓊脂5. 5g/ L，PH 5. 8培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 45天后幼胚萌發(fā)率達(dá)100%。C、增殖培養(yǎng)將萌發(fā)的幼胚接種到 MS+KT 5mg/L+NAA O. 2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA O. 3mg/L+瓊脂6.5 7.0g/L，PH 5. 8，在溫度 22 25°C，光照強(qiáng)度 1500 2000Lx，光照8 12h/d的環(huán)境條件下進(jìn)行幼苗小鱗莖培養(yǎng)，20 30天轉(zhuǎn)接一次。D、成球培養(yǎng)經(jīng)過步驟C的處理，當(dāng)增殖數(shù)量達(dá)到目標(biāo)數(shù)量時，將其分離成單株， 切除葉片后接種到MS+ NAAO. I mg/L +糖60g/L+瓊脂6. 5g/L+活性炭2 5g/L，PH 5. 8 的培養(yǎng)基上，20 30天即可生根，大部分小球膨大為直徑O. 5 I. Ocm籽球。E、低溫處理將步驟D的籽球放入冷庫中，在溫度為3 4°C的條件下，冷藏處理 30 40天后打破休眠，即可移栽，測得成活率達(dá)95 98%。優(yōu)選的，所述步驟A中未完全發(fā)育的子房切割下來后，在2 TC溫度條件下，存放 36 48小時后取出。所述步驟B剝胚時用分析純酒精浸泡10 15秒，放在酒精燈上燒5-10秒。有益效果
①本發(fā)明通過雜交授粉30 60天后獲得的幼胚離體培養(yǎng)，此時胚已接近成熟，易剝離進(jìn)行培養(yǎng)。②該方法能使大量遠(yuǎn)緣雜交胚繼續(xù)發(fā)育成正常種子，有效避免遠(yuǎn)緣雜種胚早衰， 同時獲得大量的遠(yuǎn)緣雜交后代，實現(xiàn)百合屬種間遠(yuǎn)緣雜交。③本發(fā)明在剝胚過程對子房消毒時采用分析純酒精浸泡25 35秒，放在酒精燈上燒10 30秒，避免了升汞消毒的毒害作用，操作簡單，且能對子房進(jìn)行有效的消毒處理。④本發(fā)明采用的增值培養(yǎng)基，即MS+KT 5mg/L+NAA O. 2mg/L+CPPU 4mg/L+糖40 g/L +BA O. 3mg/L+瓊脂6. 5 7. 0g/L，PH 5. 8，可使幼苗增殖的鱗莖數(shù)目較多，在短時間內(nèi)獲得大量雜種苗，同時有利于百合鱗莖的膨大，從而保障了移栽后成活率，大大節(jié)約成本。⑤該方法采用低溫處理，促進(jìn)膨大子房進(jìn)一步成熟，促使剝離胚快速萌芽，大大縮短育種周期；同時提高了雜種成活率，使其成活率達(dá)到95 98 %。
具體實施例實施例I :一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，包括以下步驟
A、果實消毒將授粉后40天的未完全發(fā)育子房切割下來，在3°C溫度條件下，存放24 小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2次后帶到超凈工作臺。B、剝胚用分析純酒精浸泡10秒，放在酒精燈上燒6秒，然后選取膨大部位，將子房沿著心皮線切開，選出有胚種子剝離出胚，接入1/2MS+糖60g/L+瓊脂5. 5g/L，PH 5. 8培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 45天后幼胚萌發(fā)率達(dá)100%。C、增殖培養(yǎng)將萌發(fā)的幼胚接種到 MS+KT 5mg/L+NAA O. 2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA O. 3mg/L+ 瓊脂 6. 5g/L，PH 5. 8，在溫度 22°C，光照強(qiáng)度 1500Lx，光照 8h/d 的環(huán)境條件下進(jìn)行幼苗小鱗莖培養(yǎng)，20天轉(zhuǎn)接一次。D、成球培養(yǎng)經(jīng)過步驟C的處理，當(dāng)增殖數(shù)量達(dá)到目標(biāo)數(shù)量時，將其分離成單株， 切除葉片后接種到MS+ NAAO. I mg/L +糖60g/L+瓊脂6. 5g/L+活性炭2g/L，PH 5. 8的培養(yǎng)基上，20 30天即可生根，大部分小球膨大為直徑O. 5cm籽球。E、低溫處理將步驟D的籽球放入冷庫中，在溫度為3°C的條件下，冷藏處理30天后打破休眠，即可移栽，測得成活率達(dá)95 98%。實施例2 :—種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，包括以下步驟
A、果實消毒將授粉后45天的未完全發(fā)育子房切割下來，在4°C溫度條件下，存放48小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭3次后帶到超凈工作臺。B、剝胚用分析純酒精浸泡12秒，放在酒精燈上燒7秒，然后選取膨大部位，將子房沿著心皮線切開，選出有胚種子剝離出胚，接入1/2MS+糖60g/L+瓊脂5. 5g/L，PH 5. 8培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 45天后幼胚萌發(fā)率達(dá)100%。C、增殖培養(yǎng)將萌發(fā)的幼胚接種到 MS+KT 5mg/L+NAA O. 2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA O. 3mg/L+ 瓊脂 7. Og/L, PH 5. 8，在溫度 23°C，光照強(qiáng)度 1800Lx,光照 10h/d 的環(huán)境條件下進(jìn)行幼苗小鱗莖培養(yǎng)，25天轉(zhuǎn)接一次。D、成球培養(yǎng)經(jīng)過步驟C的處理，當(dāng)增殖數(shù)量達(dá)到目標(biāo)數(shù)量時，將其分離成單株， 切除葉片后接種到MS+ NAAO. I mg/L +糖60g/L+瓊脂6. 5g/L+活性炭3g/L，PH 5. 8的培養(yǎng)基上，20 30天即可生根，大部分小球膨大為直徑O. 8cm籽球。E、低溫處理將步驟D的籽球放入冷庫中，在溫度為4°C的條件下，冷藏處理35天后打破休眠，即可移栽，測得成活率達(dá)95 98%。實施例3 :—種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，包括以下步驟
