用于免疫治療的多克隆γδ T細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本文所提供的是一種擴(kuò)大具有抗腫瘤、抗病毒以及抗細(xì)菌活性的多克隆γδT細(xì)胞的臨床相關(guān)量的方法。多克隆γδTγδ細(xì)胞可靶向多種腫瘤，包括實(shí)體瘤以及其他病狀，諸如病毒和細(xì)菌感染。
【專利說明】用于免疫治療的多克隆γ st細(xì)胞
[0001 ]本申請(qǐng)要求2013年10月25日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/895,626的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其 全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0002] 本發(fā)明根據(jù)由國防部授予的批準(zhǔn)號(hào)10626252在美國政府支持下進(jìn)行。政府對(duì)本發(fā) 明具有某些權(quán)利。
[0003] 發(fā)明背景 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明一般涉及醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。在某些方面中，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及免疫治療。 更具體地說，其涉及臨床級(jí)多克隆γ對(duì)細(xì)胞的制備和使用此類細(xì)胞的治療方法。
[0005] 2.相關(guān)技術(shù)說明
[0006] 人類γδΤ細(xì)胞具有展現(xiàn)一系列效應(yīng)功能的先天和后天品質(zhì)，包括在細(xì)胞接觸后的 細(xì)胞溶解（Bonneville等，2010)。腫瘤靶細(xì)胞的識(shí)別和后續(xù)殺傷是通過γ與δΤ細(xì)胞受體 (TCR)鏈的異二聚體來實(shí)現(xiàn)。人類TCR可變(V)區(qū)界定14個(gè)獨(dú)特的Vy等位基因、3個(gè)獨(dú)特的νδ 等位基因（νδ1、νδδ2和νδ3)，以及5個(gè)νδ，其與Va等位基因共用相同的命名法(νδ4/να14、νδ 5/να29、νδ6/να23、νδ7/να36 以及 ￥58/￥〇38-2)(1^打311(3,2001)。表達(dá)1'0^/1^邸異二聚體的 Τ細(xì)胞占外周血(ΡΒ)Τ細(xì)胞的約95%，并且在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的情形下識(shí) 別肽(Turchinovich和Pennington，2011)。相比之下，TCR γ δ配體經(jīng)鑒定與MHC限制無關(guān)，但 在 ΡΒ 中是罕見的（Τ 細(xì)胞的 1%-5%) (Bonneville 等，2010 ;Kabelitz 等，2007 ;Xu 等，2011)。
[0007] 人類γδΤ細(xì)胞展現(xiàn)固有的溶解腫瘤細(xì)胞的能力并且有希望用于免疫治療。因此， 在癌細(xì)胞上存在許多TCRy δ配體，從而增加以下可能性:維持γ δΤΟ?的多克隆譜型的擴(kuò)增 方法對(duì)人類應(yīng)用來說具有吸引力。V γ 9νδ2Τ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)在癌癥的研究性治療中產(chǎn) 生目標(biāo)臨床反應(yīng)，但是尚未進(jìn)行非V γ 9νδ2Τ細(xì)胞的施用（Kondo等，2008 ; Lang等，2011; Nagamine等，2009 ;Nicol等，2011 ;Wilhelm等，2003)。在單倍體相合αβΤ細(xì)胞耗盡的造血干 細(xì)胞移植(HSCT)的受體之中，白血病的長期緩解與增加的源自供體的νδ 1Τ細(xì)胞的植入頻率 有關(guān)(Godder等，2007 ; Lamb等，1999; Lamb等，1996; Lamb等，2001)。迄今沒有報(bào)告描述νδ lnegVS2neg Τ細(xì)胞的治療效果，并且尚未將這個(gè)亞群與表達(dá)νδ?和VS2TCR的Τ細(xì)胞直接比較。 因此，在非νγ9νδ2譜系的認(rèn)識(shí)與人類應(yīng)用之間存在顯著差距。
[0008] 氨基二膦酸鹽(例如唑來膦酸(Zol)已被用于增殖用于臨床用途的Τ細(xì)胞的νγ9νδ 2亞群（Stresing等，2007; Thompson等,2010)。其他γ δΤ細(xì)胞譜系不是通過氨基二膦酸鹽增 殖。盡管如此，已經(jīng)使用V γ 9νδ2 γ δΤ細(xì)胞作為癌癥免疫療法的臨床試驗(yàn)已顯示一些目標(biāo)反 應(yīng)，但作為單一療法沒有療效(Nicol等，2011;Wilhelm等，2003)。板結(jié)合抗體和細(xì)胞因子混 合物已經(jīng)被用于增殖更多樣化的誕T細(xì)胞，但是⑴其未實(shí)現(xiàn)一致的仰1和VSl negVS2neg頻率， (ii) γ δΤ細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目不是臨床相關(guān)的（<108個(gè)細(xì)胞），（iii)其未全面分析V γ頻率，并 且（iv)它們不是臨床可直接轉(zhuǎn)化的，因?yàn)檫@些試劑不是全部以優(yōu)良制造規(guī)范(GMP)質(zhì)量可 獲得的(Dokouhaki等，2010;Kang等，2009;Lopez等，2000)。因此，極大地需要離體擴(kuò)增γ δΤ 細(xì)胞的臨床相關(guān)方法和由此產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本文所提供的是一種擴(kuò)大具有抗腫瘤、抗病毒以及抗細(xì)菌活性的多克隆γ δΤ細(xì)胞 的臨床相關(guān)量的方法。γ st細(xì)胞可以靶向多種腫瘤，包括實(shí)體瘤以及其他病狀，諸如病毒和 細(xì)菌感染。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種包含至少約1〇9個(gè)經(jīng)純化的γ δΤ細(xì)胞的細(xì)胞組合物。 細(xì)胞組合物可包含至少約?〇9、?〇1<3、?〇 η個(gè)或更多個(gè)經(jīng)純化的γδτ細(xì)胞。在一個(gè)方面中，經(jīng)純 化的γ δΤ細(xì)胞可以屬于νδ1、νδ2以及VSlnegVS2neg TCR亞群。在一個(gè)方面中，經(jīng)純化的γ δΤ細(xì) 胞可表達(dá)￥61、￥52、￥53、￥55、￥57或￥581'〇?鏈與￥丫2、￥丫3、￥丫7、￥丫8、￥丫9、￥丫10或￥丫 11TCR鏈的任何組合。在一個(gè)方面中，經(jīng)純化的γ δΤ細(xì)胞可以具有基本上相同的遺傳物質(zhì)。 在一個(gè)方面中，經(jīng)純化的γ δΤ細(xì)胞可以不含嵌合抗原受體。
[0012] 在一個(gè)方面中，細(xì)胞組合物可以不含ΝΚ細(xì)胞或αβτ細(xì)胞。在一個(gè)方面中，γδτ細(xì)胞 可表達(dá)CD3。在其他方面中，γ δΤ細(xì)胞可表達(dá)或共表達(dá)CD38、CD95、CD25、CD27、CD28、CD45S CCR7。在一個(gè)方面中，γ δΤ細(xì)胞可能不表達(dá)CXCR4、CCR4、CLA、CD4、CD8、CD 122、CD 127、CD56、 CD57或PD-1。
[0013] 在各個(gè)方面中，本發(fā)明實(shí)施方案的γδΤ細(xì)胞可以被基因編輯，以提高治療潛力。這 種基因編輯可以本領(lǐng)域中已知的任何手段，諸如通過使用人工核酸酶來進(jìn)行。這種基因編 輯可以通過表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)或Τ細(xì)胞受體(TCR)來使γ δΤ細(xì)胞的特異性再定向。這 種基因編輯可以通過改良?xì)w巢、細(xì)胞因子產(chǎn)生、再循環(huán)殺傷以及/或者改良的植入來改良γ δΤ細(xì)胞的效力。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種包含本實(shí)施方案的細(xì)胞組合物和藥學(xué)上可接受的載 劑的藥物組合物。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備本實(shí)施方案的細(xì)胞組合物的方法。該方法可包 括獲得包含第一多克隆γδτ細(xì)胞群的細(xì)胞樣品；以及在白介素-2(IL-2)和白介素-21(IL-21)存在下將第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC) -起培養(yǎng)。在一些方面中， 培養(yǎng)可離體進(jìn)行有限的時(shí)間段來擴(kuò)增T細(xì)胞群。在一個(gè)方面中，培養(yǎng)步驟可以還包括在氨基 二膦酸鹽(例如唑來膦酸)存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0016] 在一個(gè)方面中，細(xì)胞樣品可為外周血樣品或臍帶血樣品。在另一個(gè)方面中，細(xì)胞樣 品可獲自組織。在另一個(gè)方面中，細(xì)胞樣品可獲自單一受試者。受試者可為供體或患者。在 一些方面中，可以將從單一供體產(chǎn)生的γ訂細(xì)胞輸注至一個(gè)或多個(gè)同種異體受體中。在一 個(gè)方面中，γ δτ細(xì)胞可為人類γ δτ細(xì)胞。
[0017] 在一些方面中，培養(yǎng)之前的初始γ δτ細(xì)胞群的純化可包括諸如用順磁珠粒選擇或 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的分離/富集。此類選擇可包括耗盡表達(dá)CD56的細(xì)胞和表達(dá)τα?αβ的細(xì)胞的 樣品。γ ST細(xì)胞的純度可為基于在對(duì)一種或多種γ δτα?具特異性的單克隆抗體情況下的染 色的TCR的存在。
[0018] 在一個(gè)方面中，aAPC可為轉(zhuǎn)基因 Κ562細(xì)胞。在一個(gè)方面中，aAPC可表達(dá)⑶137L。在 其他方面中，aAPC可能另外表達(dá)CD19、CD64、CD86或mIL15。在某些方面中，aAPC可表達(dá)至少 一種抗⑶3抗體克隆，諸如0KT3和/或UCHT1。在一個(gè)方面中，aAPC可以是經(jīng)過滅活的（例如經(jīng) 過照射的）。在一個(gè)方面中，aAPC可能已經(jīng)過測(cè)試并且證實(shí)不具有感染性物質(zhì)。用于產(chǎn)生此 類aAPC的方法是本領(lǐng)域中已知的。
[0019] 在一個(gè)方面中，第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群可包含約104至約ΙΟ6 γ δτ細(xì)胞。在一個(gè)方面 中，將第一多克隆γ ST細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)可包括以約10:1至約1:10;約3:1至約1:5;約 1:1至約1: 3 ( γ δT細(xì)胞比aAPC)的比率培養(yǎng)所述細(xì)胞;或其中可以得到的任何范圍。舉例來 說，T細(xì)胞與aAPC共培養(yǎng)可以按約1:1、約1:2或約1:3的比率進(jìn)行。
[0020] 在一個(gè)方面中，可以每周補(bǔ)充培養(yǎng)物中的aAPC。在一個(gè)方面中，將第一多克隆γ δτ 細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)可包括培養(yǎng)至少兩周。在一個(gè)方面中，將第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與 aAPC-起培養(yǎng)可以至少使得多克隆γ δΤ細(xì)胞的數(shù)目增加100倍。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備本實(shí)施方案的細(xì)胞組合物的方法。該方法可包 括獲得包含第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群的細(xì)胞樣品；以及在至少一種抗CD3抗體克隆(諸如0ΚΤ3 和/或UCHT1)存在下并且另外在白介素-2(IL-2)和白介素-21(IL-21)存在下培養(yǎng)第一多克 隆γ對(duì)細(xì)胞群。在一些方面中，抗CD3抗體克隆可表達(dá)于aAPC的表面。在其他方面中，抗⑶3 抗體克隆可以處于微珠的表面。
[0022] 在一些方面中，培養(yǎng)可離體進(jìn)行有限的時(shí)間段來擴(kuò)增T細(xì)胞群。在一個(gè)方面中，培 養(yǎng)步驟可以還包括在氨基二膦酸鹽(例如唑來膦酸)存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0023] 在一個(gè)方面中，細(xì)胞樣品可為外周血樣品或臍帶血樣品。在另一個(gè)方面中，細(xì)胞樣 品可獲自單一受試者。受試者可為供體或患者。在一個(gè)方面中，γ ST細(xì)胞可為人類γ δΤ細(xì) 胞。在一些方面中，γδτ細(xì)胞可以源自于干細(xì)胞，諸如胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多 能干細(xì)胞。
[0024] 在一些方面中，培養(yǎng)之前的初始γ δτ細(xì)胞群的純化可包括順磁珠粒選擇或流式細(xì) 胞術(shù)。此類選擇可包括耗盡表達(dá)⑶56的細(xì)胞和表達(dá)τα?αβ的細(xì)胞的樣品。γ δτ細(xì)胞的純度可 為基于存在在對(duì)γ STCR具特異性的單克隆抗體存在下染色的TCR并且不存在關(guān)于αβτα?的 染色。
[0025] 在一個(gè)方面中，將第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)可包括培養(yǎng)至少兩周。 在一個(gè)方面中，培養(yǎng)第一多克隆γ δτ細(xì)胞群可以至少使得多克隆γ δτ細(xì)胞的數(shù)目增加100 倍。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種治療患者的疾病的方法，其包括施用有效量的本實(shí) 施方案的細(xì)胞組合物或藥物組合物。在一個(gè)方面中，患者可為人類患者。
[0027] 在一個(gè)方面中，疾病可為癌癥。在某些方面中，癌癥可為血液或?qū)嶓w癌癥，諸如Τ細(xì) 胞八1^』411^1^、結(jié)腸癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面中，患者可 能已經(jīng)歷先前的抗癌治療。在一個(gè)方面中，患者可以處于緩解期。在另一個(gè)方面中，患者可 以不具有癌癥癥狀但包含可檢測(cè)的癌細(xì)胞。
[0028] 在另一個(gè)方面中，疾病可為病毒感染(例如巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus，EBV)或人類免疫缺陷病毒(HIV))。在另一個(gè)方面中，疾病可為細(xì)菌 感染。在一個(gè)方面中，疾病可為敗血癥。
[0029] 在一個(gè)方面中，細(xì)胞組合物對(duì)于患者可為同種異體的。在各個(gè)方面中，同種異體細(xì) 胞組合物可能或可能不與患者共同擁有HLA。在另一個(gè)方面中，細(xì)胞組合物對(duì)于患者可為自 體同源的。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種治療患者的疾病的方法，其包括根據(jù)本實(shí)施方案的 方法制備細(xì)胞組合物并且向有需要的患者施用有效量的細(xì)胞組合物。
[0031] 在一些方面中，提供用于治療具有醫(yī)學(xué)病狀的個(gè)體的方法，其包括以下步驟:提供 有效量的來自本文所描述的細(xì)胞群體的細(xì)胞，其在一些方面中包括超過一次，諸如隔至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本實(shí)施方案的細(xì)胞群體或藥物組合物的組合物以用 于治療患者的疾病。疾病可為癌癥(例如T細(xì)胞41^、841^1^、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌等）、 病毒感染(例如巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)或人類免疫缺陷病毒(HIV))或 細(xì)菌感染(例如敗血癥）。在一個(gè)方面中，細(xì)胞組合物對(duì)于患者可為同種異體的。在另一個(gè)方 面中，細(xì)胞組合物對(duì)于患者可為自體同源的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供本實(shí)施方案的細(xì)胞 群在制造用于治療疾病的藥劑中的用途。
[0033]本發(fā)明的方法和/或組合物的上下文中所討論的實(shí)施方案可以用于本文描述的任 何其他方法或組合物。因此，另外，與一種方法或組合物有關(guān)的實(shí)施方案同樣可以適用于本 發(fā)明的其他方法和組合物。
[0034] 如本說明書在此所用，"一個(gè)(種）（a/an)"可以指一個(gè)(種)或多個(gè)(種）。如本文在 權(quán)利要求書中所用，當(dāng)結(jié)合詞語"包含"使用時(shí)，詞語"一個(gè)(種）（a/an)"可以指一個(gè)(種)或 超過一個(gè)(種）。
[0035] 除非明確指出僅指替代物或替代物是相互排斥的，在權(quán)利要求書中使用術(shù)語"或" 是用于指"和/或"，不過本公開支持僅指替代物的定義以及"和/或"。如本文所用的"另一個(gè) (種)"可以指至少第二個(gè)(種)或更多個(gè)(種）。
[0036] 在本申請(qǐng)通篇中，術(shù)語"約"用于指示數(shù)值包括裝置、用于確定該值的方法的固有 誤差變化或研究受試者中存在的變化。
[0037] 本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征以及優(yōu)點(diǎn)通過以下詳細(xì)描述將變得顯而易見。然而，應(yīng)了 解，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例在指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)僅通過說明方式給出，因?yàn)橛?該詳細(xì)描述在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯 而易見。
[0038] 附圖簡(jiǎn)述
[0039] 以下圖式形成本說明書的一部分，并且被包括以進(jìn)一步展示本發(fā)明的某些方面。 通過結(jié)合對(duì)本文所呈現(xiàn)的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述參考這些圖式中的一個(gè)或多個(gè)可以更 好地理解本發(fā)明。
[0040] 圖1A至圖1G.源自1?的γδτ細(xì)胞以混合（多克?。┤后w的形式在IL-2和IL-21存在 下基于γ經(jīng)過γ照射的aAPC的持續(xù)增殖。（Α)在aAPC和細(xì)胞因子共培養(yǎng)之前(第0天)和之后 (第22天)的γδΤ細(xì)胞的頻率。顯示來自四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的七個(gè)代表性供體中的一個(gè)。(B)在共 培養(yǎng)第22天⑶3、⑶56、ΤΟ?αβ以及ΤΟ?γδ的表達(dá)。顯示來自4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的七個(gè)代表性供體 中的一個(gè)。（C)所推測(cè)的多克隆γδΤ細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中三個(gè)箭頭表示添加 aAPC。黑線是 由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±30(11 = 4)，而每個(gè)灰線是單個(gè)的供體。（D) γ δΤ細(xì)胞與IL-2 和IL-21以及表達(dá)膜結(jié)合IL-15(mIL15)、CD86以及/或者CD137L的aAPC共培養(yǎng)九天后增加的 倍數(shù)。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±SD(n = 3)并且每個(gè)形狀代表單個(gè)的供體。使 用雙向AN0VA加邦費(fèi)羅尼后檢驗(yàn)(Bonferroni ' s post-test)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*ρ〈0.05; **p 〈0.01。（E)在可溶性重組IL-2和/或IL-21存在下γ δΤ細(xì)胞與aAPC(克隆Μ)共培養(yǎng)9天后增 加的倍數(shù)。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±SD(n = 3)，其中每個(gè)形狀代表單個(gè)的供 體。使用雙向ANOVA加邦費(fèi)羅尼后檢驗(yàn)(Bonferroni ' s post-test)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*p〈 0.05。$)1'0^1和!'0^2鏈在基于&4?(：克隆#4和細(xì)胞因子進(jìn)行數(shù)目擴(kuò)增達(dá)22天的丫3!'細(xì)胞 上的代表性表達(dá)。展示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的四個(gè)代表性供體中的一個(gè)。（6)τα?δΓτα?δ2 ηθ?；、 τα?δ1ηθ?；τα?δ2+以及TCI^regTCI^2neg鏈在aAPC(克隆Μ)和細(xì)胞因子增殖22天的多克隆γ δτ 細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)的頻率。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值土SD(n = 4)并且每個(gè) 形狀代表單個(gè)的供體。
