養(yǎng)基成分為MS+6-BA1 · 0mg/L+NAA0 · 5mg/L+30g/L蔗糖+ 8g/L瓊脂，附加0.2g/L AC，pH值為5.6，褐化率僅為2.5%，而添加 PVP的褐化率為17.6;暗培 養(yǎng)條件下褐化率為22.6 %
[0043] 3.叢生芽的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：
[0044] 待初代培養(yǎng)的外植體新稍長(zhǎng)到2~3cm時(shí)，將其切取并接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 30~45天大量腋芽萌發(fā)并生長(zhǎng)，每4周左右將大芽叢分割并在相同的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，即 可獲得大量的叢生芽;叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+30g/L蔗糖+7g/ L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度30001x，光照16~18h/d，溫度25°C ;
[0045] 4.生根培養(yǎng):挑選3~4cm高的試管苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，暗處理3天后置于正常 光周期下培養(yǎng)，25-32天即可得到5條以上根長(zhǎng)4cm以上的生根苗，如圖5所示;生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA0 · 2mg/L+IBA0 · 5mg/L+20g/L 蔗糖+6g/L 瓊脂+0 · 2g/L 活性炭。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng) 度20001x，光照18h/d，溫度25°C。生根培養(yǎng)階段，組培苗的褐化率低于2.5 %。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 1.外植體預(yù)處理和消毒：
[0048]選取金邊黃楊幼嫩不帶腋芽的莖段作為外植體，用4°C洗衣粉水中浸泡30分鐘，再 用4 °C流水沖洗1小時(shí)，在超凈臺(tái)上將外植體置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)75 %酒精中浸泡30 s，無菌水沖洗 一至兩次，再置于4°C0.1%升萊溶液中浸泡，浸泡時(shí)間設(shè)置5min，8min，12min，15min，25min 五個(gè)梯度，其中升汞溶液中需加入lmL吐溫-80,無菌水沖洗4~5次，用無菌濾紙將多余水分 吸干。外植體均接種在成分為MS+6-BA2 · 0+ΝΑΑ0 · 5mg/L+30g//L蔗糖+6g//L瓊脂+0 · 2g/L活性 炭的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件同實(shí)施例1，兩周統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率以及出愈率。
[0049]表3不同升汞消毒時(shí)間對(duì)金邊黃楊無腋芽莖段初代培養(yǎng)的影響
[0051 ]由本試驗(yàn)可知，升汞消毒8min是金邊黃楊無腋芽莖段最佳消毒時(shí)間。
[0052] 2.愈傷組織的誘導(dǎo)：
[0053]將莖段在超凈臺(tái)上切成1~2cm的小段，橫接在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種3 ~4個(gè)外植體。培養(yǎng)室溫度為25°C，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度8001x;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成 分為MS+6-BA2 · 0+NAA1 · 0mg/L+30g/L蔗糖+6g//L瓊脂+0 · 2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5 · 6。3 · 愈傷組織的繼代與分化：
[0054]將長(zhǎng)到直徑3cm左右的愈傷組織塊切成直徑lcm左右的小塊，置于愈傷組織增殖培 養(yǎng)基上，每30天左右在相同培養(yǎng)基上繼代一次，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L +30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8;繼代過程中愈傷組織會(huì)由黃綠色轉(zhuǎn)為翠綠色，將 其轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基中，20~35天即可出現(xiàn)芽點(diǎn)，隨后分化為不定芽，愈傷組織分化培養(yǎng)基 為6-BA2.5mg/L+NAA0. lmg/L+20~30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光 照強(qiáng)度25001x，光照16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，溫度25°C。
[0055] 4.生根培養(yǎng)：
[0056] 切取3cm左右生長(zhǎng)健壯的新梢轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，暗處理3天后再轉(zhuǎn)接光下培 養(yǎng)，培養(yǎng)3周左右得到4條以上根長(zhǎng)4cm以上完整再生苗;生根培養(yǎng)基為l/2MS+NAA0.2mg/L+ ΙΒΑ0 · Smg/l^Og/l蔗糖+6g/L瓊脂+0 · 2g//L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5 · 8。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng) 度20001x，光照18h/d，溫度25°C，生根培養(yǎng)階段，組培苗的褐化率低于2.5%。