A、果實消毒將授粉后50天的未完全發(fā)育子房切割下來，在5°C溫度條件下，存放72 小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2次后帶到超凈工作臺。B、剝胚用分析純酒精浸泡15秒，放在酒精燈上燒8秒，然后選取膨大部位，將子房沿著心皮線切開，選出有胚種子剝離出胚，接入1/2MS+糖60g/L+瓊脂5. 5g/L，PH 5. 8培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 45天后幼胚萌發(fā)率達(dá)100%。C、增殖培養(yǎng)將萌發(fā)的幼胚接種到 MS+KT 5mg/L+NAA O. 2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA O. 3mg/L+瓊脂 6. 5g/L，PH 5. 8，在溫度 24°C，光照強(qiáng)度 2000Lx，光照 12h/d 的環(huán)境條件下進(jìn)行幼苗小鱗莖培養(yǎng)，30天轉(zhuǎn)接一次。D、成球培養(yǎng)經(jīng)過步驟C的處理，當(dāng)增殖數(shù)量達(dá)到目標(biāo)數(shù)量時，將其分離成單株， 切除葉片后接種到MS+ NAAO. I mg/L +糖60g/L+瓊脂6. 5g/L+活性炭4g/L，PH 5. 8的培養(yǎng)基上，20 30天即可生根，大部分小球膨大為直徑I. Ocm籽球。E、低溫處理將步驟D的籽球放入冷庫中，在溫度為3°C的條件下，冷藏處理40天后打破休眠，即可移栽，測得成活率達(dá)95 98%。
權(quán)利要求
1.一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，其特征在于，包括以下步驟A、果實消毒將授粉后30 60天的未完全發(fā)育子房切割下來，在2 7°C溫度條件下， 存放24 72小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2 3次后帶到超凈工作臺；B、剝胚用分析純酒精浸泡25 35秒，放在酒精燈上燒10 30秒，然后選取膨大部位，將子房沿著心皮線切開，選出有胚種子剝離出胚，接入1/2MS+糖60g/L+瓊脂5. 5g/L， PH 5. 8培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 45天后幼胚萌發(fā)率達(dá)100% ；C、增殖培養(yǎng)將萌發(fā)的幼胚接種到MS+KT5mg/L+NAA 0. 2mg/L+CPPU 4mg/L+糖40 g/L +BA 0. 3mg/L+瓊脂 6. 5 7. 0g/L，PH 5. 8，在溫度 22 25°C，光照強(qiáng)度 1500 2000Lx，光照8 12h/d的環(huán)境條件下進(jìn)行幼苗小鱗莖培養(yǎng)，20 30天轉(zhuǎn)接一次；D、成球培養(yǎng)經(jīng)過步驟C的處理，當(dāng)增殖數(shù)量達(dá)到目標(biāo)數(shù)量時，將其分離成單株，切除葉片后接種到MS+ NAAO. I mg/L +糖60g/L+瓊脂6. 5g/L+活性炭2 5g/L，PH 5. 8的培養(yǎng)基上，20 30天即可生根，大部分小球膨大為直徑0. 5 I. Ocm籽球；E、低溫處理將步驟D的籽球放入冷庫中，在溫度為3 4°C的條件下，冷藏處理30 40天后打破休眠，即可移栽，測得成活率達(dá)95 98%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，其特征在于， 所述步驟A中未完全發(fā)育的子房切割下來后，在2 7°C溫度條件下，存放36 48小時后取出。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，其特征在于，所述步驟B剝胚時用分析純酒精浸泡10 15秒，放在酒精燈上燒5-10秒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種幼胚拯救獲得東方百合遠(yuǎn)緣雜種的方法，具體通過以下步驟完成A、果實消毒，B、剝胚，C、增殖培養(yǎng)，D、成球培養(yǎng)，E、低溫處理。該發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，使大量遠(yuǎn)緣雜交胚繼續(xù)發(fā)育成正常種子，有效避免了遠(yuǎn)緣雜種胚早衰，同時獲得大量的遠(yuǎn)緣雜交后代，實現(xiàn)百合屬種間遠(yuǎn)緣雜交。該方法能夠提高東方百合雜交后代的雜種成活率，縮短育種周期。
文檔編號A01H4/00GK102577966SQ20121005097
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者瞿萍梅, 胡緒嵐, 陳朋從 申請人:玉溪明珠花卉股份有限公司