[0041]圖2.為與γδτ細(xì)胞共培養(yǎng)以揭示所引入的共刺激分子的影響而開發(fā)的aAPC。將 K562細(xì)胞用睡美人(Sleeping Beauty，SB)轉(zhuǎn)座酶和表達(dá)膜結(jié)合IL-15(mIL15)的變體的SB 轉(zhuǎn)座子電穿孔，其中IL-15細(xì)胞因子/肽融合至IL-15受體-α。將基因修飾過的細(xì)胞通過FACS 進(jìn)行單細(xì)胞分選以產(chǎn)生aAPC克隆A6。注意，aAPC克隆A6使用與aAPC克隆#4不同的mIL15變 體。然后，將克隆A6用SB轉(zhuǎn)座酶和含有⑶86或⑶137L的SB轉(zhuǎn)座子電穿孔，并且將基因修飾過 的細(xì)胞通過FACS進(jìn)行單細(xì)胞分選以產(chǎn)生aAPC克隆A3和D4。示出了aAPC的細(xì)胞表面免疫表 型，其中前向散射展示在X軸上，而mIL15、⑶86以及⑶137L分別展示在頂部、中部以及底部 的y軸上。
[0042] 圖3A至圖3D.源自UCB的γ δΤ細(xì)胞基于aAPC的擴(kuò)增。γ δΤ細(xì)胞是基于在CD3和TCRy S情況下的染色通過FACS進(jìn)行分選，并且在可溶性重組IL-2和IL-21存在下每周用aAPC克 隆#4進(jìn)行刺激。(A)由共培養(yǎng)物推斷的總細(xì)胞數(shù)目，其中黑線代表由四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平 均值土SD(n = 5)，而灰線是單個(gè)的供體。箭頭表示添加 γ經(jīng)過γ照射的aAPC。基于aAPC加 IL-2和IL-21擴(kuò)增五周之后根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)的代表性供體(來自四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的5個(gè)中的1 個(gè)）的（B)CD3(y軸)和 ΤΟ?γδ(χ軸）、（C)TCRa0(y 軸）和ΤΟ?γδ(χ軸）以及(D)CD3(y 軸）和CD56 (X軸)的表達(dá)。象限的頻率展示在右上角。
[0043] 圖4A至圖4D.基于aAPC增殖和活化的γδΤ細(xì)胞中的νδ和VymRNA的豐度。在基于 aAPC/!L-2/IL-21共培養(yǎng)的第22天，根據(jù)DTEA對(duì)源自PBMC的γ δΤ細(xì)胞中的編碼(Α)νδ和(B)V γ等位基因的mRNA種類的定量。如關(guān)于TOMC所描述，在基于aAPC/IL-2/IL-21共培養(yǎng)的第 34-35天，根據(jù)DTEA對(duì)源自UCB的γ δΤ細(xì)胞中的編碼(〇νδ和(D)V γ等位基因的mRNA種類的 定量。盒須圖展示25%和75%百分位數(shù)，其中直線從上到下代表最大值、平均值以及最小值 (n = 4)。圖底部的實(shí)線代表由DTEA陰性對(duì)照的平均值±2xSD計(jì)算的檢測(cè)限(L0D)。相對(duì)于樣 品L0D對(duì)每個(gè)等位基因進(jìn)行學(xué)生配對(duì)單尾t檢驗(yàn)。*p〈0.05，并且**p〈0.01 [0044] 圖5.TCRS1和ΤΟ?δ2鏈在源自于UCB并且基于aAPC增殖的γ δΤ細(xì)胞上的表面表達(dá)。 在IL-2和IL-21存在下在基于aAPC克隆#4共培養(yǎng)35天后，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)TCRS2(y軸)和TCR δ1(χ軸)在源自UCB的γδΤ細(xì)胞上的表達(dá)。象限頻率(百分比）展示在右上角。在四個(gè)獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)中將Τ細(xì)胞進(jìn)行增殖。
[0045] 圖6Α至圖6F.源自1?的νδΤ細(xì)胞亞群以分開的群體的形式在IL-2和IL-21存在下基 于γ經(jīng)過γ照射的aAPC的持續(xù)增殖。在用aAPC(克隆#4)和細(xì)胞因子進(jìn)行兩次7天刺激之后， 基于T細(xì)胞的染色，通過FACS將γδΤ細(xì)胞的混合群體分離成νδ1、νδ2以及VSl negVS2neg亞群， 其分別定義為!'0^1+!'0^211'1'0^1 1^1'0^2+以及1'0^嚴(yán)吖0^211'(4)在基于34?(：和細(xì)胞 因子以分離的群組的形式進(jìn)行數(shù)目擴(kuò)增15天之后，Torn和τα?δ2鏈在νδ?、νδ2以及νδ? η，δ 2neg亞群的γ δτ細(xì)胞上的表達(dá)(從左到右）。顯示由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯集的四個(gè)代表性供體中 的一個(gè)。流式點(diǎn)圖中的象限頻率(百分比）展示在右上角。（Β)在基于aAPC和細(xì)胞因子以分離 的群組的形式進(jìn)行數(shù)目擴(kuò)增15天之后，τα?δ l+TCI^2neg(空白柱）、τα?δ lnegTCRS2+(黑色柱）以 及τα?δ lnegTCRS2neg(灰色柱)在γ δτ細(xì)胞的亞群中的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的頻率。數(shù)據(jù)是由兩 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值土 30(11 = 4)。（〇展示了在細(xì)胞因子存在下用aAPC克隆#4刺激兩 次(箭頭）的每個(gè)分離的νδ亞群的增殖以及總細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均 值土 SDbiOJD-F)使用直接TCR表達(dá)陣列(DTEA)來確定和測(cè)量在基于aAPC和細(xì)胞因子以 分開的亞群的形式增殖15天之后，在ΥδΤ細(xì)胞亞群中編碼(?)νδ1*01、（Ε)νδ2*02以及(F)VS 3*01的mRNA種類的豐度。盒須圖展示25%和75%百分位數(shù)，其中直線從上到下代表最大值、 平均值以及最小值(n = 4)。對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行學(xué)生配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)。**p〈0.01，并且***p〈 0.001
[0046] 圖7A至圖7E.共同擁有的Va/νδ等位基因在基于aAPC、IL_2以及IL-21分離并且擴(kuò) 增的γ δΤ細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。根據(jù)DTEA，共同擁有的νδ和Va等位基因在νδ 1、νδ2以及νδ 1 negV S2neg群體在IL-2和IL-21存在下基于aAPC克隆#4共培養(yǎng)15天之后的表達(dá)。（Α)νδ4(να14)、 (Β)νδ5(να29)、（〇νδ6(να23)、（?)νδ7(να36)以及(Ε)νδ8(να38_2)在每個(gè)分開的亞群中的 檢測(cè)結(jié)果。盒須圖展示25%和75%百分位數(shù)，其中直線從上到下代表最大值、平均值以及最 小值(η = 4)。對(duì)于群體間的統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行學(xué)生配對(duì)雙向t檢驗(yàn)。
[0047] 圖8A至圖80.在γδΤ細(xì)胞亞群中編碼νγ鏈的mRNA種類的豐度。將來自1?的多克隆 γδτ細(xì)胞在IL-2和IL-21存在下用aAPC克隆#4刺激兩次，并且然后FACS分離成τα?δ1+τα?δ 2neg、TCRSlnegTCI^2+以及TCRSlnegTCI^2 neg亞群。然后，將這些亞群以分離的亞群的形式在 IL-2和IL-21存在下用aAPC克隆#4再刺激兩次。使用DTEA來確定和定量編碼(A)Vy 1*01、 (Β)νγ 2*02、（C)Vy 3*01、（D)Vy 5*01、（Ε)νγ 6*01、（F)Vy 7*01、（G)Vy8*01M、（Η)νγ 8* 01X、（I )V γ 9*01、（J)V γ 9*02、（Κ)νγ 10*01、（L)Vy 11*01、（Μ)νγ 11*02、（Ν)νγΑ*01 以及 (0)νγΒ*01的mRNA。盒須圖展示25%和75%百分位數(shù)，其中直線從上到下代表最大值、平均 值以及最小值(n = 4)。對(duì)νδ分選群體之間的每個(gè)等位基因進(jìn)行學(xué)生配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)。*p〈 0.05，并且**?〈0.01
[0048] 圖9A至圖9B.基于aAPC加 IL-2和IL-21增殖的多克隆γ δΤ細(xì)胞的免疫表型。在培養(yǎng) 的第22天，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)源自PBMC的多克隆γ δΤ細(xì)胞的表面標(biāo)記物的(Α)設(shè)門（顯示來 自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的四個(gè)供體中的一個(gè)代表)和其(Β)頻率。直線展示由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的 平均值±SD(n = 4)，其中每個(gè)符號(hào)代表單個(gè)的供體。
[0049] 圖10A至圖10H.基于aAPC、IL_2以及IL-21增殖的νδΤ細(xì)胞亞群的免疫表型。νδ1、νδ 2以及VSlnegVS2neg亞群是在以分開的群體的形式增殖15天之后進(jìn)行分析。（A)CD3(x軸）和 TCR γ δ (y軸)在νδ 1、νδ2以及νδ 1 negVS2neg亞群中的表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖（從左到右）。（B) 在νδ? (紅色）、νδ2(黑色）以及VSlnegVS2neg(藍(lán)色)T細(xì)胞亞群中TCR γ δ染色的平均熒光強(qiáng)度 (MFI)，其中每個(gè)形狀代表不同的供體，并且數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±50(11 = 4)。（〇0)4&軸)和CD8(y軸)在νδ1、νδ2以及VSlnegVS2neg亞群上的表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù) 點(diǎn)圖（從左到右），以及(D)在νδ? (紅色）、νδ2(黑色）以及VSlnegVS2neg(藍(lán)色)T細(xì)胞中的頻率 匯總，其中數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±30(11 = 3)，并且每個(gè)形狀代表不同的供 體。（E)CCR7(x軸)和CD62L(y軸）、（F)CD28(x軸)和CD27(y軸）以及(G)CD45RA(x軸)和CD27(y 軸)在νδ1、νδ2以及VSlnegVS2neg亞群中的表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖（從左到右）。（!〇基于如部 分(G)中所示的CD27和CD45RA的表達(dá)對(duì)γδΤ細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行的分配。每個(gè)形狀代表不 同的供體并且數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值±30(11 = 3)。所有流式點(diǎn)圖均代表來自 兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的四個(gè)正常供體。流式點(diǎn)圖的象限頻率(百分比）展示在右上角。
[0050] 圖11A至圖11D.由多克隆γ δΤ細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子。在基于γ經(jīng)過γ 照射的aAPC克隆#4加 IL-2和IL-21共培養(yǎng)的第22天，將Τ細(xì)胞與CM(mock)或白細(xì)胞活化混合 物(LAC;PMA/離子霉素)一起在37°C下孵育6h。使用27-Plex Luminex陣列組織查詢培養(yǎng)上 清液，以檢測(cè)(A)TH2細(xì)胞因子、（B)TH17細(xì)胞因子、（C)T H1細(xì)胞因子以及(D)趨化因子的存在。 數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的四個(gè)供體匯總的平均值±30,其中在多重分析之前將每個(gè)供體 的三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔匯集起來。對(duì)于各細(xì)胞因子或趨化因子的mock和LAC組之間的統(tǒng)計(jì)分析， 進(jìn)行學(xué)生 t 檢驗(yàn)。*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，并且· 001
[0051 ] 圖12A至圖12F.響應(yīng)于腫瘤細(xì)胞的IFN γ分泌對(duì)TCR γ δ的依賴性。在6小時(shí)的腫瘤 細(xì)胞與匪S(陰性對(duì)照）或中和TCR γ δ抗體(aTCR γ δ;克隆頂)共培養(yǎng)之前和期間，將多克隆 γδτ細(xì)胞孵育1小時(shí)。將細(xì)胞針對(duì)ΤΟ?δ1、τα?δ2、⑶3以及IFNy進(jìn)行染色，以對(duì)Τ細(xì)胞亞群進(jìn) 行設(shè)門并且評(píng)估IFNy產(chǎn)量。設(shè)門策略是(A)在活化T細(xì)胞門中分離前向和側(cè)向散射(分別是 FSC和SSC)，（B)在T細(xì)胞門中分離CD3+T細(xì)胞與污染性腫瘤細(xì)胞，并且(C)分別基于以下各項(xiàng) 分離成 νδ1、νδ2 以及 VSlnegVS2neg 亞群：τα?δ1+τα?δ2η'τα?δ1η?τα?δ2+&&τα?δ1 ηθ?；τα?δ 2η(^(?)詳細(xì)描述νδ1、νδ2以及νδ1ηΜνδ2 ηθ?；門（從左到右）的直方圖的比較，這些門是與 CA0V3卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)并且用匪S(空白）或ατα^γδ(陰影)處理的。直方圖旁邊的數(shù)字是 MFI。流式點(diǎn)圖代表在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中與CA0V3細(xì)胞共培養(yǎng)的三個(gè)ΡΒ供體中的一個(gè)。每個(gè)νδΤ 細(xì)胞亞群響應(yīng)于(E)CA0V3和(F)0C314細(xì)胞的IFNy分泌抑制百分比是基于以下等式來計(jì) 算：抑制（％ ) = 100-100x[ (MFI麵+獅rMFI僅御S)crTCRy s/ (MFI|_+刺rMFI僅刺6)NMS]。數(shù)據(jù)是由兩 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的平均值土 SD(η = 3)。
[0052]圖13Α至圖13G.多克隆γ δΤ細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系組的特異性溶解。針對(duì)以下細(xì)胞以 增加的效應(yīng)細(xì)胞(多克隆γ δΤ細(xì)胞)與靶細(xì)胞(Ε:Τ)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA: (Α)來自同種異 體供體（四個(gè)代表性供體中的一個(gè))的B細(xì)胞，（B)B-ALL細(xì)胞系:RCH-ACV，（C)T-ALL細(xì)胞系： Jurkat，（D)CML細(xì)胞系:K562，（E)胰腺癌細(xì)胞系:BxPc-3，（F)結(jié)腸癌細(xì)胞系:HCT-116，以及 (G)卵巢癌細(xì)胞系:0C314和CA0V3。每條線代表效應(yīng)多克隆γδΤ細(xì)胞的單個(gè)的PB供體，其中 數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±30(11 =每次分析3個(gè)孔）。
[0053]圖14Α至圖14G.多克隆γ δΤ細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系組的體外溶解。針對(duì)以下細(xì)胞以增 加的效應(yīng)細(xì)胞（多克隆γ δΤ細(xì)胞)與靶細(xì)胞(Ε:Τ)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA: (Α)自體同源Β細(xì) 胞，（B)同種異體B細(xì)胞(4個(gè)供體中的1個(gè)），（C)B-ALL細(xì)胞系:cALL-2，（D)未分化的白血病細(xì) 胞系：Kasumi-3，（E)源自K562的aAPC克隆#4，（F)胰腺癌細(xì)胞系：CaPan-2、MiaPaCa-2以及 Su8686,以及（G)卵巢癌細(xì)胞系：A2780、EF021、EF027、Hey、IGR0Vl、0AW42、0VCAR3&& UPN251。每條線代表單個(gè)的γ δΤ細(xì)胞群(源自于PB供體），并且溶解是以由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯 總的平均值土SD(n =每次分析3個(gè)孔)的形式呈現(xiàn)。
[0054]圖15A至圖15D.VST細(xì)胞亞群對(duì)血液和實(shí)體腫瘤細(xì)胞的特異性溶解。靶向（A) Jurkat、（B)K562、（C)0C314以及(D)CA0V3癌細(xì)胞系的νδ? (圓圈）、νδ2(方形）以及νδ1ηθ??νδ 2neg(三角形）γδΤ細(xì)胞亞群效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的并且 是由在CRA中的三次重復(fù)測(cè)量平均得到的供體的平均值± SD(n = 4)。
[0055] 圖16A至圖16B.由γδΤ細(xì)胞亞群產(chǎn)生的長期殺傷潛力。將(A)CA0V3和(B)UPN251卵 巢腫瘤細(xì)胞接種于6孔板中，并且孵育過夜以形成粘附。然后，將來自νδ1、νδ2或VSlneM2neg 亞群的T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)兩天。將剩余的粘附細(xì)胞從孔中酶促移除并且對(duì)活細(xì)胞進(jìn) 行計(jì)數(shù)。不存在T細(xì)胞情況下的腫瘤細(xì)胞充當(dāng)陽性對(duì)照，而不存在腫瘤細(xì)胞情況下的T細(xì)胞 充當(dāng)陰性對(duì)照。殺傷率（％ )=(活細(xì)胞)共t諾/(活細(xì)胞)側(cè)愉X 100。數(shù)據(jù)是由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯 總的平均值土 SD(n = 3)。
[0056] 圖17A至圖17C.對(duì)由多克隆γ δΤ細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤溶解的抑制。（A)在IL-2和IL-21 存在下增殖22天之后，CD3、DNAM1以及NKG2D在基于aAPC克隆#4來自1?的多克隆γ δΤ細(xì)胞上 的代表性表達(dá).展示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的四個(gè)供體中的一個(gè)。流式點(diǎn)圖的象限頻率展示在 各點(diǎn)圖的右上角。累積頻率（百分比）以平均值土SD(n = 4)的形式展示，其中每個(gè)形狀表示 不同的供體。（B)在標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA中在12:1的E: T比率下，使用針對(duì)NKG2D、DNAM1、TCR γ δ (克 隆Β1)以及ΤΟ?γδ(克隆頂)的中和抗體來阻止殺死Jurkat(左)或0C314(右)腫瘤靶標(biāo)。將抗 體與T細(xì)胞一起預(yù)孵育lh，并且在CRA期間以3yg/mL進(jìn)行孵育。匪S充當(dāng)抗體添加的對(duì)照，并 且出于標(biāo)準(zhǔn)化目的使用不具有抗體的孔。將特異性溶解標(biāo)準(zhǔn)化為不具有抗體的孔以產(chǎn)生如 下定義的相對(duì)細(xì)胞溶解：相對(duì)細(xì)胞溶解（％ )=(特異性溶解體/(特異性溶解)不體X 100。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯總的三次重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化CRA測(cè)量的平均值±SD(n = 4個(gè)供體）。 使用雙向AN0VA加邦費(fèi)羅尼后檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*p〈0 · 05，#p〈0 · 01以及*#p〈0 · 001 (C) 在存在0.3、1以及3yg/mL抗體的情況下，由NMS(圓圈）、TCR γ δ頂抗體(方形)或匯集的(三角 形)抗體(對(duì)DNAM1、NKG2D、TCR γ δ(B1)以及TCR γ δ(頂））具有特異性)產(chǎn)生的對(duì)多克隆γ δΤ 細(xì)胞對(duì)Jurkat (左）和0C314 (右)細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用的劑量依賴性抑制。數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú) 立實(shí)驗(yàn)匯總并且標(biāo)準(zhǔn)化的三次重復(fù)的平均值土SD(n = 4個(gè)供體）。