[0057] 將上述實(shí)施例1和實(shí)施例2所得的再生苗經(jīng)常規(guī)煉苗后即可獲得移栽苗進(jìn)行分別 移栽。實(shí)施例1的移栽苗在成株后經(jīng)表型觀察發(fā)現(xiàn)，其表型與種苗的遺傳形狀基本保持一 致，因此能產(chǎn)生大量無病害且遺傳性狀一致的種苗。而經(jīng)實(shí)施例2方法獲得的移栽苗在成株 后經(jīng)表型觀察發(fā)現(xiàn)變異率較高，可用于擴(kuò)大種質(zhì)資源，促進(jìn)新品種選育。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種金邊黃楊快繁體系構(gòu)建方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行： 1) 外植體的預(yù)處理與消毒 取帶幼嫩頂芽的當(dāng)年生枝條，將其周圍的葉片剪去，進(jìn)行預(yù)處理和消毒，備用； 2) 外植體初代培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo) 將消毒好的莖尖、帶腋芽的莖段接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)，將不帶腋芽的莖 段部分接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生;培養(yǎng)條件為光強(qiáng)800~ΙΟΟΟΙχ，光 照 16 ~18h/d，溫度 25°C; 3) 叢生芽的誘導(dǎo)和愈傷組織增殖分化 A、 將步驟2)中生長(zhǎng)到2~3cm長(zhǎng)的新梢切下，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30~45天腋 芽大量萌發(fā)形成叢生芽，每隔4周將叢生芽切割成多個(gè)小芽叢，接種在相同的培養(yǎng)基上繼代 培養(yǎng);培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度2500~30001x，光照16~18h/d，溫度25~27°C ; B、 將步驟2)中直徑3cm左右大小的愈傷組織切割成lcm小塊接種在愈傷組織繼代培養(yǎng) 基中，當(dāng)繼代的愈傷組織轉(zhuǎn)為翠綠色即可接種到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成不定芽； 培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度2500~30001x，光照16~18h/d，溫度25~27°C ; 4) 生根培養(yǎng) 將步驟3)生長(zhǎng)到2~3cm左右的健壯的新梢切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)生根， 最終獲得完整再生植株，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度20001x，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，溫度25°C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1)外植 體預(yù)處理方法是將葉片除去只留下裸芽和裸莖，在洗衣粉水中浸泡20~40分鐘，再流水沖 洗1~2小時(shí)；消毒方法為在超凈臺(tái)上將外植體置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精中浸泡20~30s，無菌 水沖洗一至兩次，再置于250mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液中浸泡6分鐘，其中升汞溶液中需加 入0.5~lmL吐溫-80，升汞消毒完畢后再用無菌水沖洗4~5次，最后用無菌濾紙將多余水分 吸干。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟2)中啟 動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+6-BA2 · 0~3 · 0mg/L+NAA0 · 2~0 · 6mg/L+20~30g/L蔗糖+6~8g/L瓊脂+0 · 1 ~0.2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5.8~6.0 ;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為：MS+6-BAl. 0~ 2 · 0mg/L+NAA0 · 5~1 · 0mg/L+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0 · 1 ~0 · 2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5 · 6 ~5.8;愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，不帶腋芽的莖段要橫插入培養(yǎng)基中。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟3)中叢 生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA1 · 0mg/L+NAA0 · 05~0 · 2mg/L+20~30g/L蔗糖+6~8g/L瓊脂，培 養(yǎng)基pH值為5 · 6~5 · 8;愈傷組織增殖培養(yǎng)基為:MS+6-BA2 · 0mg/L+NAA0 · 5~0 · 8mg/L+20~ 30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.6~5.8;愈傷組織分化培養(yǎng)基為:6-BA2.0~3.0mg/L +ΝΑΑ0 · 1 ~0 · 5mg/L+20 ~30g/L+30g 蔗糖+6g/L 瓊脂，培養(yǎng)基 pH 值為5 · 6 ~6 · 0。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4)中生 根培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA0 · 1 ~0 · 5mg/L+IBA0 · 5~1 · 0mg/L+20~30g/L 蔗糖+6g/L 瓊脂+0 · 2g/ L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5.6~6.0;接種的新稍莖段基部要有切口，接種后要暗培養(yǎng)3天。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種以金邊黃楊莖尖及莖段為外植體進(jìn)行組培快繁的方法。本方法對(duì)莖尖和帶腋芽的莖段通過誘導(dǎo)叢生芽、生根培養(yǎng)獲得完整再生植株；對(duì)于不帶腋芽的莖段部分依次經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的增殖分化、生根培養(yǎng)，從而獲得再生植株。本方法可以通過兩種途徑獲得再生植株，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)過程中污染率低，褐化率低，能夠不受季節(jié)與環(huán)境限制在短時(shí)間內(nèi)獲得大量種苗，克服扦插繁殖的缺點(diǎn)，同時(shí)也為其遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞無性系變異育種提供了條件，在理論研究和園林應(yīng)用上均具有重大的實(shí)用價(jià)值。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105613288
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510999046
【發(fā)明人】蔡永萍, 程曦, 孫寧, 金青, 程俊, 林毅
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2015年12月24日