具有高水平麝香草酚的牛至克隆系的制作方法
【專利說(shuō)明】具有高水平麝香草酚的牛至克隆系
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年5月7日提交的題為"具有高水平麝香草酚的牛至克隆系"的美 國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/855,068的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用以其整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明大體涉及牛至(oregano)植物，且更具體地，涉及產(chǎn)生高量的麝香草酚的牛 至克隆系ΚΙ_0ν1850的植物。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 牛至(Orignaum sp.)作為傳統(tǒng)草藥、香料以及在傳統(tǒng)醫(yī)藥中已經(jīng)使用許多世紀(jì)。 牛至精油在若干應(yīng)用中被用作成分，包括牙膏、口腔洗液、口香糖等。牛至精油中的主要活 性分子是香芹酚和麝香草酚。已經(jīng)顯示這些分子具有潛在的抗微生物活性 1且已經(jīng)用作飼 料添加劑以改善農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的胃腸道健康。已經(jīng)顯示動(dòng)物飼料飲食中的牛至精油在豬2, 3中改 善生長(zhǎng)和繁殖表現(xiàn)以及在肉雞中改善整體表現(xiàn)。牛至油也用于若干個(gè)人護(hù)理應(yīng)用中。麝香 草酚也在蜂巢中用于生物防治瓦螨。
[0006] 精油在牛至和其它草中的積累隨著植物的發(fā)育階段而不同4。發(fā)現(xiàn)Orignaum onites中的最高香芹酚和麝香草酚含量在開花前階段 5。然而，另外的研究報(bào)道在六月中旬 開花后和種子形成階段期間的最高香芹酚和麝香草酚含量6。
[0007] 盡管受遺傳學(xué)控制，所述生物活性分子強(qiáng)烈地受到特定生長(zhǎng)區(qū)域的環(huán)境影響；且 還受到農(nóng)藝條件、收獲時(shí)間和加工類型的影響4。收獲的時(shí)候植物的年齡似乎影響油產(chǎn)量和 組成。獲得自較年輕植物的牛至油的總麝香草酚和香芹酚含量高于成熟植物的含量 4。植物 接受的水的量對(duì)提取自墨西哥牛至(Mexican oregano)的油的麝香草酚和香芹酚含量沒(méi)有 顯著作用7。
[0008] 已經(jīng)研究了溫度和日照持續(xù)施加對(duì)牛至精油的生物活性組分的作用。像許多其他 物種一樣，在較高溫度、光強(qiáng)度和更長(zhǎng)日長(zhǎng)周期生長(zhǎng)的牛至植物傾向于具有增加的油含 量 8。收獲時(shí)間對(duì)于在牛至中最大化精油產(chǎn)量和其主要組分濃度是關(guān)鍵的。香芹酚和麝香草 酚含量一般在夏季月份要高得多 8。
[0009] 正在進(jìn)行的遺傳學(xué)改進(jìn)聚焦于增加精油，而很少或沒(méi)有進(jìn)行改良牛至以更好生產(chǎn) 香芹酚、麝香草酚或其它抗微生物或抗氧化分子的努力。從超積累的牛至克隆系提取麝香 草酚對(duì)于經(jīng)濟(jì)可行的商業(yè)化麝香草酚生產(chǎn)是關(guān)鍵的。因此，開發(fā)具有高水平的麝香草酚并 具有高生物量的牛至品種將提供具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的麝香草酚來(lái)源。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明由名為KI-0V1850的牛至植物組成，其具有升高的麝香草酚水平、優(yōu)異的活 力和整體農(nóng)藝穩(wěn)健性。從獲得自正在分離的牛至的商品來(lái)源的種子選擇和繁殖出該品種。 選擇具有升高的麝香草酚水平和良好生長(zhǎng)習(xí)性的植物并無(wú)性繁殖以產(chǎn)生相同的植物的克 隆系。
[0012]克隆系KI-0vl850的植物在全部可能的環(huán)境條件下均沒(méi)有被觀察到過(guò)。隨著環(huán)境 和培養(yǎng)例如溫度、光強(qiáng)、日長(zhǎng)、水狀態(tài)和/或肥料比例或類型的差異，表型可能有點(diǎn)不同，然 而沒(méi)有基因型的任何變化。