[0057] 圖18A至圖18C.在基于aAPC加 IL-2和IL-21增殖/活化的多克隆γ δΤ細(xì)胞和γ δΤ細(xì) 胞亞群過繼轉(zhuǎn)移之后卵巢癌的體內(nèi)清除。在第8天，將CA0V3-effLuc-mKate腫瘤細(xì)胞(每只 小鼠3X10 6個(gè))腹膜注射至NSG小鼠中，并且進(jìn)行植入，直到第0天當(dāng)用PBS(媒介物/mock)或 丫奵細(xì)胞開始處理時(shí)為止。分別在第0天、第7天、第14天以及第21天以3\10 6、6\106、10\ 1〇6以及15 X106個(gè)細(xì)胞的四種T細(xì)胞劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)施藥。（A)在第0天(上部圖）和第72天 (下部圖），在媒介物、VSl、VS2、VSl negVS2neg以及多克隆γδΤ細(xì)胞處理組中的BLI圖像。圖像 代表來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的6至14只小鼠。（Β)第0天（黑色）和第72天（藍(lán)色）的小鼠的BLI測(cè) 量，其中每個(gè)形狀代表單個(gè)的小鼠，直線是平均值(η = 6-14)，并且數(shù)據(jù)是由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 匯總的。使用學(xué)生配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且展示ρ值。（C)用媒介物（空心方形） 或多克隆γδτ細(xì)胞(實(shí)心方形）處理的小鼠的總存活率。使用吉亨-布萊斯勒-魏克森檢驗(yàn) (Gehan-Breslow-WilcoxonTest)來計(jì)算ρ值。Η=風(fēng)險(xiǎn)比。
[0058] 圖19.用于共表達(dá)增強(qiáng)的螢火蟲熒光素酶（effLuc)和mKate的DNA質(zhì)粒pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A的示意圖。注解為，LTR:長末端重復(fù)序列;HIV cPPT:HIV中央聚嘌 呤區(qū)；B1:Gateway供體位點(diǎn)Bl; effLuc:增強(qiáng)的螢火蟲熒光素酶;T2A: T2A核糖體滑動(dòng)位點(diǎn)； mKate S158A:增強(qiáng)的mKate紅色熒光蛋白；B2:Gateway供體位點(diǎn)B2;HBV PRE:乙型肝炎翻譯 后調(diào)控元件;HIV SIN LTR:HIV自失活長末端重復(fù)序列;ampR:氨芐西林抗性(β-內(nèi)酰胺酶）。 [0059] 圖20.分離和擴(kuò)增γ δΤ細(xì)胞的替代方案。首先，將CD56+NK細(xì)胞和ΤΟ?αβ+αβΤ細(xì)胞首 先使用微珠進(jìn)行萃取。將剩余的細(xì)胞在aAPC存在下進(jìn)行孵育以選擇性促進(jìn)γ δΤ細(xì)胞群的增 殖和擴(kuò)增。
[0060]圖21. γ δτ細(xì)胞的擴(kuò)增。示出了來自新鮮供體PBMC的⑶3+T細(xì)胞（左側(cè)圖），并且與 使用替代分離方案擴(kuò)增之后的細(xì)胞(右側(cè)圖）進(jìn)行比較。
[0061 ]圖22. γ δ和αβτ細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞系10.05的特異性溶解。針對(duì)胰腺癌細(xì)胞系以增 加的效應(yīng)細(xì)胞(多克隆γ對(duì)細(xì)胞)與靶細(xì)胞(Ε:Τ)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA。數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的平均值± SD(η =每次分析3個(gè)孔）。
[0062]說明性實(shí)施方案的描述
[0063] 人類γδτ細(xì)胞具有天然抗腫瘤免疫性，但其在臨床上的效用限于一種譜系(νγ9ν S2)，即使其他γ δΤ細(xì)胞譜系可以識(shí)別并殺死腫瘤。用于γ δΤ細(xì)胞免疫治療的多克隆途徑可 靶向腫瘤表面上的多個(gè)配體并且使治療效果最大化。然而，多克隆γ對(duì)細(xì)胞的臨床相關(guān)擴(kuò) 增尚待實(shí)現(xiàn)。腫瘤表面上的多個(gè)配體的識(shí)別是由表達(dá)于γ ST細(xì)胞表面上的由δ和γ TCR鏈的 異二聚體組成的Τ細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的。此外，γ δτ細(xì)胞TCR識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)限制外部的抗原，這與在MHC背景下識(shí)別抗原的αβΤ細(xì)胞不同。因此，可向不相關(guān)的患 者給予MHC錯(cuò)配的γ δΤ細(xì)胞，并且其充當(dāng)腫瘤反應(yīng)性Τ細(xì)胞的通用來源。因此，可將由一個(gè)供 體產(chǎn)生的γ δΤ細(xì)胞輸注至一個(gè)或更多個(gè)可能或可能不與供體共同擁有HLA的同種異體受體 中。這提供一種"現(xiàn)成"療法，其中丫對(duì)細(xì)胞可以預(yù)先制備并且按需要輸注。
[0064] 表達(dá)由γ和δ鏈的異二聚體組成的Τ細(xì)胞受體(TCR)的Τ細(xì)胞展現(xiàn)殺死惡性腫瘤細(xì) 胞的能力，但尚未實(shí)現(xiàn)直接使用表達(dá)νδ?和νδ3同種型的細(xì)胞或采用多克隆譜型。本發(fā)明人 由Κ562腫瘤細(xì)胞系工程改造得到人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)來將表達(dá)規(guī)定的γ δΤΟ?的人類Τ 細(xì)胞擴(kuò)增至臨床上有吸引力的數(shù)目。增殖的γ δτ細(xì)胞為多克隆的，因?yàn)槠浔磉_(dá)νδ?、νδ2、νδ 3、￥35、￥37以及￥38與￥丫2、￥丫3、￥丫7、￥丫8、￥丫9、￥丫10以及￥丫111'〇?鏈。初始、中心記憶 以及效應(yīng)記憶Τ細(xì)胞的群體分別以VSl、VSl negVS2neg以及VS2TCR鏈的表達(dá)為主。Τ細(xì)胞溶解腫 瘤細(xì)胞的效率遵循分化順序(νδ2>νδ1^νδ2Μ>νδ1)。卵巢癌異種移植物被νδ亞群和多克隆 γ δΤ細(xì)胞顯著地消除，這使所處理小鼠的總存活率顯著增加。
[0065] 本文提供（i)產(chǎn)生多克隆γδΤ細(xì)胞，（ii)以在頻率與細(xì)胞活力兩個(gè)方面均大大優(yōu) 于其他技術(shù)的方式提供νδ?亞群的擴(kuò)增，（iii)產(chǎn)生與使用具有毒性組分的氨基二膦酸鹽的 方法相比具有優(yōu)異活力的νδ2細(xì)胞，以及（iv)成功增殖VSl negVS2neg亞群的方法。這些方法中 所用的aAPC可立即用于臨床用途，因此，簡(jiǎn)化了這項(xiàng)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化。νδ?細(xì)胞尚未被直接 輸注到人類中。VSl negVS2neg亞群具有抗腫瘤免疫性，其現(xiàn)在首次可在人類中進(jìn)行測(cè)試。
[0066] 目前公開的aAPC擴(kuò)增技術(shù)可從有限起始數(shù)量增殖看似無限數(shù)目的多克隆γ δΤ細(xì) 胞，從而排除以下當(dāng)前障礙：（i)循環(huán)γ ST細(xì)胞的有限起始量，（ii)初始γ δΤ細(xì)胞群體朝向 固定克隆型極化，以及（iii)用于其他Τ細(xì)胞類型（即αβΤ細(xì)胞）的擴(kuò)增方案不能維持γδΤ細(xì) 胞增殖。目前公開的技術(shù)具有以下競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)：（i)使用當(dāng)前在臨床GMP設(shè)備中的aAPC，（ii) aAPC能夠?qū)⒍嗫寺ˇ?δΤ細(xì)胞數(shù)目從小量外周血中所存在的起始量擴(kuò)增至臨床相關(guān)數(shù)目（> 1〇9個(gè)細(xì)胞），以及（iii)使用超過具有靶向腫瘤細(xì)胞表面的多個(gè)分子的潛力的一種譜系的 γ ST細(xì)胞以同時(shí)將腫瘤逃避治療的可能性降至最低并且將治療功效最大化。這些多克隆γ ST細(xì)胞能夠殺死所測(cè)試的每一種腫瘤類型(ALL、CML、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌），但對(duì)不相關(guān) 個(gè)體的正常組織(B細(xì)胞)不做出反應(yīng)。因此，可制造一個(gè)具有固定或所要譜型的大的多克隆 γδΤ細(xì)胞庫，并且安全地給予不相關(guān)患者來治療例如癌癥。
[0067] 本發(fā)明產(chǎn)生用于過繼性Τ細(xì)胞治療的細(xì)胞治療產(chǎn)品，并且具有至少四個(gè)潛在用途。 第一，多克隆γ st細(xì)胞可用作可給予不相關(guān)個(gè)體的腫瘤反應(yīng)性τ細(xì)胞的通用來源。這具有商 品化吸引力，因?yàn)棣蛹?xì)胞的通用來源可降低與產(chǎn)生所要治療的每位患者的自體同源τ細(xì)胞相 關(guān)的成本。第二，可進(jìn)一步操縱多克隆γδτ細(xì)胞以增加其腫瘤反應(yīng)性，例如通過引入靶向特 定腫瘤抗原的嵌合抗原受體(CAR)。第三，多克隆γδτ細(xì)胞還具有抗病毒活性（巨細(xì)胞病毒 (CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)以及人類免疫缺陷病毒(HIV))，并且可用作針對(duì)病毒感染 的直接免疫治療和/或防止免疫功能低下患者(例如接受造血干細(xì)胞移植(HSCT)的癌癥患 者)的機(jī)會(huì)性感染。第四，在控制細(xì)菌感染和敗血癥時(shí)可使用具有一組通用的多克隆γ ST細(xì) 胞的移植物。
[0068] I.免疫系統(tǒng)和免疫治療
[0069] 在一些實(shí)施方案中，醫(yī)學(xué)病癥是通過轉(zhuǎn)移引發(fā)免疫反應(yīng)的多克隆γ δτ細(xì)胞群來治 療。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，癌癥或感染是通過轉(zhuǎn)移引發(fā)免疫反應(yīng)的多克隆γ ST細(xì)胞 群來治療。因此，對(duì)免疫反應(yīng)的基本理解是必要的。
[0070] 適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞是一類稱為淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞。Β細(xì)胞和Τ細(xì)胞是淋巴細(xì)胞 的主要類型。Β細(xì)胞和Τ細(xì)胞是源自于相同的多能造血干細(xì)胞，并且是彼此無法區(qū)分的，直到 它們被活化之后。Β細(xì)胞在體液免疫反應(yīng)中起很大的作用，而Τ細(xì)胞密切參與細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫反應(yīng)。它們可通過在其細(xì)胞表面存在稱為Τ細(xì)胞受體(TCR)的特殊受體而與其他淋巴細(xì)胞 類型(諸如Β細(xì)胞和ΝΚ細(xì)胞)區(qū)分開。在幾乎所有其他脊椎動(dòng)物中，Β細(xì)胞和Τ細(xì)胞均由骨髓中 的干細(xì)胞產(chǎn)生。Τ細(xì)胞行進(jìn)到胸腺并且在其中發(fā)育，它們由此得到其名稱。在人類中，淋巴細(xì) 胞庫的約1%至2%每小時(shí)再循環(huán)以優(yōu)化抗原特異性淋巴細(xì)胞在次級(jí)淋巴組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)其特 異性抗原的機(jī)會(huì)。
[0071] Τ淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自骨髓中的造血干細(xì)胞，并且典型地迀移至胸腺以變得成熟。αβτ 細(xì)胞表達(dá)其膜上的獨(dú)特抗原結(jié)合受體(Τ細(xì)胞受體），其僅可識(shí)別在其他細(xì)胞的表面上與主 要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子相關(guān)的抗原。γ δτ細(xì)胞是不同于αβτ細(xì)胞的一個(gè)小的循環(huán)Τ 淋巴細(xì)胞亞群。γ δΤ細(xì)胞能夠識(shí)別可源自于外來微生物或由諸如病毒感染或癌癥等應(yīng)力誘 導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞產(chǎn)物的肽與非肽抗原。不同于αβΤ細(xì)胞，γ δΤ細(xì)胞不具M(jìn)HC限制性。
[0072] 由于γ δτ細(xì)胞缺乏αβτ細(xì)胞的精細(xì)特異性的特性，所以已經(jīng)提出它們代表針對(duì)感 染和腫瘤提供第一線監(jiān)測(cè)功能的更基本的免疫機(jī)制(Boismenu等1997)。若干研究已經(jīng)證明 了 γδΤ細(xì)胞對(duì)各種病毒、細(xì)菌以及寄生蟲的反應(yīng)(Bukowski等，1994;Wallace等，1995;Lang 等，1995;Ell〇S〇等，1996)以及其介導(dǎo)各種來源的腫瘤細(xì)胞的溶解的能力(Zocchi等，1990; Kitayama等，1993;Choudhary等，1995)。這些結(jié)果表明，γδΤ細(xì)胞可在癌癥和感染性疾病的 治療中具有治療潛力。
[0073] II.與實(shí)施方案有關(guān)的方法和組合物
[0074] 在某些方面中，本發(fā)明包括一種制備和/或擴(kuò)增多克隆γ δτ細(xì)胞的方法，其包括將 該細(xì)胞與人工抗原呈遞細(xì)胞一起培養(yǎng)。在某些方面中，γ ST細(xì)胞是原代人類γ δτ細(xì)胞，諸如 源自人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)、用G-CSF刺激后收集到的PBMC、骨髓或臍帶血的γδτ細(xì) 胞。這些細(xì)胞可在與aAPC的共培養(yǎng)物中以混合群體形式離體增殖數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。共培養(yǎng) 可以10 3、104、105、106、107或10 8個(gè)或其中可衍生的任何數(shù)目的丫61'細(xì)胞以及103、104、105、 10 6、107、108或109個(gè)或其中可衍生的任何數(shù)目的aAPC來啟動(dòng)。優(yōu)選的是，共培養(yǎng)是以1比2比 率的γ δτ細(xì)胞與aAPC來啟動(dòng)。
[0075] 丫31'細(xì)胞可通過用11^-2或結(jié)合常見丫鏈的其他細(xì)胞因子（例如11^-7、幾-12、幾-15、IL-21 等）刺激而擴(kuò)增。γδΤ細(xì)胞的擴(kuò)增可用 10、20、30、40、50、60、70、80、90或1001]/11^的 IL-2來刺激;優(yōu)選地，擴(kuò)增是用50U/mL的IL-2來刺激。γδΤ細(xì)胞的擴(kuò)增可用10、20、30、40、 50、60、70、80、90或100即/1^的11^-21來刺激 ;優(yōu)選地，擴(kuò)增是用301^/1^的11^-21來刺激。所 述刺激可每周進(jìn)行1、2、3、4、5、6或7次，優(yōu)選每周3次。在另一方面中，擴(kuò)增的丫31'細(xì)胞可以 冷凍保存。
[0076] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，γδΤ細(xì)胞被遞送給有需要的個(gè)體，諸如可能具有癌 癥可感染的個(gè)體。然后，這些細(xì)胞增強(qiáng)個(gè)體的免疫系統(tǒng)以攻擊相應(yīng)的癌癥、病原性細(xì)胞或病 原體感染細(xì)胞。在一些情況下，為個(gè)體提供一個(gè)或多個(gè)劑量的γ ST細(xì)胞。在為個(gè)體提供兩個(gè) 或更多個(gè)劑量的γ δτ細(xì)胞的情況下，施用之間的持續(xù)時(shí)間應(yīng)足以允許有在個(gè)體中增殖的時(shí) 間，并且在特定實(shí)施方案中，劑量之間的持續(xù)時(shí)間是1、2、3、4、5、6、7天或更多天。γ δτ細(xì)胞 對(duì)于患者可為同種異體或自體同源的。
[0077] 本發(fā)明治療方法適用的腫瘤包括任何惡性細(xì)胞類型，諸如在實(shí)體瘤或血液腫瘤中 發(fā)現(xiàn)的那些。示例性實(shí)體瘤可包括但不限于選自以下的器官的腫瘤:胰腺、結(jié)腸、盲腸、胃、 腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺以及乳房。示例性血液腫瘤包括骨髓 腫瘤、Τ或Β細(xì)胞惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、骨髓瘤等?？梢允褂帽疚奶峁┑姆椒?治療的癌癥的其他實(shí)例包括包括但不限于、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌 瘤以及肺鱗狀細(xì)胞癌瘤）、腹膜癌、胃部或腹部癌癥(包括胃腸癌和胃腸道間質(zhì)癌）、胰腺癌、 子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌瘤、唾液 腺癌瘤、腎癌或腎臟癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、各種類型的頭頸癌以及黑素瘤。
[0078] 所述癌癥具體來說可屬于以下組織學(xué)類型，不過其不限于這些：惡性贅生物；癌 瘤;未分化癌瘤；巨細(xì)胞和梭形細(xì)胞癌瘤;小細(xì)胞癌瘤;乳頭狀癌瘤;鱗狀細(xì)胞癌瘤;淋巴上 皮癌瘤;基底細(xì)胞癌瘤;毛母質(zhì)癌瘤;移行細(xì)胞癌瘤;乳頭狀移行細(xì)胞癌瘤;腺癌瘤;惡性胃 泌素瘤;膽管癌瘤;肝細(xì)胞癌瘤;肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞混合癌瘤;小梁腺癌瘤;腺樣囊性癌瘤； 腺瘤性息肉內(nèi)腺癌瘤;家族性結(jié)腸息肉腺癌瘤;實(shí)體癌瘤;惡性類癌腫瘤;細(xì)支氣管肺泡狀 腺癌瘤;乳頭狀腺癌瘤;嫌色細(xì)胞癌瘤;嗜酸細(xì)胞癌瘤;嗜酸性細(xì)胞腺癌瘤;嗜堿細(xì)胞癌瘤； 透明細(xì)胞腺癌瘤;顆粒細(xì)胞癌瘤;濾泡狀腺癌瘤;乳頭狀和濾泡狀腺癌瘤;非包圍性硬化性 癌瘤；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞癌瘤；內(nèi)膜樣癌瘤;皮膚附屬器癌瘤;大汗腺腺癌瘤;皮脂腺腺癌瘤； 耵聹腺腺癌瘤;粘液表皮樣癌瘤;囊腺癌瘤;乳頭狀囊腺癌瘤;乳頭狀重度囊腺癌瘤;粘液性 囊腺癌瘤;粘液性腺癌瘤;印戒細(xì)胞癌瘤;浸潤性導(dǎo)管癌瘤;髓樣癌瘤;小葉癌瘤;炎性癌瘤； 乳腺佩吉特氏病(paget's disease);腺泡細(xì)胞癌瘤;腺鱗癌瘤;腺癌瘤w/鱗狀化生;惡性胸 腺瘤;惡性卵巢間質(zhì)瘤;惡性卵泡膜細(xì)胞瘤;惡性顆粒細(xì)胞瘤;惡性成睪丸細(xì)胞瘤;塞托利細(xì) 胞(sertoli cell)癌瘤;惡性萊迪希細(xì)胞（leydig cell)瘤;惡性脂質(zhì)細(xì)胞瘤;惡性副神經(jīng) 節(jié)瘤；惡性乳腺外副神經(jīng)節(jié)瘤；嗜鉻細(xì)胞瘤;血管球肉瘤；惡性黑素瘤;無色素性惡性黑素 瘤;淺表擴(kuò)散性黑素瘤;雀斑樣痣惡性黑素瘤;肢端雀斑樣痣黑素瘤;結(jié)節(jié)性黑素瘤;巨大色 素痣中的惡性黑素瘤;上皮樣細(xì)胞黑素瘤；惡性藍(lán)痣；肉瘤;纖維肉瘤；惡性纖維組織細(xì)胞 瘤;粘液肉瘤;脂肪肉瘤;平滑肌肉瘤;橫紋肌肉瘤;胚胎性橫紋肌肉瘤;腺泡狀橫紋肌肉瘤； 間質(zhì)肉瘤；惡性混合瘤；苗勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor);成腎細(xì)胞瘤；成肝細(xì)胞 瘤;癌肉瘤;惡性間葉瘤;惡性布倫納瘤(brenner tumor);惡性葉狀腫瘤;滑膜肉瘤;惡性間 皮瘤;無性細(xì)胞瘤;胚胎癌瘤;惡性畸胎瘤;惡性卵巢甲狀腺腫;絨毛膜癌瘤;惡性中腎瘤;血 管肉瘤;惡性血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤;卡波西肉瘤(kaposi ' s sarcoma);惡性血管外皮細(xì)胞瘤;淋 巴管肉瘤;骨肉瘤;皮質(zhì)旁骨肉瘤;軟骨肉瘤;惡性成軟骨細(xì)胞瘤；間質(zhì)軟骨肉瘤;骨巨細(xì)胞 瘤;尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma);惡性牙源性腫瘤;成釉細(xì)胞牙肉瘤;惡性成釉細(xì)胞瘤； 成釉細(xì)胞纖維肉瘤;惡性松果體瘤;脊索瘤;惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤;室管膜瘤;星形細(xì)胞瘤;原漿 性星形細(xì)胞瘤;纖維性星形細(xì)胞瘤;成星形細(xì)胞瘤;成膠質(zhì)細(xì)胞瘤;少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤;成少突 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤;原始神經(jīng)外胚層腫瘤;小腦肉瘤;成神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤;成神經(jīng)細(xì)胞瘤;成視網(wǎng) 膜細(xì)胞瘤；嗅覺神經(jīng)源性腫瘤；惡性腦膜瘤;神經(jīng)纖維肉瘤；惡性神經(jīng)鞘瘤；惡性顆粒細(xì)胞 瘤;惡性淋巴瘤;霍奇金氏病(hodgkin's disease);霍奇金氏；副肉芽腫；小淋巴細(xì)胞惡性 淋巴瘤;大細(xì)胞彌漫性惡性淋巴瘤;濾泡性惡性淋巴瘤;蕈樣肉芽腫;其他指定的非霍奇金 氏淋巴瘤;B細(xì)胞淋巴瘤;低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞(SL)NHL;中度/ 濾泡性NHL;中度彌漫型NHL;重度成免疫細(xì)胞性NHL;重度成淋巴細(xì)胞性NHL;重度小無裂細(xì) 胞NHL;巨大腫塊NHL;套細(xì)胞淋巴瘤;艾滋病相關(guān)淋巴瘤;華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom' smacroglobulinemia);惡性組織細(xì)胞?。欢喟l(fā)性骨髓瘤;肥大細(xì)胞肉瘤;免疫增殖性小腸 ??；白血病;淋巴性白血病;漿細(xì)胞性白血病;紅白血病;淋巴肉瘤細(xì)胞白血病;髓性白血??； 嗜堿性粒細(xì)胞白血病;嗜酸性粒細(xì)胞白血病;單核細(xì)胞白血病;肥大細(xì)胞白血病;成巨核細(xì) 胞白血?。凰铇尤饬?；毛細(xì)胞白血??；慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL);急性成淋巴細(xì)胞白血病 (ALL);急性髓樣白血病(AML);以及慢性成髓細(xì)胞白血病。
[0079] 在一些方面中，γδτ細(xì)胞是獲自例如臍帶血、外周血、人類胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多 能干細(xì)胞的庫。對(duì)于治療效果來說適合的劑量將是例如優(yōu)選在一系列給藥周期中每個(gè)劑量 至少10 5個(gè)細(xì)胞或在約105與約101°個(gè)細(xì)胞之間。示例性給藥方案由具有升級(jí)劑量的四個(gè)一 周給藥周期組成，在第0天至少以約1〇 5個(gè)細(xì)胞開始，例如在啟動(dòng)患者內(nèi)劑量升級(jí)方案幾周 內(nèi)逐漸增加至約1〇1()個(gè)細(xì)胞的目標(biāo)劑量。合適的施用模式包括靜脈內(nèi)、皮下、腔內(nèi)（例如通過 儲(chǔ)存器接入裝置）、腹膜內(nèi)以及直接注射至腫瘤塊中。
[0080] 本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)或與適用于治療癌癥或感染性疾病的其他充分確定 的藥劑組合使用。不論是單獨(dú)地還是與其他藥劑組合遞送，本發(fā)明的藥物組合物均可經(jīng)由 各種途徑遞送并且到達(dá)哺乳動(dòng)物(特別是人類)體內(nèi)的各個(gè)部位，以實(shí)現(xiàn)特定的效果。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雖然可使用超過一種途徑來進(jìn)行施藥，但特定途徑可提供比另一途 徑更直接并且更有效的反應(yīng)。局部或全身遞送可通過施用來完成，該施用包括將制劑施加 或灌注至體腔中或通過腸胃外引入來進(jìn)行，該腸胃外引入包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肝 內(nèi)、腹膜、皮下或皮內(nèi)施藥。
[0081] 本發(fā)明的組合物可以單位劑型提供，其中每個(gè)劑量單位，例如一次注射含有預(yù)定 量的單獨(dú)的或與其他活性劑適當(dāng)組合的所述組合物。如本文所用的術(shù)語單位劑型是指適合 作為人類和動(dòng)物受試者的單一劑量的物理上離散的單位，各單位含有預(yù)定量的單獨(dú)的或與 其他活性劑組合的本發(fā)明組合物（以足以產(chǎn)生所要效果的量計(jì)算），其在適當(dāng)時(shí)與藥學(xué)上可 接受的稀釋劑、載劑或媒介物相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的新型單位劑型的規(guī)格取決于在特定受試者 中與藥物組合物相關(guān)的特定藥效動(dòng)力學(xué)。
[0082]理想的是，組合物中存在有效量或充足數(shù)目的分離的多克隆γδτ細(xì)胞，并且其被 引入受試者中，從而建立長期特異性抗腫瘤反應(yīng)，以與另外在不存在這樣的治療的情況下 將產(chǎn)生的結(jié)果相比減小腫瘤尺寸或消除腫瘤生長或再生長。理想的是，當(dāng)與另外不存在多 克隆γ δτ細(xì)胞的相同條件相比時(shí)，引入受試者中的多克隆γ δτ細(xì)胞的量使得腫瘤尺寸減小 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%〇 [0083]因此，施用的多克隆γδτ細(xì)胞的量應(yīng)將施藥途徑考慮在內(nèi)，并且應(yīng)使得足夠數(shù)目 的多克隆γ st細(xì)胞將被引入，從而實(shí)現(xiàn)所要的治療反應(yīng)。此外，本文所描述的組合物中所包 括的每種活性劑的量(例如每個(gè)細(xì)胞所要接觸的量或某一體重的量)可在不同應(yīng)用中有所 變化。一般來說，多克隆γ st細(xì)胞的濃度理想地應(yīng)足以在正在治療的受試者中提供至少約1 X 106至約1 X 109個(gè)多克隆γ δτ細(xì)胞，甚至更理想地，約1 X 107至約5 X 108個(gè)多克隆γ δτ細(xì) 胞，不過任何高于（例如大于5 Χ108個(gè)細(xì)胞)或低于(例如小于1 Χ107個(gè)細(xì)胞)所述量的合適 的量均可使用。給藥時(shí)間表可以充分確定的基于細(xì)胞的療法為基礎(chǔ)(參見例如Topalian和 Rosenberg，1987;美國專利號(hào)4，690，915 )，或者可使用交替連續(xù)輸注策略。
[0084]在從業(yè)者優(yōu)化用于實(shí)踐本發(fā)明的本發(fā)明方法之后，這些值提供所要使用的多克隆 γδτ細(xì)胞的范圍的一般指導(dǎo)。本文對(duì)此類范圍的敘述決不排除使用更高或更低量的組分， 正如在特定應(yīng)用中可能認(rèn)可的那樣。舉例來說，實(shí)際的劑量和時(shí)間表可視組合物是否與其 他藥物組合物組合施用，或視個(gè)體間藥物動(dòng)力學(xué)差異、藥物處置以及代謝作用而變化。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員可輕易地根據(jù)具體情況的緊急程度而作出任何必要的調(diào)整。
[0085] III.人工抗原呈遞細(xì)胞
[0086]在一些情況下，aAPC適用于制備實(shí)施方案的治療性組合物和細(xì)胞治療產(chǎn)品。關(guān)于 抗原呈遞系統(tǒng)的制備和使用的一般指導(dǎo)，參見例如美國專利號(hào)6,225,042、6,355,479、6， 362，001以及6，790，662;美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2009/0017000和2009/0004142;以及國際公 布號(hào) W02007/103009。
[0087] aAPC系統(tǒng)可包含至少一種外源性輔助分子。.可使用任何合適的數(shù)目和組合的輔 助分子。輔助分子可選自諸如共刺激分子和粘附分子等輔助分子。示例性共刺激分子包括 ⑶86和B7.1 (B7.1以前稱為B7并且也稱為⑶80)，其除其他方面之外結(jié)合于T細(xì)胞表面的 CD28和/或CTLA-4分子，從而影響例如T細(xì)胞擴(kuò)增、Thl分化、短期T細(xì)胞存活以及細(xì)胞因子分 泌，諸如白介素（IL)-2(參見Kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物結(jié)合糖蛋白，諸如選 擇素;跨膜結(jié)合糖蛋白，諸如整合素;鈣依賴性蛋白，諸如鈣粘蛋白；以及單次跨膜免疫球蛋 白（Ig)超家族蛋白，諸如細(xì)胞間粘附分子（ICAM)，其促進(jìn)例如細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)接 觸。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，諸如ICAM-1。適用于選擇、克隆、制備以及表達(dá)示例 性輔助分子的技術(shù)、方法以及試劑，包括共刺激分子和粘附分子例不于例如美國專利號(hào)6， 225，042、6，355，479 以及6，362，001 中。
[0088]在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，aAPC可被滅活(例如通過化學(xué)處理或照射），使得在滅活 后基本上不發(fā)生細(xì)胞生長或復(fù)制。因此，滅活維持了 aAPC的重要APC功能，同時(shí)幫助緩解關(guān) 于使用aAPC開發(fā)的細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性的擔(dān)憂。關(guān)于有關(guān)交聯(lián)和aAPC的方法，參見例如 美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2009/0017000,該專利申請(qǐng)以引用的方式并入本文中。隨后，滅活的 aAPC培養(yǎng)物可維持像適合活化和富集治療有效群體的多克隆γ δΤ細(xì)胞那樣長的時(shí)間。 [0089] IV.嵌合抗原受體
[0090]如本文所用的術(shù)語"嵌合抗原受體（CAR)"可指例如人工Τ細(xì)胞受體Τ體（Τ-bodies )、單鏈免疫受體、嵌合T細(xì)胞受體或嵌合免疫受體，并且涵蓋將人工特異性移植至特 定的免疫效應(yīng)細(xì)胞上的工程改造后的受體。CAR可用于賦予T細(xì)胞單克隆抗體特異性，從而 允許產(chǎn)生大量的特異性Τ細(xì)胞，例如用于過繼性細(xì)胞治療。在特定實(shí)施方案中，CAR使細(xì)胞的 特異性指向例如腫瘤相關(guān)抗原。在一些實(shí)施方案中，CAR包含胞內(nèi)活化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域 以及胞外結(jié)構(gòu)域，該胞外結(jié)構(gòu)域的長度可變化并且包含腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)。在特定方面 中，CAR包含衍生自單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)與CD3-G (-種跨膜結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部結(jié) 構(gòu)域(endo doma i η))融合的融合體。其他CAR設(shè)計(jì)的特異性可源自于受體的配體(例如肽)或 模式識(shí)別受體，諸如Dectin。在某些情況下，可將抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域的間隔加以修改以減少激 活誘發(fā)的細(xì)胞死亡。在某些情況下，CAR包含用于額外共刺激信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域，諸如003_ (、卩^?、0)27、0)28丄0137、04?10以及/或者(^40。在一些情況下，可與041?共表達(dá)的分子包括 共刺激分子、用于成像(例如用于正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)）的報(bào)告基因、在添加前藥后有條 件地去除T細(xì)胞的基因產(chǎn)物、歸巢受體、趨化因子、趨化因子受體、細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子受 體。
[0091]如本文所用的術(shù)語"T細(xì)胞受體(TCR)"是指在T細(xì)胞上由γ和δ( γ/δ)鏈的異二聚 體組成的蛋白質(zhì)受體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR可在任何包含TCR的細(xì)胞上加以修飾，該 細(xì)胞包括例如輔助Τ細(xì)胞、細(xì)胞毒性Τ細(xì)胞、記憶Τ細(xì)胞、調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞、自然殺傷Τ細(xì)胞以及γ 奵細(xì)胞。
[0092]如本文所用，術(shù)語"抗原"是能夠被抗體或Τ細(xì)胞受體結(jié)合的分子?？乖硗饽軌蛘T 導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生Β和/或Τ淋巴細(xì)胞。
[0093] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及核酸，包括編碼抗原特異性嵌合抗原受體(CAR)多肽(包括 已人源化以降低免疫原性的CAR，hCAR)的核酸，其包含胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以 及包含一個(gè)或多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)基序的胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，CAR可識(shí)別包含一個(gè)或 多個(gè)抗原之間的共享間隔的表位。模式識(shí)別受體(諸如Dectin-Ι)可用于獲得對(duì)碳水化合物 抗原的特異性。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)可包含單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、單克隆抗體的 可變區(qū)以及/或者其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異性是獲自結(jié)合于受體的肽 (例如細(xì)胞因子）?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)是在抗原受體(例如免疫球蛋白和T細(xì)胞受體)蛋白的可 變結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的短氨基酸序列，其補(bǔ)充抗原，并且因此為受體提供其針對(duì)所述特定抗原 的特異性?？乖荏w的各多肽鏈含有三個(gè)⑶R(⑶R1、CDR2以及⑶R3)。因?yàn)榭乖荏w典型地 由兩個(gè)多肽鏈組成，所以對(duì)于可與接觸抗原的各抗原受體來說，存在六個(gè)CDR，每個(gè)重鏈和 輕鏈含有三個(gè)CDR。因?yàn)榕c免疫球蛋白和T細(xì)胞受體相關(guān)的大多數(shù)序列變異存在于CDR中，所 以這些區(qū)域有時(shí)被稱為高變結(jié)構(gòu)域。其中，CDR3顯示最大可變性，因?yàn)樗峭ㄟ^VJ(在重鏈 和ΤΟ?αβ鏈的情況下是VDJ)區(qū)的重組而編碼。
[0094] 可以預(yù)期的是，人類CAR核酸是用于增強(qiáng)對(duì)人類患者的細(xì)胞免疫治療的人類基因。 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括全長CARcDNA或編碼區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)或結(jié)構(gòu)域可包含衍 生自特定人類單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)的V H和I鏈的片段，諸如描述于以引用的 方式并入本文中的美國專利7,109,304中的那些。片段還可以是人類抗原特異性抗體的任 何數(shù)目的不同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)更特定實(shí)施方案中，片段是由針對(duì)人類密碼子用途 加以優(yōu)化以在人類細(xì)胞中表達(dá)的序列編碼的抗原特異性scFv。
[0095] 排列可以是多聚的，諸如雙抗體或多聚體。多聚體最有可能是通過使輕鏈和重鏈 的可變部分的交叉配對(duì)成已被稱為雙抗體的物質(zhì)而形成。構(gòu)建體的鉸鏈部分可具有從完全 缺失至保留第一個(gè)半胱氨酸至脯氨酸而非絲氨酸取代至截短至第一個(gè)半胱氨酸的多個(gè)替 代物。Fc部分可缺失。穩(wěn)定和/或二聚化的任何蛋白質(zhì)均可服務(wù)于此目的?？墒褂脙H一種Fc 結(jié)構(gòu)域，例如來自人類免疫球蛋白的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。還可以使用已經(jīng)過修飾以改善二聚 化的人類免疫球蛋白的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)。還可以僅使用免疫球蛋白的鉸鏈部分。還可以 使用⑶8α的部分。
[0096] 本發(fā)明的嵌合受體胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)活化已放入嵌合受體的免疫細(xì)胞的 至少一種正常效應(yīng)功能。術(shù)語"效應(yīng)功能"是指分化細(xì)胞的一種專門功能。舉例來說，Τ細(xì)胞 的效應(yīng)功能可為細(xì)胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細(xì)胞因子。初始干細(xì)胞樣記憶或記憶 型Τ細(xì)胞中的效應(yīng)功能包括抗原依賴性增殖。因此，術(shù)語"胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域"是指蛋白質(zhì) 中轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)并且引導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行專門功能的部分。雖然通常將使用整個(gè)胞內(nèi)信號(hào)傳 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但是在許多情況下，將沒有必要使用整個(gè)胞內(nèi)多肽。在胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域截短 部分可獲得應(yīng)用的情況下，這種截短部分可代替完整鏈?zhǔn)褂茫灰匀晦D(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信 號(hào)即可。因此，術(shù)語胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域意指包括胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功 能信號(hào)的任何截短部分。實(shí)例包括Τ細(xì)胞受體的ζ鏈或任何其同源物(例如η、S、γ或ε)、ΜΒ1 鏈、B29、Fc RIII、Fc RI以及信號(hào)傳導(dǎo)分子（諸如0)3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、0X40& 及其組合）的組合，以及其他類似分子和片段以及信號(hào)傳導(dǎo)部分的突變形式（諸如修飾 ITAM)?？墒褂没罨鞍准易宓钠渌蓡T的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)部分，諸如FcyRIII和FceRI。