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)目的是具有高水平麝香草酚的植物，其在人和動(dòng)物食物、飲料、個(gè)人 護(hù)理和家居護(hù)理產(chǎn)品中作為抗微生物和抗氧化劑使用。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是牛至的克隆系，其是新穎的、穩(wěn)定的和一致的并具有良好的 農(nóng)藝特性，允許高效培育該品種，作為產(chǎn)生能夠提取麝香草酚的高生物量的作物。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1是比較溫室生長(zhǎng)和田間生長(zhǎng)的植物中香芹酚和麝香草酚含量的圖表。
[0017] 圖2是所選定的牛至品系中香芹酚/麝香草酚含量的季節(jié)性差異的圖表。
[0018] 圖3是選定的牛至品系的相對(duì)表型活力得分的圖表。
[0019]圖4是品種KI -Ov 1850的植物的葉的長(zhǎng)度針對(duì)厘米比例尺的照片。
[0020]圖5是品種KI -Ov 1850的植物的葉的寬度針對(duì)厘米比例尺的照片。
[0021]圖6是品種KI -Ov 18 50的側(cè)枝的照片。
[0022] 圖7是品種KI_0vl850的色譜圖。
[0023] 圖8是現(xiàn)有技術(shù)希臘牛至(Greek Oregano)的色譜圖。
[0024] 圖9是品種KI_0vl850的色譜圖。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 我們之前從大規(guī)模遺傳篩選研究中鑒定了專有的牛至克隆系，其能夠在溫室條件 下積累高水平的香芹酚(Hi-C)或高水平的麝香草酚(Hi-T品系）。在田間條件下生長(zhǎng)這些 Hi-C和Hi-T牛至克隆系并在生長(zhǎng)季節(jié)期間測(cè)量香芹酚和麝香草酚積累以及總體生物量積 累。靶分子積累、生物量產(chǎn)生和繁殖能力已被用于鑒別用于商業(yè)應(yīng)用的最佳克隆系。
[0027]本發(fā)明的植物鑒定自野生牛至群體并且分類學(xué)描述為牛至屬（Origanum)，未知 種，唇形科(Lamiaceae)和通用名牛至。表2示出取自生長(zhǎng)于溫室的植物的植物性狀描述，且 表1示出表2性狀的定義。
[0028] 表1-性狀的描述
[0032] 在一實(shí)施方式中，植物KI-0vl850在活躍生長(zhǎng)季節(jié)(5月至9月）期間產(chǎn)生麝香草酚， 包含4% (基于干物質(zhì)）。
[0033]本發(fā)明涉及新穎的、穩(wěn)定的、一致的旺盛生長(zhǎng)的穩(wěn)健牛至植物KI-0vl850的開發(fā)。 該植物是特異的并且明顯區(qū)別于全部其它已有的牛至品種。
[0034] 實(shí)施例1-克隆系的選擇和開發(fā)
[0035] 材料和方法
[0036] 專有的牛至克隆系。選擇從之前的遺傳學(xué)篩選鑒定的17種牛至選擇物在靠近 Indianola，Iowa的田間位置在田間條件下種植。在溫室條件生長(zhǎng)的14個(gè)高香芹酚(Hi-C)牛 至克隆系的香芹酚含量和3個(gè)高麝香草酚(Hi-T)克隆系的麝香草酚含量在表3中給出。 [0037] 表3.在溫室生長(zhǎng)的所選定的牛至克隆系的香芹酚和麝香草酚含量
[0039] -表示無(wú)法檢測(cè)的水平
[0040] 田間小區(qū)（field plot)的建立。2011年5月末在德克薩斯的繁殖溫室以根插無(wú)性 繁殖選定的牛至克隆系用于移植。代表17種選擇物的大約38，000株植物在2011年5月-6月 被移植至Indianola，Iowa附近共3.1英畝的田間小區(qū)。采用多種雜草控制策略，包括機(jī)械耕 地、人工芯吸(wicking)草甘膦、人工鋤地、撒播選擇性除草劑(Poast)以及最后噴播針對(duì) 草、蒲闊葉樹和雜草種子萌發(fā)的罐混合物(Poast/Basagran/Sinbar)。
[0041] 組織取樣。在完全建立之后在2011年9月期間從各選擇物收集葉組織一次用于香 芹酚和麝香草酚分析。在2012年的生長(zhǎng)周期期間，從2012年4月至9月每?jī)芍苁占淮蝸?lái)自 各克隆系的葉組織。從各克隆系收集頂部4"-6"的葉組織(包括莖）；空氣干燥48小時(shí)并送去 分析。使用經(jīng)開發(fā)并經(jīng)驗(yàn)證的用于測(cè)定牛至干燥葉組織中香芹酚和麝香草酚的快速方法來(lái) 定量這些品系中的香芹酚和麝香草酚含量。從代表各克隆系的各批葉組織樣品進(jìn)行三次重 復(fù)提取?；诿繂挝桓芍卮_定香芹酚和麝香草酚含量且計(jì)算平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
[0042]表型活力評(píng)分。全部克隆系針對(duì)它們的整體活力和生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)分，基于范圍為1-5 的肉眼評(píng)估。對(duì)具有非常差活力和生長(zhǎng)的牛至品系給出評(píng)分為1;而對(duì)具有最佳活力和生長(zhǎng) 的牛至品系給出評(píng)分為5。