[0097] 抗原特異性胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可通過跨膜結(jié)構(gòu)域（諸如人類 IgG4Fc鉸鏈和Fc區(qū)）連接。替代物包括人類CD4跨膜結(jié)構(gòu)域、人類CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、跨膜人類 CD3G結(jié)構(gòu)域或一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸突變?nèi)祟怌D3G結(jié)構(gòu)域或來自其他人類跨膜信號(hào)傳導(dǎo)蛋 白（諸如CD16和CD8以及促紅細(xì)胞生成素受體)的其他跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0098] 在一些實(shí)施方案中，CAR核酸包含編碼其他共刺激受體的序列，諸如跨膜結(jié)構(gòu)域和 經(jīng)過修飾的CD28胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。其他共刺激受體包括但不限于以下中的一個(gè)或多 個(gè):0028丄027、0父-40(0)134)、0厶？10以及4-188(00137)。除由0)3(引發(fā)的主要信號(hào)之外，由 插入人類CAR的人類共刺激受體提供的額外的信號(hào)對(duì)充分活化T細(xì)胞來說也是重要的，并且 可幫助改善過繼性免疫治療的體內(nèi)持久性和治療成功率。
[0099] 在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸區(qū)段和合并了編碼CAR的DNA序列的表 達(dá)盒。本發(fā)明載體主要是被設(shè)計(jì)成在經(jīng)過調(diào)節(jié)的真核啟動(dòng)子（例如MNDU3啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng) 子、EFla啟動(dòng)子或泛素啟動(dòng)子）的控制下將所要基因遞送至免疫細(xì)胞，優(yōu)選T細(xì)胞。此外，載 體為了促進(jìn)其體外操縱(如果沒有其他原因）可含有可選擇標(biāo)記物。在其他實(shí)施方案中，CAR 可由體外轉(zhuǎn)錄自DNA模板的mRNA表達(dá)。
[0100] 嵌合抗原受體分子是重組的，并且通過其結(jié)合抗原與經(jīng)由存在于其胞質(zhì)尾中的一 個(gè)或多個(gè)免疫受體激活基序（ITAM)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號(hào)的能力加以區(qū)分。使用抗原結(jié)合部分(例 如由單鏈抗體(scFv)產(chǎn)生）的受體構(gòu)建體提供額外的具"通用性"的優(yōu)點(diǎn)，因而其以非HLA依 賴性方式結(jié)合靶細(xì)胞表面上的天然抗原。舉例來說，一些實(shí)驗(yàn)室已對(duì)融合至編碼CD3復(fù)合物 的ζ鏈(ζ)的胞內(nèi)部分、Fc受體γ鏈以及天空酪氨酸激酶的序列的scFv構(gòu)建體進(jìn)行了報(bào)道。 已在若干鼠類和人類抗原-scFv<系統(tǒng)中記載了重定向T細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制，包括由CTL產(chǎn)生的 腫瘤識(shí)別和溶解。
[0101] 迄今為止，典型地使用非人類抗原結(jié)合區(qū)來構(gòu)建嵌合抗原受體。使用非人類抗原 結(jié)合區(qū)（諸如鼠單克隆抗體）的潛在問題是缺乏人類效應(yīng)功能，并且不能滲透至腫瘤塊中。 換句話說，此類抗體可能不能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性溶解或者通過抗體依賴性細(xì)胞毒性或Fc-受 體介導(dǎo)的吞噬作用溶解人類靶細(xì)胞以破壞表達(dá)CAR的細(xì)胞。此外，非人類單克隆抗體可由人 類宿主識(shí)別為外來蛋白質(zhì)，并且因此，重復(fù)注射此類外來抗體可導(dǎo)致引起有害超敏反應(yīng)的 免疫反應(yīng)的誘發(fā)。對(duì)于基于鼠類的單克隆抗體，這經(jīng)常被稱為人類抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。 因此，使用人類抗體是更優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儾幌袷罂贵w一樣引起強(qiáng)的HAMA反應(yīng)。類似地，在 CAR中使用人類序列可避免免疫介導(dǎo)的識(shí)別作用以及因此由駐留在受體中并且識(shí)別在HLA 情形下經(jīng)過加工的抗原的內(nèi)源性T細(xì)胞產(chǎn)生的消除作用。
[0102] 在一些實(shí)施方案中，嵌合抗原受體包含:a)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、b)跨膜結(jié)構(gòu)域以 及c)包含抗原結(jié)合區(qū)的胞外結(jié)構(gòu)域。
[0103] 在特定實(shí)施方案中，CAR中的胞內(nèi)受體信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物 (諸如CD3的ζ鏈）的那些，以及FcyRIII共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，例如單獨(dú)的或與CD3G在一 個(gè)系列中的〇)28、0)27、04?10、00137、(^40、0)2。在特定實(shí)施方案中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(其可稱為 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）包含以下各項(xiàng)中的一者或多者的一部分或全部：TCRG鏈、CD28、⑶27、0X40/ CD134、4-lBB/CD137、FceRIγ、ICOS/CD278、IL-2R0/CD122、IL-2Ra/CD132、DAPlO、DAP12以 及CD40。在一些實(shí)施方案中，使用內(nèi)源性T細(xì)胞受體復(fù)合物在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的任何部分。可 使用一個(gè)或多個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樗^的第三代CAR具有例如融合在一起以獲得相加或協(xié) 同效應(yīng)的至少兩個(gè)或三個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0104]在嵌合抗原受體的某些實(shí)施方案中，受體的抗原特異性部分(其可稱為包含抗原 結(jié)合區(qū)的胞外結(jié)構(gòu)域)包含腫瘤相關(guān)抗原或包括由模式識(shí)別受體(諸如Dectin-Ι)識(shí)別的碳 水化合物抗原的病原體特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。腫瘤相關(guān)抗原可屬于任何種類，只要它在 腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面在上表達(dá)即可。腫瘤相關(guān)抗原的示例性實(shí)施方案包括CD19、CD20、癌胚 抗原、甲胎蛋白、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體(R〇R) 1、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Me t、AKT、 Her2、Her3、上皮腫瘤抗原、黑素瘤相關(guān)抗原、突變的p53、突變的ras等。在某些實(shí)施方案中， CAR可與膜結(jié)合細(xì)胞因子共表達(dá)，以在存在低量的腫瘤相關(guān)抗原時(shí)改善持久性。舉例來說， CAR可與膜結(jié)合IL-15共表達(dá)。
[0105]在某些實(shí)施方案中，胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原可靶向諸如HA-1、存活素、WT1以及p53。這 可通過在HLA的情形下識(shí)別所描述的由胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原加工的肽的通用T細(xì)胞上所表達(dá) 的CAR來實(shí)現(xiàn)。此外，可通用T細(xì)胞基因修飾，以表達(dá)在HLA的情況下識(shí)別胞內(nèi)加工的腫瘤相 關(guān)抗原的T細(xì)胞受體配對(duì)。
[0106]病原體可屬于任何種類，但在特定實(shí)施方案中，病原體是例如真菌、細(xì)菌或病毒。 示例性病毒病原體包括腺病毒家族的那些、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV家族病毒、小RNA病毒科、皰疹病毒科、肝病 毒科、黃病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒、彈狀病 毒科以及披膜病毒科。示例性病原性病毒引起天花、流行性感冒、流行性腮腺炎、麻疹、水 痘、埃博拉以及風(fēng)疹。示例性病原性真菌包括假絲酵母(Candida)、曲霉(Aspergillus)、隱 球菌（Cryptococcus)、組織胞衆(zhòng)菌（Histoplasma)、肺囊蟲（Pneumocystis)以及葡萄穗霉 (Stachybotrys)。示例性病原性細(xì)菌包括鏈球菌（Streptococcus)、假單胞菌 (Pseudomonas)、志賀氏菌（Shigella)、彎曲桿菌（Campylobacter)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、螺桿菌(Helicobacter)、大腸桿菌(E· coli)、立克次體(Rickettsia)、 芽孢桿菌（Bacillus)、博德特氏菌（Bordetella)、衣原體（Chlamydia)、螺旋菌 (Spirochetes)以及沙門氏菌（Salmonella)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用病原體受體 Dec t in-1來產(chǎn)生識(shí)別真菌的細(xì)胞壁上的碳水化合物結(jié)構(gòu)的CAR。經(jīng)過基因修飾以基于 Dectin-Ι的特異性表達(dá)CAR的T細(xì)胞可識(shí)別曲霉并且以菌絲生長為目標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，CAR可基于識(shí)別病毒決定簇(例如來自CMV和埃博拉病毒的糖蛋白）以中斷病毒感染和病 變的抗體來制備。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，病原性抗原是曲霉碳水化合物抗原，對(duì)它來說，CAR中的胞外 結(jié)構(gòu)域諸如經(jīng)由Dectin-Ι來識(shí)別真菌細(xì)胞壁的碳水化合物的模式。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的嵌合免疫受體可通過本領(lǐng)域中已知的任何手段來產(chǎn)生，不過優(yōu)選它 是使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)(基因組文庫篩選、PCR、引物輔助連接、 酵母和細(xì)菌的scFv文庫、定點(diǎn)誘變等）制備編碼嵌合受體的若干區(qū)域的核酸序列并且組裝 成完整編碼序列。所得編碼區(qū)可插入到表達(dá)載體中并且用于轉(zhuǎn)化合適的表達(dá)宿主同種異體 T細(xì)胞系。
[0109] 如本文所用，核酸構(gòu)建體或核酸序列或聚核苷酸意在指可轉(zhuǎn)化或引入T細(xì)胞中并 且轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生產(chǎn)物(例如嵌合抗原受體)的DNA分子。
[0110] 在本發(fā)明中所使用的示例性核酸構(gòu)建體(聚核苷酸）中，啟動(dòng)子可操作地連接至編 碼本發(fā)明的嵌合受體核酸序列，即，它們被定位，以促進(jìn)從編碼嵌合受體的DNA轉(zhuǎn)錄信使 RNA。啟動(dòng)子可具有基因組來源或合成產(chǎn)生。用于T細(xì)胞中的多種啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中熟知的 (例如CD4啟動(dòng)子）。啟動(dòng)子可為組成型或誘導(dǎo)型的，誘導(dǎo)與例如特定細(xì)胞類型或特定成熟水 平相關(guān)?；蛘撸S多熟知的病毒啟動(dòng)子也是適合的。感興趣的啟動(dòng)子包括肌動(dòng)蛋白啟動(dòng) 子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、人類巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng) 子以及弗蘭德脾病灶形成性病毒(Friend spleen focus-forming virus)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子 可能或可能不與增強(qiáng)子相關(guān)聯(lián)，其中增強(qiáng)子可與特定啟動(dòng)子天然相關(guān)聯(lián)或與不同啟動(dòng)子相 關(guān)聯(lián)。
[0111] 編碼嵌合受體的開放閱讀框的序列可獲自基因組DNA來源、CDNA來源或者可合成 (例如經(jīng)由PCR)或其組合。視基因組DNA的大小和內(nèi)含子的數(shù)目而定，可能需要使用cDNA或 其組合，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)內(nèi)含子穩(wěn)定mRNA或提供T細(xì)胞特異性表達(dá)。此外，可能進(jìn)一步有利的是使 用內(nèi)源性或外源性非編碼區(qū)來穩(wěn)定mRNA。
[0112] 對(duì)于本發(fā)明的嵌合抗原受體的表達(dá)，可使用編碼嵌合受體的N末端組分的核酸序 列的天然存在的或內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)在目標(biāo)宿主中產(chǎn)生嵌合受體?；蛘?，可使用允許組 成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的外源性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其中表達(dá)可根據(jù)目標(biāo)宿主、所要表達(dá)水平、目標(biāo)宿 主的性質(zhì)等加以控制。
[0113] 同樣地，將嵌合受體引導(dǎo)至表面膜的信號(hào)序列可為嵌合受體的N末端組分的內(nèi)源 性信號(hào)序列。任選地，在一些情況下，可能需要將此序列換成不同的信號(hào)序列。然而，所選信 號(hào)序列應(yīng)與T細(xì)胞的分泌途徑相容，使得嵌合受體呈現(xiàn)于T細(xì)胞的表面上。
[0114] 類似地，終止區(qū)可由編碼嵌合受體的C末端組分的核酸序列的天然存在的或內(nèi)源 性的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)提供?；蛘撸K止區(qū)可源自于不同的來源。在大多數(shù)情況下，終止區(qū)的來源 通常不被認(rèn)為對(duì)于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)來說是關(guān)鍵的，并且可使用各種各樣的終止區(qū)，而不 會(huì)不利地影響表達(dá)。
[0115] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，在一些情況下，在CAR中在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端可缺 失幾個(gè)氨基酸，例如通常不超過10個(gè)、更通常不超過5個(gè)殘基。此外，可能需要在邊界處引入 少數(shù)氨基酸，通常不超過10個(gè)、更通常不超過5個(gè)殘基。氨基酸的缺失或插入可能是由于構(gòu) 建的需要，從而提供方便的限制位點(diǎn)、操作容易性、表達(dá)水平的改善等。此外，可出于類似的 原因發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸用不同的氨基酸取代，通常在任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域中均不取代超過 約5個(gè)氨基酸。
[0116] 編碼根據(jù)本發(fā)明的嵌合受體的嵌合構(gòu)建體可以常規(guī)方式來制備。因?yàn)?，在大多?shù) 情況下，可使用天然序列，所以可適當(dāng)時(shí)分離和操縱天然基因，以允許各種組分的適當(dāng)接 合。因此，編碼嵌合受體的N末端和C末端蛋白的核酸序列可通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、 使用使得不需要的基因部分缺失的適當(dāng)?shù)囊飦砑右苑蛛x。或者，可使用克隆基因的限制 性消化來產(chǎn)生嵌合構(gòu)建體。在任一情況下，可選擇平端(blunt-ended)的或具有互補(bǔ)重疊的 序列來提供限制位點(diǎn)。
[0117] 用于制備嵌合構(gòu)建體的各種操作可在體外進(jìn)行，并且在特定實(shí)施方案中，使用標(biāo) 準(zhǔn)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法將嵌合構(gòu)建體引入用于在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺『捅磉_(dá)的載體中。因此，在 每次操作后，將由接合DNA序列所得的構(gòu)建體進(jìn)行克隆，載體分離并且序列篩選，以確保序 列編碼所需嵌合受體。可通過限制分析、測(cè)序等來篩選序列。
[0118] 本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體在具有或懷疑具有癌癥的受試者中通過減小腫瘤尺寸或阻 止這些受試者中的腫瘤生長或再生長而獲得應(yīng)用。因此，本發(fā)明另外涉及一種用于在受試 者中減少生長或阻腫瘤形成的方法，該方法通過將本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體引入受試者的分離 的T細(xì)胞中，并且將轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞再引入受試者中，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤反應(yīng)以減小或消除受試 者的腫瘤。可使用的合適的T細(xì)胞包括細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)或具有需要中斷的T細(xì)胞受 體的任何細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，從受試者分離這些細(xì)胞的各種方法是輕易可獲 得的。舉例來說，使用細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)或使用市售試劑盒(例如來自Pierce, Rockford, 111.的ISOCELL?)。
[0119] 可以預(yù)期的是，可將嵌合構(gòu)建體以裸DNA或在合適的載體中的形式引入受試者自 己的T細(xì)胞中。使用裸DNA通過電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見例如美 國專利號(hào)6,410,319。裸0嫩通常是指編碼以適當(dāng)取向含于質(zhì)粒表達(dá)載體中以便表達(dá)的本發(fā) 明嵌合受體的DNA。有利的是，使用裸DNA使產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明嵌合受體的T細(xì)胞所需的時(shí)間減 少。
[0120] 或者，可使用病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或慢 病毒載體)來將嵌合構(gòu)建體引入T細(xì)胞中?；蛘?，可使用非病毒載體，諸如參與轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA和 mRNA種類，其包括睡美人系統(tǒng)。其他質(zhì)粒包括以游離體質(zhì)粒的形式存在的DNA種類。適合于 根據(jù)本發(fā)明方法使用的載體在受試者的T細(xì)胞中是不復(fù)制的。已知基于病毒的大量載體，其 中保持在細(xì)胞中的病毒的拷貝數(shù)足夠低以維持細(xì)胞的活力。說明性載體包括本文公開的 pFB-neo 載體(STRATAGENE:⑩)以及基于 HI V、SV40、EBV、HSV 或 BPV 的載體。
[0121] -旦確定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞能夠以表面膜蛋白形式在所需調(diào)控下并且以所要水 平表達(dá)嵌合受體，即可確定嵌合受體在宿主細(xì)胞中是否具有提供所需信號(hào)誘導(dǎo)的功能。隨 后，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞再引入或施用給受試者以激活受試者的抗腫瘤反應(yīng)。為便于施藥，可將 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞制成藥物組合物或制成適合于與適當(dāng)?shù)牧硗饪蔀樗帉W(xué)可接受的載 劑或稀釋劑一起體內(nèi)施用的植入物。制備這種組合物或植入物的手段在本領(lǐng)域中已有描述 (參見例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences，第 16版，Mack編（1980))。在適當(dāng)情況 下，可以相應(yīng)施藥途徑的常用方式將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞配制成半固體或液體形式的制劑，諸如膠 囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣溶膠?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的手段來阻止組合物的釋放和吸 收或使其降至最低程度，直至其到達(dá)目標(biāo)組織或器官，或確保組合物的定時(shí)釋放。然而，理 想的是，使用不使表達(dá)嵌合受體的細(xì)胞無效的藥學(xué)上可接受的形式。因此，理想的是，可將 轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞制成含有平衡鹽溶液、優(yōu)選Hanks平衡鹽溶液或生理鹽水的藥物組合物。
[0122] V.本發(fā)明的試劑盒
[0123] 本文所描述的任何組合物均可包含在試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，在試劑盒中 提供同種異體多克隆γ st細(xì)胞，所述試劑盒還可包括適合于擴(kuò)增細(xì)胞的試劑，諸如培養(yǎng)基、 aAPC、生長因子以及/或者細(xì)胞因子。
[0124] 試劑盒可包含一種或多種適當(dāng)?shù)确值谋景l(fā)明組合物或試劑，以產(chǎn)生本發(fā)明的組合 物。試劑盒的組分可以水性介質(zhì)或以凍干形式進(jìn)行包裝。試劑盒的容器構(gòu)件可包括可將組 分放至其中并且優(yōu)選適當(dāng)?shù)确值闹辽僖粋€(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他容器構(gòu)件。 在試劑盒中存在超過一個(gè)組分的情況下，試劑盒通常還將含有可將額外的組分分開放至其 中的第二、第三或其他額外的容器。然而，在小瓶中可包含組分的各種組合。本發(fā)明的試劑 盒典型地還將包括用于容納多克隆γ δτ細(xì)胞的構(gòu)件和嚴(yán)格限制用于商業(yè)銷售的任何其他 試劑容器。此類容器可包括例如將所需小瓶保存在其中的注塑或吹塑模制塑料容器。 VI .實(shí)施例
[0125] 包括下列實(shí)施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，以下實(shí)施 例中所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中很好地起作用的技術(shù)，并且因此可 視為構(gòu)成了用于其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可在所公 開的特定實(shí)施方案中作出許多變化，并且仍然獲得相同或類似的結(jié)果，可以在所公開和仍 然獲得相同或類似的結(jié)果，而不會(huì)脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0126] 實(shí)施例1-用于癌癥免疫治療的γδΤ細(xì)胞亞群
[0127] 鑒于γδΤ細(xì)胞諸如針對(duì)Κ562細(xì)胞(D'Asaro等，2010;Lamb等，1999)具有內(nèi)源性抗 癌活性，本發(fā)明人測(cè)試了腫瘤細(xì)胞是否將充當(dāng)用于增殖多克隆γ對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞底物。已將 Κ562細(xì)胞基因修飾以充當(dāng)用于離體活化并且數(shù)目擴(kuò)增αβΤ細(xì)胞和ΝΚ細(xì)胞的人工抗原呈遞細(xì) 胞（aAPC)(Denman等，2012;Maus等，2002;Numbenjapon等，2006;Singh等，2013;Suhoski等， 2007)。本發(fā)明人確定經(jīng)過γ-照射的源自K562的aAPC(指定為克隆#4,經(jīng)過基因修飾以共表 達(dá)0)19工064、0)86工01371^以及11^-15的膜結(jié)合突變蛋白（11111^15))與細(xì)胞因子組合可維持 表達(dá)νδ1、νδ2、νδ3、νδ5、νδ7以及νδ8與νγ 2、νγ3、νγ7、νγ8、νγ9、νγ 10以及νγ 11TCR的 多克隆Τ細(xì)胞的增殖。本發(fā)明人證實(shí)，這些亞群就分化狀態(tài)來說有所不同（初始、中心記憶以 及效應(yīng)記憶），并且其殺死腫瘤細(xì)胞的能力不同。這些比較暗示了過繼性免疫治療、癌癥生 物學(xué)以及免疫學(xué)。
[0128] 多克隆γ δτ細(xì)胞基于aAPC的離體數(shù)目擴(kuò)增依賴于共刺激和細(xì)胞因子。γ δτ細(xì)胞的 過繼轉(zhuǎn)移需要離體增殖，因?yàn)閺耐庵苎獑魏思?xì)胞(PBMC)開始的數(shù)目是有限的（關(guān)于淋巴細(xì) 胞池的設(shè)門：3.2 % ± 1.2 % ;平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD); η = 4)。將分離自PBMC的γ δΤ細(xì)胞基于 經(jīng)過工程改造以表達(dá)共刺激分子的γ經(jīng)過γ照射的源自Κ562的aAPC(克隆#4)在可溶性重 組11^-2和11^-21存在下共培養(yǎng)22天，這使得長出均勻共表達(dá)^3和1'0?丫6的1'細(xì)胞群(97.9% ±0.6%;平均值土SD;n = 4;圖1A)。這些培養(yǎng)物中不存在NK細(xì)胞（CD3negCD56+)和αβΤ細(xì)胞 (ΤΟ?αβ+)(圖1Β)。這種用于增殖的方法在三周內(nèi)由〈10 6個(gè)總起始細(xì)胞產(chǎn)生>109個(gè)γ δΤ細(xì)胞 (圖1C)，這表示增加4.9\103±1.7\103(平均值±50;11 = 4)倍。在共培養(yǎng)后檢測(cè)到1'0^1 + τα?δ2η'τα?δ1ηθ?；τα?δ2+以及TCRSlnegTCI^2 neg的群體，表明aAPC支持多克隆γ δτ細(xì)胞增殖 (圖1F和圖1G)。因此，aAPC和重組人類細(xì)胞因子支持由小起始數(shù)目的源自于PBMC的γ δΤ細(xì) 胞進(jìn)行的多克隆γ ST細(xì)胞的穩(wěn)健的數(shù)目擴(kuò)增。
[0129] 評(píng)估了在aAPC基礎(chǔ)上添加外源性細(xì)胞因子和存在共刺激分子(mIL15、CD86以及 CD137L)支持長出γ δΤ細(xì)胞的能力。將親本K562細(xì)胞加以基因修飾以表達(dá)單個(gè)共刺激分子， 并且進(jìn)行克隆以實(shí)現(xiàn)均勻表達(dá)（圖2)來評(píng)估所引入的分子對(duì)γδΤ細(xì)胞增殖的影響。與外源 性IL-2和IL-21-起共培養(yǎng)是使用γδΤ細(xì)胞和五組經(jīng)過丫照射的Κ562啟動(dòng)：⑴親本、（ii) mIL15 +、（iii)mIL15+CD86+、（iv)mIL15+CD137L+以及(v)mIL15+CD86 +CD137L+(克隆#4)。將 γδ Τ細(xì)胞與細(xì)胞因子平行培養(yǎng)，并且沒有APC，表明可溶性IL-2和IL-21僅支持γ δΤ細(xì)胞的有限 數(shù)目擴(kuò)增（圖1D)。當(dāng)添加親本Κ562細(xì)胞時(shí)增殖增加，表明這些細(xì)胞上的內(nèi)源性分子可激活 γ δΤ細(xì)胞增殖。與親本Κ562相比，在存在或不存在⑶86的情況下mIL15的表達(dá)似乎不進(jìn)一步 改善γδΤ細(xì)胞增殖的能力。相比之下，在mIL15+CD137L+和mIL15+CD86 +CD137L+aAPC共培養(yǎng)的 情況下觀測(cè)到顯著更高的γ訂細(xì)胞增殖速率。因此，似乎CD137L對(duì)于維持γ δΤ細(xì)胞在細(xì)胞 因子存在下基于Κ562細(xì)胞的增殖來說是重要的。當(dāng)將IL-2和IL-21從基于克隆#4的共培養(yǎng) 物中移除時(shí)，γ δΤ細(xì)胞的增殖停止，并且同時(shí)這些細(xì)胞因子對(duì)γ δΤ細(xì)胞增殖的速率展現(xiàn)相 加益處（圖1Ε)。這驗(yàn)證了將aAPC克隆#4與IL-2和IL-21兩者組合以驅(qū)動(dòng)γδΤ細(xì)胞離體增殖 的方法。
[0130] 新生γδΤ細(xì)胞基于aAPC的離體數(shù)目擴(kuò)增.使用同種異體臍帶血(UCB)來恢復(fù)經(jīng)歷 造血干細(xì)胞移植(HSCT)的患者的造血。被收集以恢復(fù)造血的UCB單位內(nèi)的有限豐度的單核 細(xì)胞縮減了直接可用于過繼轉(zhuǎn)移的新生γδΤ細(xì)胞的數(shù)目。因此，本發(fā)明人評(píng)估了 aAPC是否 會(huì)維持由較低起始數(shù)目的γ ST細(xì)胞進(jìn)行的增殖。使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來分離104 個(gè)源自UCB的γ δΤ細(xì)胞(典型UCB單位的約0.01 % )，將其基于aAPC克隆#4與IL-2和IL-21共 培養(yǎng)。在35天后，細(xì)胞數(shù)目增加 107倍，因?yàn)閺?04個(gè)起始γδΤ細(xì)胞（圖3A)增殖了平均1011個(gè) 源自UCB的γ δΤ細(xì)胞(范圍：6 X 109-3 X 1011 ;η = 5)。與PBMC相比對(duì)源自于UCB的γ δΤ細(xì)胞再 進(jìn)行兩次刺激，以突出其增殖至臨床相關(guān)數(shù)目的潛力。γ ST細(xì)胞群展現(xiàn)CD3和TCR γ δ的均一 共表達(dá)（圖3Β)并且缺乏ΤΟ?αβ+Τ細(xì)胞（圖3C)和CD3negCD56+NK細(xì)胞（圖3D)?？偟膩碚f，這些數(shù) 據(jù)表明，aAPC克隆#4在E-2和E-21與一起使用時(shí)可維持源自UCB的γ δΤ細(xì)胞從小的起始群 體進(jìn)行的離體增殖。
[0131] γ δΤ細(xì)胞在基于aAPC增殖后表達(dá)多克隆的和確定的TCRy δ譜型。在確定γ δΤ細(xì)胞 可基于aAPC數(shù)目擴(kuò)增后，本發(fā)明人試圖確定增殖細(xì)胞的TCR譜型。在此使用稱為"直接TCR表 達(dá)陣列"（DTEA)的將γ δΤ細(xì)胞中的TCR表達(dá)多樣性量化的非酶數(shù)字多重陣列來評(píng)估aAPC擴(kuò) 增的γ δΤ細(xì)胞是否展現(xiàn)多克隆TCR譜型（Zhang等，2012)。在源自PBMC的γ δΤ細(xì)胞中檢測(cè)到 八個(gè)νδ等位基因中的四個(gè)(νδ1、νδ2、νδ3以及νδ8)(圖4Α)，并且其與￥丫2、乂丫7、￥丫8(兩個(gè) 等位基因）、Vy9、VylO以及Vyll(圖4B)共表達(dá)。類似地，在從UCB擴(kuò)增的γ δΤ細(xì)胞中觀測(cè) 到νδ和Vy鏈的多克隆TCR譜型（圖4C和4D)，盡管具有較低豐度的νδ2細(xì)胞，但是由PBMC未見 到更多的V γ 2以及νγ 3、νδ5以及νδ7細(xì)胞的存在。因此，aAPC擴(kuò)增γ δΤ細(xì)胞，維持來自PBMC 與UCB的多克隆TCR譜型。
[0132] 本發(fā)明人試圖通過用τα?δ-特異性抗體分選多克隆群體并且對(duì)分離的培養(yǎng)物重復(fù) DTEA來驗(yàn)證這些mRNA數(shù)據(jù)。僅存在兩種可商購獲得的TCRS-特異性mAb，并且它們鑒別在 aAPC擴(kuò)增的來自PBMC(圖1F和1G)和UCB(圖5)的γδΤ細(xì)胞內(nèi)的三個(gè)離散νδ群體(νδ1:ΤΟ?δΓ 1'0^211'￥52:1'0^11^1'0^2+，以及￥ 5111(^5211'1'0^11^1'0^2 1^)，并且1'0^頻率遵循￥31> νδ lnegVS2neg>VS2，這證實(shí)了 DTEA。將從源自PBMC的γ δΤ細(xì)胞池 FACS分離的亞群以離散群體 形式用克隆#4增殖，此舉在通過TCRS同種型的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估時(shí)維持其身份（圖6A和6B)，并 且在分選的亞群之間在基于aAPC的增殖速率方面未觀測(cè)到差異（圖6C) ΑΤΕΑ證實(shí)這些分離 的νδ1、νδ2以及νδΓ，δ2ηθ??群體分別主要表達(dá)νδ1*〇1(圖6?)、νδ2*02(圖6E)以及νδ3*01(圖 6F)mRNA。不存在由多克隆γδΤ細(xì)胞（圖4Α)和各個(gè)分選的亞群產(chǎn)生的其他νδ2等位基因 （νδ 1*01_07和νδ1*〇1_75)的表達(dá)。在針對(duì)νδ表達(dá)分選的三個(gè)Τ細(xì)胞亞群中檢測(cè)到小量的νδ4(圖 7Α)、νδ5(圖7Β)、νδ6(圖7C)以及νδ7(圖7D)mRNA種類。VS8mRNA排他地存在于分選的νδ1 η，δ 2neg細(xì)胞中（圖7Ε)，并且類似地這些Τ細(xì)胞為來自PBMC的混合γδΤ細(xì)胞中的νδ8的主要貢獻(xiàn) 者（圖4Α)?？偟膩碚f，這些結(jié)果（i)表明分離的νδ?和νδ2亞群關(guān)于VSmRNA表達(dá)是純的，（ii) 證實(shí)來自PBMC的ΤΟ?δl negTCRS2neg γ δΤ細(xì)胞主要表達(dá)νδ3和VS8mRNA，并且（i ii)確定νδ 1、νδ2 以及VSlnegVS2neg Τ細(xì)胞亞群可分開地基于aAPC進(jìn)行增殖。
[0133] 然后使用DTEA來評(píng)估VyTCR用于獲得對(duì)三個(gè)分離的νδ亞群的每個(gè)中的等位基因 配對(duì)和V γ譜型的深入了解的用途。總體而言，νδ?和VSlnegVS2neg亞群在其與V γ鏈配對(duì)方面 是不同的(Ρ = 0.419;雙向AN0VA)，但是在νδ2Τ細(xì)胞中νγ表達(dá)顯著不同，這是與νδΙΤ細(xì)胞(ρ 〈0.0001)與νδ lnegVS2neg Τ細(xì)胞(ρ〈0.0001)相比。在每個(gè)V γ等位基因的趨勢(shì)中也觀測(cè)到這 種情況，其中νδ?和VSlnegVS2neg Τ細(xì)胞不同于νδ2Τ細(xì)胞（圖8)。事實(shí)上，在νδ亞群之間，關(guān)于V γ 2*02(圖8Β)、νγ8*01Μ(圖8G)、Vy*01X(圖8Η)、νγ9*01(圖81)以及νγ9*02(圖8J)mRNA 種類檢測(cè)到顯著差異。因此，多樣的V γ mRNA在每個(gè)νδ亞群內(nèi)的使用加強(qiáng)在基于aAPC加 IL-2 和IL-21增殖之后實(shí)現(xiàn)的多克隆譜型。據(jù)我們所知，這是迄今為止對(duì)Vy在表達(dá)νδ1、νδ2以及 v別negv^neg亞群的τ細(xì)胞之中的用途的最詳細(xì)的評(píng)估。
[0134] 增殖的γ δΤ細(xì)胞亞群表達(dá)預(yù)測(cè)其治療潛力的不同的標(biāo)記物。諸如記憶、歸巢以及 細(xì)胞溶解等Τ細(xì)胞功能可通過其表面表型進(jìn)行預(yù)測(cè)。本發(fā)明人探索了一組標(biāo)記物，以表征多 克隆γ δΤ細(xì)胞（圖9)。在基于aAPC共培養(yǎng)22天后，大多數(shù)（但并非全部）γ δΤ細(xì)胞為 ⑶4neg⑶8neg。這些Τ細(xì)胞如通過⑶38和⑶95的表達(dá)所測(cè)量是活化的，但如由不存在⑶57和程 序性死亡-1 (PD-1)的表達(dá)所證實(shí)并未耗盡。大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)⑶27和⑶28共刺激配體，并且 與初始(CD45RA)標(biāo)記物相比偏愛于抗原刺激過的（CD45R0)。其歸巢到皮膚、淋巴結(jié)以及骨 髓的潛力是分別通過CCR4、CCR7/⑶62L以及CXCR4/CLA的表達(dá)來證實(shí)。這些數(shù)據(jù)與aAPC增殖 具有記憶形成和歸巢到組織的潛力的被活化并且經(jīng)過抗原刺激的γ對(duì)細(xì)胞的能力相符。
[0135] 本發(fā)明人用于增殖的方法使他們能夠區(qū)分νδ1、νδ2以及VSlneM2neg譜系，并且因 此他們研究了 γ st細(xì)胞亞群在預(yù)測(cè)其治療潛力的標(biāo)記物的表達(dá)方面是否可具有明顯差異。 本發(fā)明人注意到針對(duì)ΤΟ?γδ的mAb染色的強(qiáng)度以不同的MFI鑒別群體（圖ΙΑ^νδ〗! 1細(xì)胞對(duì)應(yīng) 于TCR γ δ低分組（43±9;平均值土SD;n = 4)，νδlnegVS2neg T細(xì)胞對(duì)應(yīng)于TCR γ δ中分組（168土 40)，并且νδΙΤ細(xì)胞對(duì)應(yīng)于ΤΟ?γδ高分組（236±56)(圖1(^和1(?)。0)4和0)8在丫51'細(xì)胞上通 常不表達(dá)，但在CD4和CD8在分開的亞群中的表達(dá)中檢測(cè)到變化形式（圖10C和10D)。在用于 描述Τ細(xì)胞之間的記憶的αβ包括CCR7/CD62L(圖10Ε)和CD27/CD28(圖10F)的規(guī)范標(biāo)記物的 表達(dá)中觀測(cè)到差異，其顯示糾1和νδ1 η#νδ2ηθ?；群體不同于νδ2細(xì)胞。然而，已基于⑶27和 CD45RA的表達(dá)報(bào)道了人類 γ δΤ細(xì)胞記憶（圖 10G)，其中CD27+CD45RA+、CD27+CD45RAneg、 □)27_0)451^卿以及0)27 1^0)451^+分別對(duì)應(yīng)于1^、1'〇?、了￡|?以及了￡隱(〇3(^&111〇等，2011 ;?&即 等，2012)。大多數(shù)TN細(xì)胞是νδ 1，大多數(shù)T?是νδlnegVS2neg，大多數(shù)Tem細(xì)胞是νδ2，并且所有νδ 亞群均具有至少一些ΤΝ、Τ?以及ΤΕΜ群體。相比之下，實(shí)際上在任何νδ亞群中均未檢測(cè)到T EMRA (圖10G和圖10H)。鑒于這些不同的免疫表型，本發(fā)明人提出不同的功能屬性可能是歸因于 三個(gè)γδΤ細(xì)胞亞群。
[0136] γ δΤ細(xì)胞亞群預(yù)測(cè)響應(yīng)于腫瘤產(chǎn)生干擾素-γ。γ δΤ細(xì)胞可響應(yīng)于活化而產(chǎn)生細(xì) 胞因子。因此，進(jìn)行細(xì)胞因子和趨化因子的多重分析來確定aAPC增殖的γδΤ細(xì)胞是否會(huì)在 治療期間促成炎性環(huán)境。使用豆蔻酸佛波醇乙酸酯(Phorbol myristate acetate，PMA)和 離子霉素作為白細(xì)胞活化混合物(LAC)以模擬TCR活化。用培養(yǎng)基mock活化的細(xì)胞充當(dāng)陰性 對(duì)照。由LAC處理的γδΤ細(xì)胞未觀測(cè)到顯著產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5以及IL-13,但I(xiàn)L-10 產(chǎn)量相對(duì)于基線存在小程度增加（圖11A)。相比之下，LAC處理的γδΤ細(xì)胞顯著分泌IL-1RA、 IL-6以及IL-17，這與Τη17炎癥反應(yīng)相符合（圖11Β)。此外，與mock處理的對(duì)照相比，在暴露 于LAC之后γ δΤ細(xì)胞顯著產(chǎn)生促炎性TH1細(xì)胞因子IL-2、IL-12(p70)、干擾素 -γ (IFN γ )以 及腫瘤壞死因子-a(TNFa)(圖11C)。檢測(cè)到大量的趨化因子CCL3(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-Ια; MIPla)、CCL4(MIP10)以及CCL5(活化正常Τ細(xì)胞表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)因子;RANTES)(圖11D)。 CCR5結(jié)合于所有這三種趨化因子(Rostene等，2007)，但僅6% ± 2% (平均值土 SD;n = 4)的 γ ST細(xì)胞表達(dá)此受體?？偟膩碚f，正如基于細(xì)胞的免疫治療所希望的那樣，γ δΤ細(xì)胞的非特 異性活化引起很大程度上的促炎反應(yīng)。
[0137] IFNy對(duì)所有所評(píng)估的細(xì)胞因子最敏感（圖11C)，并且被選為γδΤ細(xì)胞響應(yīng)于腫瘤 的標(biāo)記物。使用胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)來分離νδτ細(xì)胞亞群并且評(píng)估其對(duì)腫瘤 的反應(yīng)（圖12Α至圖12C) dAPC增殖/活化的多克隆γ δΤ細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生了如 分別由855±475、242±178以及194±182(平均值±50;11 = 4)的正~丫1^1所示遵循以下順 序的IFN γ產(chǎn)量層級(jí):νδ2>νδ 1>νδlnegVS2neg(圖12D)。IFN γ的產(chǎn)生在存在TCR γ δ中和抗體的 情況下被阻斷，這表明在各個(gè)γ對(duì)細(xì)胞亞群中對(duì)腫瘤的這種細(xì)胞因子反應(yīng)是通過TCR γ δ介 導(dǎo)的（圖12D至圖12F)。這些數(shù)據(jù)支持以下前提，細(xì)胞因子反應(yīng)取決于γ δΤ細(xì)胞如通過其TCR γ δ所確定的亞型。