[0043] 數(shù)據(jù)分析。使用Stat Centurion Graphics對(duì)獲得自17個(gè)克隆系的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析以確定克隆系之間香芹酚和麝香草酚積累的差異。使用普通線性模型分析香芹酚和 麝香草酚含量。費(fèi)氏最小顯著差數(shù)(LSD)用于區(qū)分平均值并且使用多范圍檢驗(yàn)計(jì)算。
[0044] 結(jié)果
[0045] 香芹酚和麝香草酚的差異。對(duì)于香芹酚和麝香草酚含量?jī)烧?，克隆系之間存在顯 著差異(表4)。每個(gè)克隆系的取樣時(shí)間對(duì)于香芹酚和麝香草酚含量也有顯著差異。也觀察到 顯著的基因型(克隆系)x取樣日期(表4)。
[0046] 表4.在不同日期取樣的基因型之間香芹酚和麝香草酚含量的方差分析(ANOVA)
[0048] 在第1年的香芹酚和麝香草酚含量。在2011年5月期間移植所述克隆系的田間小區(qū) 并在2011年8月前建立。從第1年生長(zhǎng)收集的葉組織樣品顯示合理的香芹酚/麝香草酚含量， 盡管經(jīng)歷了移植脅迫、大雨和水澇土壤(圖1)。
[0049] 在第2年的香芹酚和麝香草酚含量。在貫穿第2年的生長(zhǎng)季節(jié)期間監(jiān)測(cè)克隆系的香 芹酚和麝香草酚含量。從4月至9月每半個(gè)月（或每?jī)蓚€(gè)月）收集的葉組織的香芹酚和麝香草 酚含量示于表5?？寺∠档南闱鄯雍枉晗悴莘雍吭谏L(zhǎng)季節(jié)期間隨著生長(zhǎng)階段而變化。在 4月的春季再生長(zhǎng)期間，與克隆系無(wú)關(guān)，香芹酚和麝香草酚含量處于最低水平。從4月開始在 所有克隆系中觀察到香芹酚和麝香草酚含量的逐漸增加并在6月達(dá)到最大水平。
[0050] 橫跨克隆系和取樣時(shí)間，最高香芹酚含量為在克隆系KI-0V1750中的大約7%。該 克隆系從5月至9月持續(xù)積累最高水平的香芹酚;之后是KI-〇 V1791、KI-〇vl843、KI-〇vl721 和KI-〇vl835。在所種植的三個(gè)Hi-T品系中，克隆系KI-〇vl855在冬天沒(méi)能很好存活;而克隆 系KI-0vl850顯示最高水平的麝香草酚積累，基于干物質(zhì)>5%。牛至的麝香草酚超積累克隆 系比香芹酚超積累系更加罕見(jiàn)且更難以發(fā)現(xiàn)。
[0051]全部品系在2012年收獲兩次;第一次收獲在6月的第1周期間而第二次收獲在9月 的第 1 周期間。五個(gè)Hi-C品系 1(1-〇1750、1(1-〇1721、1(1-〇1791、1(1-〇1843和1(1-〇1835顯 示最高的香芹酚含量，KI-0vl750在收獲時(shí)最高。在9月的第2次收獲期間再次觀察到類似趨 勢(shì)。在第2次收獲的時(shí)候，KI-0vl750比其它Hi-C克隆系具有顯著更高的香芹酚水平。在另一 方面，在克隆系KI-0vl850中僅在6月觀察到最大麝香草酚積累（5.16%)且該含量在9月的 第2次收獲時(shí)降低50 %。
[0052] 表5.4月至9月§收集的克隆系的香芹酚％和麝香草酚％
[0054] ￡KI-0vl850 和 KI-O2098代表 Hi-T 品系
[0055] §攜帶不同上標(biāo)的均值顯著不同（p〈0.05)。
[0056] 五個(gè)Hi-C克隆系（1750、1721、1791、1835和1843)中香芹酚含量的逐漸增加；以及 克隆系KI-0vl850中的麝香草酚含量示于如下圖2。全部Hi-C克隆系在6月的第1周以及再次 在8月的最后1周顯示最高水平的香芹酚含量。Hi-T克隆系KI-0vl850在6月顯示最高麝香草 酚含量，隨后在夏季沒(méi)有第二個(gè)峰。
[0057]對(duì)現(xiàn)有技術(shù)希臘牛至（圖8)和本發(fā)明（圖9)進(jìn)行HPLC，證明本主題品系的低香芹酚 含量和高麝香草酚含量。
[0058]表型活力評(píng)分。全部克隆系在生長(zhǎng)周期期間對(duì)整體植物活力和生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)分?？?隆系（1843、1791、1835和1750)在整個(gè)生長(zhǎng)周期持續(xù)展現(xiàn)旺盛生長(zhǎng)（圖3)。在全部品系中， KI-〇vl843比其它品系開花早得多。
[0059] 討論
[0060]之前，我們?cè)跍厥覘l件下鑒別了若干專有的Hi-C(14個(gè)具有香芹酚含量>4%的克 隆系)和Hi-T(3個(gè)具有麝香草酚含量>3%的克隆系）牛至克隆系。2011年期間在Iowa生長(zhǎng)這 些品系以監(jiān)測(cè)在田間條件下香芹酚和麝香草酚的積累。了解香芹酚和麝香草酚含量在生長(zhǎng) 季節(jié)期間