[0138] 多克隆γ δΤ細(xì)胞和νδΤ細(xì)胞亞群溶解廣泛范圍的腫瘤細(xì)胞。在確定aAPC增殖/活化 的γ st細(xì)胞可被活化以產(chǎn)生促炎介質(zhì)后，本發(fā)明人檢驗(yàn)了它們?nèi)芙鈴V泛范圍的腫瘤細(xì)胞系 的能力（圖13和圖14)。多克隆γδΤ細(xì)胞針對(duì)自體同源或同種異體正常Β細(xì)胞實(shí)際上不展現(xiàn) 細(xì)胞溶解，但能夠殺死同種異體Β細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL)細(xì)胞系RCH-ACV和 cALL-2 J細(xì)胞ALL細(xì)胞系Jurkat也對(duì)細(xì)胞溶解敏感，這表明γ δΤ細(xì)胞可用于靶向B細(xì)胞與T 細(xì)胞惡性腫瘤。Kasumi-3是⑶33+⑶34+未分化白血病細(xì)胞系（其被γ δΤ細(xì)胞殺死），這支持用 γδΤ細(xì)胞靶向微分化型腫瘤。慢性骨髓性白血?。–ML)細(xì)胞系Κ562和Κ562衍生的克隆# 4aAPC被多克隆γ δΤ細(xì)胞殺死。胰腺癌細(xì)胞系BxPc-3、CaPan-2、MiaPaCa-2以及Su8686被γ δ Τ細(xì)胞溶解，結(jié)腸癌瘤細(xì)胞系HCT-116也是如此。十個(gè)卵巢細(xì)胞系按以下敏感性下降的順序 被多克隆 γ δΤ細(xì)胞殺死：CA0V3>EF021>UPN251>IGR0Vl>0C314>Hey>A2780>0VCAR3>0AW42> EF027。這些細(xì)胞溶解數(shù)據(jù)突出了同種異體多克隆γ δΤ細(xì)胞在體外特異性地殺死廣泛范圍 的腫瘤的能力?！?br>[0139] 本發(fā)明人接下來測(cè)定了三個(gè)分開的γ δΤ細(xì)胞群的殺傷潛力。血液(Jurkat)和Κ562 以及實(shí)體(0C314和CA0V3)腫瘤細(xì)胞系被所有三個(gè)νδ譜系溶解（圖15)。對(duì)于所有靶標(biāo)均觀測(cè) 到如下排列的獨(dú)特溶解順序:VS2?VSl negVS2neg>VSl，其定義在4-h分析中的殺傷潛力（圖 15)。這與T細(xì)胞分化免疫表型相符合，因?yàn)門em細(xì)胞的頻率遵循VS2>VSl negVS2neg>VSl (圖 10Η)，并且已報(bào)導(dǎo)Τεμ細(xì)胞相對(duì)于分化程度更低的Τ細(xì)胞具有更高的效應(yīng)潛力（2007年6月）。 進(jìn)行了長期分析以評(píng)估在νδ亞群與腫瘤細(xì)胞之間在共培養(yǎng)48h后的殺傷作用（圖16)。大于 95 %的CA0V3和UPN251腫瘤細(xì)胞在兩天內(nèi)被所有三個(gè)亞群消除?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實(shí)， 基于aAPC增殖的各νδ譜系能夠溶解腫瘤，不過效率不同，并且首次觀測(cè)到VSl negVS2neg亞群 的抗腫瘤活性。
[0140] 腫瘤溶解的效率受TCRyS、NKG2D以及DNAM1影響。本發(fā)明人試圖確定由T細(xì)胞引起 的細(xì)胞溶解是否是直接依賴于TCRy δ通過阻斷受體與抗體來進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)方法考慮到γ δΤ 細(xì)胞共表達(dá)DNAM1和NKG2D(圖17Α)，這可活化Τ細(xì)胞與ΝΚ細(xì)胞兩者以實(shí)現(xiàn)殺傷作用（Bauer 等，1999;Gilfillan等，2008)。對(duì)NKG2D、DNAM1以及ΤΟ?γδ(克隆B1)具特異性的抗體對(duì)降低 對(duì)Jurkat和0C314細(xì)胞的溶解作用具有極小的影響。相比之下，阻斷ΤΟ?γδ(克隆ΙΜ)的抗體 降低對(duì)Jurkat與0C314細(xì)胞的殺傷作用（圖17Β)?？贵w(結(jié)合疆620、0熟11、1'0^6)池導(dǎo)致丫 奵細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)Jurkat(降低65% ±8% )和0C314(降低71 % ± 10% )細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用 以劑量依賴性方式進(jìn)一步降低（圖17B和圖17C)?？偟膩碚f，這些結(jié)果證實(shí)，aAPC增殖/活化 的γ ST細(xì)胞對(duì)殺傷作用的激活是多因素的，但依賴于TCR γ δ。
[0141] 已確立的卵巢癌異種移植因 γ δΤ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移而被排除。aAPC增殖/活化的多 克隆γ δτ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移被提議作為針對(duì)人類癌癥的免疫療法。為了模擬這種情況，NSG小 鼠接受腹膜內(nèi)（i .Ρ.)注射CA0V3-effLuc-mKate卵巢癌細(xì)胞，并且隨機(jī)化到處理組中。在植 入八天之后，為小鼠腹膜內(nèi)施用（升級(jí)劑量)媒介物、VSl、VS2、VSl neM2neg或多克隆γδΤ細(xì) 胞（圖18)。在實(shí)驗(yàn)期間用非侵入性生物發(fā)光成像(BLI)連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。已形成的腫瘤 (圖18Α上部圖和圖18Β)在媒介物(mock)處理的小鼠中繼續(xù)生長，但在用νδ 1(ρ = 〇.〇〇1)、νδ 2(?〈0.001)、￥5嚴(yán)^21^(?〈0.001)以及多克隆(？〈0.001)丫5!'細(xì)胞處理的小鼠中顯著減小 (圖18Α下部圖和圖18Β)。與mock處理的小鼠相比，用多克隆γδΤ細(xì)胞處理改善總存活率(ρ = 0.0001)，其中90%的小鼠在卵巢癌異種移植中存活下來并且未經(jīng)處理的小鼠的風(fēng)險(xiǎn)比 是20.4(圖18C)。這是首次將三個(gè)νδ亞群在體內(nèi)靶向腫瘤的能力相比較，并且是首次對(duì)νδ l negVS2neg Τ細(xì)胞關(guān)于體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)估?？傊?，γδΤ細(xì)胞在體內(nèi)治療癌癥中是有效 的，并且因此代表基于細(xì)胞的癌癥治療的一種替代方法。
[0142] 實(shí)施例2-材料和方法
[0143] 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物。HCT-116(目錄號(hào)CCL-247)、Kasumi-3(目錄號(hào)CRL-2725)以 及K562(目錄號(hào)CCL-243)細(xì)胞系是獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Col lection，ATCC; Manassas，VA) ajurkai^目錄號(hào)ACC 282)細(xì)胞系是獲自德國微生物菌種 保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkul turen，DSMZ ; Germany)。如先前所描述將K562基因修飾以充當(dāng)aAPC(克隆#4) (Manuri等，2010; Singh等， 2011KB細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病(B-ALL)細(xì)胞系cALL-2和RCH-ACV細(xì)胞系是來自博士 Jeff Tyner(0HSU)的禮物，胰腺癌細(xì)胞系（BxPC-3、CaPan-2、MiaPaCa-2以及Su8686)是由博 士Vi j i Ramachandran(MDACC)捐贈(zèng)，而卵巢癌細(xì)胞系（A2780、CA0V3、EF021、EF027、Hey、 IGR0V1、0AW42、0C314、0VCAR3以及UPN251)是由博士Robert C· Bast，Jr · (MDACC)提供。將細(xì) 胞培養(yǎng)物維持在（i )RPMI (Gibco，Grand Island NY):K562親本細(xì)胞、aAPC克隆#4、aAPC克隆 八6、&厶卩(：克隆厶3、&厶？(：克隆04、了1^1?^、。厶1^-2、1?01-厶(^、1^8咖卜3、厶2780 4卩0214卩027、 Hey、IGROV1、0C314、0VCAR3 以及UPN251，（ i i)DMEM(Sigma，St · Loui s，MO): 293-METR、CA0V3、 BxPC-3、CaPan-2、MiaPaCa-2、0AW42以及Su8686，或（i ii )McCoy ' s 5A(Sigma): HCT-116中。 各培養(yǎng)基補(bǔ)充有10 %熱滅活胎牛血清（Hyclone，Logan，UT)和1 % GLUTAMAX?-100 (GibcohUP^Sl和0AW42細(xì)胞補(bǔ)充有胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒溶液(Gibco)。將細(xì)胞在37°C下在 具有5 % C02的加濕條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0144] γ δΤ細(xì)胞的增殖。在被授予知情同意后通過Ficoll-Hypaque(GE：Healthcare)從健 康志愿者中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)和臍帶血(UCB) (Singh等，2008)。最初，用CD56微珠 (目錄號(hào) 130-050-401，Miltenyi Biotec,Auburn,CA)處理 108個(gè)解凍的PBMC，并且在LS柱 (目錄號(hào)130-042-401，Miltenyi Biotec)上分離，以耗盡培養(yǎng)物中的NK細(xì)胞。然后將來自 CD56耗盡分選的未標(biāo)記的細(xì)胞用TCRy /δ+Τ細(xì)胞分離試劑盒（目錄號(hào)130-092-892， Miltenyi Biotec)進(jìn)行標(biāo)記，并且放置于LS柱上以將未標(biāo)記級(jí)分中的γ δΤ細(xì)胞與附著于磁 體的其他細(xì)胞分離。在完全培養(yǎng)基(CM;RPMI，10%FBS，1 %GLUTAMAX?)中，以一個(gè)Τ細(xì) 胞對(duì)兩個(gè)經(jīng)過γ照射的（100Gy)aAPC(克隆#4)的比率在外源性IL-2(Aldeleukin; Novartis，Switzerland; 50U/mL，從添加 aAPC那天開始每周添加三次）和IL-21 (目錄號(hào) AF20021 ;Peprotech,Rocky Hill，NJ;30ng/mL，從添加 aAPC那天開始每周添加三次）存在下 刺激γδΤ細(xì)胞。在可溶性細(xì)胞因子存在下以每7天添加 aAPC持續(xù)2-5周連續(xù)地再刺激細(xì)胞。 在添加至T細(xì)胞培養(yǎng)物中之前，對(duì)基于aAPC克隆#4的CD19、CD64、CD86、CD137L&&eGFP(IL-15肽框內(nèi)融合到IgG4Fc莖部并且與eGFP共表達(dá)）的共表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證(Singh等，2011)。使用 熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來分離 νδ1(νδΓνδ2ηθ?；)、νδ2(νδΓ，δ2+)&&νδ1 ηθ?；νδ2ηθ?；(νδ1ηθ?；ν δ2η，群體，可將這些群體如上文在aAPC克隆#4的情況下刺激兩次，測(cè)定表型，并且用于功 能分析。源自UCB的γ δΤ細(xì)胞是通過FACS使用抗TCRy δ和抗⑶3單抗分離自解凍的單核細(xì) 胞，并且如同PBMC基于aAPC/細(xì)胞因子刺激五周。
[0145] γδΤ細(xì)胞基于aAPC的共培養(yǎng).為了評(píng)估γδΤ細(xì)胞對(duì)用于增殖的細(xì)胞因子的依賴 性，以105個(gè)γ δΤ細(xì)胞和2 X 105個(gè)aAPC(克隆#4)來啟動(dòng)共培養(yǎng)，然后添加到相等體積的（i) CM、（ii)CM和100U/mLIL-2、（ iii )CM和60ng/mL IL-21或（iv)CM、100U/mL IL-2以及60ng/mL IL-21中。在啟動(dòng)共培養(yǎng)之后九天，使用CELLOMETER?Auto T4細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Nexcelom， Lawrence，MA)計(jì)算T細(xì)胞數(shù)目以測(cè)定產(chǎn)率。用一種或多種共刺激分子將K562細(xì)胞基因修飾 以產(chǎn)生三種新的 aAPC(圖 2)。通過用 NUCLEOFECTOR? II(L〇nza，BaSel， Switzerland)和Kit V(目錄號(hào)VCA-1003，Lonza)核轉(zhuǎn)染將表達(dá)框內(nèi)融合至IL-15Ra的IL-15 肽的睡美人(SB)轉(zhuǎn)座子和SB11轉(zhuǎn)座酶共同電轉(zhuǎn)移至親本K562細(xì)胞(CD86 neg和CD137Lneg)中。 使用FACS來分離mIL15+細(xì)胞并且形成克隆(指定為克隆A6;mIL15+CD86 negCD137Lneg)，然后將 其用表達(dá)CD86或CD137L的SB11和SB轉(zhuǎn)座子進(jìn)行電穿孔。再次將細(xì)胞進(jìn)行FACS分選，以獲得 克隆A3(mIL15+CD86+CD137Lneg)和D4(mIL15+CD86negCD137L+)。在補(bǔ)充有 100U/mL IL-2和 60ng/mL IL-21的CM中以105個(gè)γ δΤ細(xì)胞啟動(dòng)共培養(yǎng)，并且添加至2 X 105個(gè)經(jīng)過γ照射的（i) 親本K562細(xì)胞、（ii)克隆A6、（iii)克隆A3、（iv)克隆D4、（v)克隆#4aAPC中或者(vi)無 aAPC。 在啟動(dòng)之后9天，如上文關(guān)于細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)所描述計(jì)算T細(xì)胞數(shù)目。
[0146] 流式細(xì)胞術(shù)。用詳述于表1中的抗體測(cè)定細(xì)胞的表型。使用同種型對(duì)照來驗(yàn)證設(shè) 門。在4 °C下，在FACS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水、2 %胎牛血清、0.1 %疊氮化鈉)進(jìn)行染色，持 續(xù)20-30min，并且在染色之前和染色之間用FACS緩沖液進(jìn)行兩次洗滌。在4°C下用BD CYTOFIX/CYTOPERM?(BD Biosciences，San Diego，CA)固定和透化20min后進(jìn)行胞內(nèi)染色。 在4°C下在Perm/Wash緩沖液、10%人類AB血清中進(jìn)行胞內(nèi)染色持續(xù)30min。分別按1: 20、1: 40、l:33以及l(fā):40稀釋倍數(shù)使用FITC、PE、PerCP/Cy5·5以及APC抗體。在FACSCalibur TM(BD Biosciences，San Jose,CA)上采集樣品并且用Flowjo軟件(版本7.6.3)進(jìn)行分析。
[0147] 根據(jù)DTEA的mRNA分子豐度和身份。在基于aAPC共培養(yǎng)后的指定時(shí)間，以每106個(gè)細(xì) 胞160yL RLT緩沖液(Qiagen)的比率將T細(xì)胞溶解，并且在-80°C下冷凍。將RNA溶解產(chǎn)物解 凍，并且立即使用NCOUNTER? 分析系統(tǒng)（NanoString Technologies，Seattle，WA)進(jìn) 行分析，該分析是在65°C下雜交最少12h之后進(jìn)行，使用多重靶標(biāo)特異性顏色編碼報(bào)告和生 物素化捕獲探針檢測(cè)感興趣的mRNA。由所選mRNA轉(zhuǎn)錄物的RefSeq登錄號(hào)產(chǎn)生兩個(gè)CodeSet， 并且使用這兩個(gè)CodeSet來產(chǎn)生用于設(shè)計(jì)者TCR表達(dá)陣列（DTEA)的特異性報(bào)告和捕獲探針 對(duì)。報(bào)告-捕獲NCOUNTER?探針對(duì)經(jīng)過確定：（i)因報(bào)告-捕獲探針對(duì)與非靶標(biāo)分子的 交叉雜交而使脫靶效應(yīng)降至最低程度，（ii)靶向特定基因的大多數(shù)(如果不是全部)的轉(zhuǎn)錄 物變體，并且（i i i )有效地雜交。針對(duì)外加陽性對(duì)照RNA和看家基因（ACTB、G6PD、0ΑΖ1、 P0LR1B、P0LR2A、RPL27、Rps 13以及TBP)將DTEA數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。由所有樣品的總和的平均值除 以單個(gè)樣品的計(jì)數(shù)的總和計(jì)算外加陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化因子。由所有樣品的幾何平均數(shù)的平均 值除以單個(gè)樣品的計(jì)數(shù)的幾何平均數(shù)計(jì)算外加陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化因子。報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)。
[0148] 細(xì)胞因子分泌。細(xì)胞因子的表達(dá)是通過胞內(nèi)染色進(jìn)行評(píng)估，并且細(xì)胞因子分泌至 組織培養(yǎng)物上清液中是通過LUM1NEX?多重分析進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于前者，在37°C下在0.6、 2.0以及6.0yg/mL的濃度下將γ δΤ細(xì)胞與正常小鼠血清(NMS; Jackson ImmunoResearch)或 TCR γ δ阻斷抗體（克隆頂MU51〇aM);Thermo Fisher,Pittsburg,PA) -起孵育lh。然后將T 細(xì)胞添加至相等體積和數(shù)目的靶細(xì)胞(CA0V3或0C314)中，產(chǎn)生0.3、1.0以及3.0yg/mL的最 終抗體濃度。將共培養(yǎng)物在37°C下在布雷菲德菌素-A(Bref eldin-A)(G〇lgiPlug;BD Biosciences)存在下孵育6h，以阻斷細(xì)胞因子的胞吐作用和分泌。然后，將共培養(yǎng)物（i)針 對(duì)表面標(biāo)記物（例如CD3、ΤΟ?δ1以及ΤΟ?δ2)進(jìn)行染色，（i i)用BD CYT0FIX/CYT0PERM?(目錄 號(hào)555028，BD Biosciences)固定并透化，（iii)針對(duì)胞內(nèi)IFNy進(jìn)行染色，并且（iv)通過流 式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。將用于評(píng)估細(xì)胞因子分泌的共培養(yǎng)在CM(mock處理)或白細(xì)胞活化混合 物(LAC;5ng/mL PMA和500ng/mL離子霉素）中孵育24h，并且將來自三個(gè)相同的孔的上清液 匯集起來并且使用ΙΧΙΜΙΝΕΧ??00(xMap Technologies，Austin，TX)通過BIO-PLBX? 人類細(xì)胞因子組I 27重分析（目錄號(hào)L50-0KCAF0Y，BioRad Technologies,Hercules,CA)進(jìn) 行分析。
[0149] 鉻釋放分析。如先前所描述，使用標(biāo)準(zhǔn)4-h CRA來評(píng)估體外特異性溶解(Singh等， 2011)。在每次分析當(dāng)天用CD19微珠（目錄號(hào)130-050-301，Miltenyi Biotec)分析來自健康 供體的B細(xì)胞，并且用作靶細(xì)胞。使用對(duì)NKG2D(克隆1D11;BD Biosciences)、DNAM1 (克隆 DX11;BD Biosciences)、TCRy δ(克隆B1;BD Biosciences)以及TCRy δ(克隆IM)具特異性 的抗體在CRA中按0.3、1.0以及3. Oyg/mL以12:1的E: T比率進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。在相同濃度下使 用匪S作為陰性對(duì)照，并且出于數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的目的使用不具有抗體的孔。
[0150]長期殺傷分析。將粘附腫瘤細(xì)胞(CA0V3或UPN251)以4Χ104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種 于12孔板中。第二天，向每個(gè)孔添加5 X 105 γ δΤ細(xì)胞，并且添加相等數(shù)目到不具有腫瘤細(xì)胞 (僅培養(yǎng)基）的孔中。腫瘤細(xì)胞的一個(gè)孔添加相等體積的CM作為生長的陽性對(duì)照。在2天后， 收獲上清液，將孔在PBS中洗滌，并且用胰蛋白酶-EDTA收獲剩余的腫瘤細(xì)胞并計(jì)算數(shù)目。將 剩余的腫瘤細(xì)胞的豐度針對(duì)mock處理的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0151] 慢病毒包裝和CA0V3細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)別處描述的方案(Turkman等，2011)的修改 版本包裝慢病毒顆粒以將增強(qiáng)的螢火蟲熒光素酶(effLuc)引入腫瘤細(xì)胞中，以便通過BLI 進(jìn)行非侵入性成像(Rabinovich等，2008)。簡(jiǎn)要地說，將包裝細(xì)胞(293-METR)涂鋪于T125燒 瓶上，并且在第二天用pCMV R8.2、VSV-G以及pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A(圖 19)質(zhì)粒 結(jié)合脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)制造商的說明（Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48和72h收集 病毒顆粒，并且通過l〇〇kDa NMWL濾波器（目錄號(hào)UFC810096，MilliPore，Billerica，MA)濃 縮。將CA0V3細(xì)胞涂鋪于6孔板中，并且在第二天用8yg/mL聚凝胺添加編碼effLuc-mKate的 病毒。將板以1，800rpm旋轉(zhuǎn)1.5h，并且在6h后，將病毒調(diào)節(jié)的上清液用DMEM完全培養(yǎng)基替 換，所述DMEM完全培養(yǎng)基在第二天改變。通過限制稀釋得到轉(zhuǎn)導(dǎo)的CA0V3的單細(xì)胞克隆，其 展示與親本細(xì)胞系相同的形態(tài)，并且選擇克隆1C2,因?yàn)樗哂懈?>10 6信噪比）effLuc活性 的均一mKate焚光。
[0152] 小鼠實(shí)驗(yàn)。在 NSG 小鼠（N0D.Cg-PrkdcscidI12r γ tmlWjl/SzJ; Jackson Laboratories)中評(píng)估體內(nèi)抗腫瘤功效。通過腹膜內(nèi)（i .p.)注射形成CA0V3-effLuc_mkate (克隆1C2;每個(gè)小鼠3X 106個(gè)細(xì)胞)腫瘤，并且將小鼠隨機(jī)分配到治療組中。在八天后(指定 為第〇天），以腹膜內(nèi)施用的γδΤ細(xì)胞和作為陰性對(duì)照的腹膜內(nèi)施用的PBS啟動(dòng)劑量升級(jí)方 案。Τ細(xì)胞劑量在第0天、第7天、第14天以及第21天分別為3X10 6、6X106、10W&1.5X107。 在實(shí)驗(yàn)過程期間進(jìn)行非侵入性BLI以連續(xù)測(cè)量在皮下施用D-Luciferin(目錄號(hào)122796， Caliper，Hopkinton，MA)之后如用 IVI.S?-100 成像儀(Caliper)所檢測(cè)的CA0V3_eff Luc-mKate的腫瘤負(fù)荷。使用LIVING IMAGE?軟件(版本2·50，Xenogen,Caliper)分析BLI。
[0153] 表1.所用的抗體。
[0156] 實(shí)施例3-討論
[0157] 這項(xiàng)研究形成了 aAPC克隆Μ作為用于針對(duì)惡性血液病和實(shí)體瘤保持廣泛反應(yīng)性 的多個(gè)γ δΤ細(xì)胞群體的持續(xù)增殖的細(xì)胞平臺(tái)。表現(xiàn)某種VSTCR用途的Τ細(xì)胞已與針對(duì)癌癥的 臨床反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。舉例來說，已直接輸注νδ?τ細(xì)胞來進(jìn)行治療。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，這些 細(xì)胞針對(duì)癌癥治療可介導(dǎo)抗腫瘤免疫并且支持νδ?τ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移。本發(fā)明人的增殖/活 化的νδ2Τ細(xì)胞展現(xiàn)最高的腫瘤細(xì)胞殺傷率和細(xì)胞因子產(chǎn)量。VSlnegVS2neg-T細(xì)胞在靶向腫瘤 中的作用是先前未知的;然而，本發(fā)明人的結(jié)果直接表明VSlnegVS2neg細(xì)胞展現(xiàn)抗腫瘤活性， 并且此亞群還可能對(duì)免疫功能低下的患者有益?？偟膩碚f，本文的數(shù)據(jù)推動(dòng)了維持所有νδ TCR類型的表達(dá)的γ δΤ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移作為腫瘤和機(jī)會(huì)性病毒感染的療法。
[0158] 可使用工程改造的aAPC來產(chǎn)生大量的維持多克隆TCR譜型并且具有殺死腫瘤但不 殺死正常細(xì)胞的能力的γ δΤ細(xì)胞。輸注多克隆γ δΤ細(xì)胞的方法進(jìn)一步受到aAPC產(chǎn)生展現(xiàn)包 括以下的一系列效應(yīng)功能的Tn、T?以及ΤΕΜγδΤ細(xì)胞的能力的支持:產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和 在體外和體內(nèi)針對(duì)腫瘤發(fā)揮直接細(xì)胞毒性。已制備克隆#4作為符合當(dāng)前良好制造規(guī)范 (cGMP)的主細(xì)胞庫，并且提供清晰的產(chǎn)生針對(duì)人類應(yīng)用的臨床級(jí)γ δΤ細(xì)胞的途徑。臨床試 驗(yàn)現(xiàn)在可(首次)測(cè)試針對(duì)實(shí)體和血液腫瘤維持TCRy δ治療的多克隆譜型并且具有治療感 染的潛力的Τ細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移的功效。
[0159] 實(shí)施例4-用于γ δΤ細(xì)胞的分離和增殖替代方案
[0160] 替代γ δΤ細(xì)胞分離程序。通過與順磁性微珠一起孵育并且在磁場(chǎng)存在下穿過由鐵 磁球(Miltenyi)組成的連續(xù)的柱子使來自患者血沉棕黃層的外周血單核細(xì)胞(PBMC)耗盡 CD56+自然殺傷(NK)細(xì)胞和αβΤ細(xì)胞。將剩余的細(xì)胞(其含有更大量的淋巴細(xì)胞群之中的γ δ Τ細(xì)胞)基于改性的Κ562活化和增殖細(xì)胞(aAPC)在IL-2和IL-21存在下進(jìn)行培養(yǎng)，從而引起 選擇性的γ δΤ細(xì)胞擴(kuò)增(參見圖20)。
[0161]此分離方法是有利的，因?yàn)棰?6珠粒與ΤΟ?αβ珠粒兩者均可用作臨床級(jí)試劑。所提 出的擴(kuò)增方案(在IL-2和IL-21存在下使用aAPC)是一樣的。
[0162] 將來自新鮮供體PBMC的CD3+T細(xì)胞與使用修改后的分離方案擴(kuò)增之后的細(xì)胞相比 較。最初，γ δΤ細(xì)胞在外周血中是少數(shù)群體。耗盡NK細(xì)胞和αβΤ細(xì)胞隨后基于aAPC增殖允許 γδΤ細(xì)胞擴(kuò)增（圖21)。
[0163] 在連續(xù)耗盡⑶56+和Τα?αβ+細(xì)胞之后從PBMC擴(kuò)增的γ δΤ細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的特 異性溶解在圖22中示出。γ δΤ細(xì)胞針對(duì)胰腺癌細(xì)胞系展現(xiàn)固有活性，而αβΤ細(xì)胞不展現(xiàn)。
[0164] 實(shí)施例5-用于γ δΤ細(xì)胞增殖的其他替代方案
[0165] 將使用不同的抗⑶3抗體克隆觸發(fā)γδΤ細(xì)胞，從而產(chǎn)生不同的結(jié)果（Dopfer等， 2014)。舉例來說，克隆0KT3可用于誘導(dǎo)從γδΤ細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，而克隆UCHT1可用于誘導(dǎo) 針對(duì)靶細(xì)胞的更大的細(xì)胞毒性。
[0166] γ δΤ細(xì)胞還將基于加載有0KT3、UCHT1或兩種抗體的aAPC在IL-2和IL-21存在下； 基于加載有〇KT3、UCHTl或兩種抗體的微珠在IL-2和IL-21存在下進(jìn)行增殖。
[0167] 在各種擴(kuò)增機(jī)制之后將測(cè)試γ δΤ細(xì)胞在體外和體內(nèi)抗擊各種癌細(xì)胞系和原發(fā)性 癌癥中的有效性。
[0168] 氺氺氺
[0169] 本文中公開和要求保護(hù)的所有方法均可在不進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)的情況下根據(jù)本公開 而完成和執(zhí)行。雖然已根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域 技術(shù)人員將顯而易知的是可針對(duì)本文所描述的方法和步驟或方法步驟的順序應(yīng)用各種變 化，而不會(huì)脫離本發(fā)明的概念、精神以及范圍。更具體地，顯而易見的是，既化學(xué)相關(guān)又生理 學(xué)相關(guān)的某些試劑可取代本文所描述的試劑，同時(shí)實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。所有這些對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的相似取代和修改均被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求書所限定的 本發(fā)明的精神、范圍以及概念之內(nèi)。
[0170] 參考文獻(xiàn)
[0171] 以下參考文獻(xiàn)以引用的方式具體地并入本文中，達(dá)到的程度是提供示例性程序或 對(duì)本文所闡述加以補(bǔ)充的其他細(xì)節(jié)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)胞組合物，其包含至少約1〇9個(gè)純化γ奵細(xì)胞，其中所述γ奵細(xì)胞： (a) 屬于νδ?、νδ2以及νδΓ，δ2ηθ?? TCR亞群； (b) 具有基本上相同的遺傳物質(zhì);并且 (c) 不含嵌合抗原受體。2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合物，其中所述組合物不含NK細(xì)胞或αβΤ細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合物，其中所述γ δΤ細(xì)胞表達(dá)CD3。4. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞組合物，其中所述γ δΤ細(xì)胞不表達(dá)CD57或PD-1。5. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組合物和藥學(xué)上可 接受的載劑。6. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組合物的方法，其包括： (a) 獲得包含第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群的細(xì)胞的樣品；以及 (b) 將所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)在白介素-2(IL-2)和白 介素-21(IL-21)存在下一起培養(yǎng)，由此制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組合物。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其還包括耗盡所述細(xì)胞樣品中的表達(dá)CD56和表達(dá)ΤΟ?αβ的 細(xì)胞。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞樣品是外周血樣品、臍帶血樣品或組織樣 品。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞樣品是獲自單一受試者。10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群包含約104至約106個(gè)γ δ Τ細(xì)胞。11. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述aAPC是轉(zhuǎn)基因 Κ562細(xì)胞。12. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述aAPC表達(dá)⑶137L。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述aAPC另外表達(dá)⑶19、⑶64、⑶86以及mIL15。14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述aAPC表達(dá)至少一種抗⑶3抗體克隆。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述至少一種抗CD3抗體克隆是0KT3和/或UCHT1。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述aAPC表達(dá)0KT3和UCHT1。17. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述aAPC被滅活。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述aAPC被照射。19. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述aAPC已經(jīng)過測(cè)試并且證實(shí)不含感染性物質(zhì)。20. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中將所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)包括 以約10:1至約1:10( γ δΤ細(xì)胞比aAPC)的比率培養(yǎng)所述細(xì)胞。21. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中的所述aAPC是每周補(bǔ)充的。22. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中將所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)包括 培養(yǎng)至少2周。23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中將所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群與aAPC-起培養(yǎng)使 得多克隆γ ST細(xì)胞的數(shù)目至少增加100倍。24. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(b)還包括用氨基二膦酸鹽處理所述培養(yǎng)物。25. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述γ δΤ細(xì)胞是人類γ δΤ細(xì)胞。26. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞組合物的方法，其包括： (a) 獲得包含第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群的細(xì)胞的樣品；以及 (b) 在至少一種抗CD3抗體克隆存在下并且另外在白介素-2(IL-2)和白介素-21(IL-21)存在下培養(yǎng)所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群，由此制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì) 胞組合物。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其還包括耗盡所述細(xì)胞樣品中的表達(dá)⑶56和表達(dá)TCRa0 的細(xì)胞。28. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種抗⑶3抗體克隆是0KT3或UCHT1。29. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種抗⑶3抗體克隆是0KT3和UCHT1。30. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種抗⑶3抗體克隆是表達(dá)于aAPC的表 面。31. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種抗CD3抗體克隆是在微珠的表面。32. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中培養(yǎng)所述第一多克隆γ δΤ細(xì)胞群包括培養(yǎng)至少2 周。33. -種治療患者的疾病的方法，其包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述 的細(xì)胞組合物或根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述疾病是癌癥。35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述癌癥是Τ細(xì)胞厶1^』411^1^、結(jié)腸癌、卵巢癌、 成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。36. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述疾病是病毒感染。37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述病毒感染是巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾 病毒(EBV)或人類免疫缺陷病毒(HIV)。38. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述疾病是細(xì)菌感染。39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疾病是敗血癥。40. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞組合物對(duì)于所述患者是同種異體的。41. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞組合物對(duì)于所述患者是自體同源的。42. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述患者已經(jīng)歷先前的抗癌治療。43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述患者處于緩解期。44. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述患者不具有所述癌癥的癥狀但包含可檢測(cè)的 癌細(xì)胞。45. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述患者是人類患者。46. -種治療患者的疾病的方法，其包括： (a) 根據(jù)如權(quán)利要求6-25中任一項(xiàng)所述的方法制備細(xì)胞組合物；以及 (b) 向有需要的患者施用有效量的所述細(xì)胞組合物。47. -種包含根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組 合物的組合物，其用于治療患者的疾病。48. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述疾病是癌癥。49. 如權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述癌癥是T細(xì)胞厶1^』41^、01^、結(jié)腸癌、卵巢 癌或胰腺癌。50. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述疾病是病毒感染。51. 如權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述病毒感染是巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴 爾病毒(EBV)或人類免疫缺陷病毒(HIV)。52. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述疾病是細(xì)菌感染。53. 如權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述疾病是敗血癥。54. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述細(xì)胞組合物對(duì)于所述患者是同種異體的。55. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述細(xì)胞組合物對(duì)于所述患者是自體同源的。56. -種根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群的用途，其用于制造用于治療疾病的 藥劑。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK105848484SQ201480063632
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年10月24日
【發(fā)明人】L·J·N·庫珀, D·C·丹尼格
【申請(qǐng)人】得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)