一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用金邊黃楊莖尖及莖段進(jìn)行 組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金邊黃楊(Euonymus Japonicus cv.Aure〇-ma)，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物，別名金邊 冬青衛(wèi)矛，為大葉黃楊的變種之一，單葉對(duì)生，倒卵形或橢圓形，邊緣具鈍齒，表面深綠色， 葉邊緣為金黃色，有光澤，十分具有觀賞價(jià)值。金邊黃楊喜光，稍耐陰，適應(yīng)性強(qiáng)，萌芽力和 發(fā)枝力強(qiáng)，耐修剪，是優(yōu)良的園林綠化樹種，在各大城市、公園、高校和小區(qū)均有大量種植， 種苗需求量大。金邊黃楊目前常以扦插的方法進(jìn)行繁殖，但是扦插繁殖受季節(jié)、材料等限 制，扦插過程中容易感染病害，而且所獲得的植株壽命會(huì)縮短，尤其木本植物扦插還會(huì)出現(xiàn) 偏冠的現(xiàn)象，所以長期扦插繁殖會(huì)造成植株退化、樹齡縮短以及大量感染病害。
[0003] 而通過組織培養(yǎng)來進(jìn)行快繁，不僅不受季節(jié)環(huán)境的影響，能克服木本植物生長周 期長的缺點(diǎn)，而且也能為金邊黃楊體細(xì)胞無性系變異育種、誘變育種和基因工程育種奠定 基礎(chǔ)，為創(chuàng)造出多種色彩、抗逆性強(qiáng)的新品種提供條件。另一方面，植物莖尖部分所帶病毒 極少，利用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)可以獲得大量脫毒苗，可以在一定程度上減少農(nóng)藥使用，不僅 節(jié)約成本降低了空氣污染，還對(duì)金邊黃楊種質(zhì)保純、復(fù)壯有著重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種以金邊黃楊莖尖及莖段為外植體進(jìn)行組 培快繁的方法，該方法可以通過愈傷組織和非愈傷組織兩種途徑獲得金邊黃楊再生植株， 對(duì)工廠化育苗有著重要意義。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0006] -種金邊黃楊快繁體系構(gòu)建方法，該方法按以下步驟進(jìn)行：
[0007] 1)外植體的預(yù)處理與消毒
[0008] 取帶幼嫩頂芽的當(dāng)年生枝條，再將其周圍的葉片剪去，進(jìn)行預(yù)處理和消毒，備用；
[0009] 2)外植體初代培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)
[0010]將消毒好的莖尖、帶腋芽的莖段、不帶腋芽的莖段接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上進(jìn)行初代 培養(yǎng)，將不帶腋芽的莖段接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生;培養(yǎng)條件為光 強(qiáng)800~10001X，光照 16~18h/d，溫度25 °C ;
[0011] 3)叢生芽的誘導(dǎo)和愈傷組織增殖分化
[0012] A、將步驟2)中長到2~3cm長的新梢切下，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30~45天 腋芽大量萌發(fā)形成叢生芽，每隔4周將叢生芽切割成多個(gè)小芽叢，接種在相同的培養(yǎng)基上繼 代培養(yǎng);培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度2500~30001x，光照16~18h/d，溫度25~27°C ;
[0013] B、將步驟2)中直徑3cm左右大小的愈傷組織切割成1cm小塊接種在愈傷組織繼代 培養(yǎng)基中，當(dāng)繼代的愈傷組織轉(zhuǎn)為翠綠色即可接種到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成不 定芽;培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度2500~30001x，光照16~18h/d，溫度25~27°C ;
[0014] 4)生根培養(yǎng)
[0015] 將步驟3)生長到2~3cm左右的健壯的新梢切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo) 生根，最終獲得完整再生植株，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度20001x，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，溫度 25。。。
[0016] 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金邊黃楊快繁體系的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1) 外植體預(yù)處理方法是將葉片剪去只留下裸芽和裸莖，在洗衣粉水中浸泡20~40分鐘，再流 水沖洗1~2小時(shí)；消毒方法為在超凈臺(tái)上將外植體置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精中浸泡20~30s， 無菌水沖洗一至兩次，再置于250mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液中浸泡6分鐘，其中升汞溶液中 需加入0.5~lmL吐溫-80，消毒的外植體要確保被升汞溶液浸沒，升汞消毒完畢后用無菌水 沖洗4~5次，最后用無菌濾紙將多余水分吸干。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟2)中啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+6-BA2 · 0~3 · 0mg/L+NAA0 · 2~0 · 6mg/L +20~30g/L蔗糖+6~8g/L瓊脂+0.1~0.2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5.8~6.0;愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基成分為:MS+6-BA1 · 0~2 · 0mg/L+NAA0 · 5~1 · 0mg/L+30g/L鹿糖+6g/L瓊脂+0 · 1 ~ 0.2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5.6~5.8;愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，不帶腋芽的莖段要橫插入培養(yǎng)基 中。
[0018] 作為優(yōu)選，所述步驟3)中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05~ 0.2mg/L+20~30g/L蔗糖+6~8g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.6~5.8;愈傷組織增殖培養(yǎng)基為： MS+6-BA2 · 0mg/L+NAA0 · 5~0 · 8mg/L+20~30g/L 蔗糖+6g/L 瓊脂，培養(yǎng)基 pH 值為5 · 6~5 · 8;愈 傷組織分化培養(yǎng)基為：6-BA2 · 0~3 · 0mg/L+NAA0 · 1 ~0 · 5mg/L+20~30g/L+30g蔗糖+6g/L 瓊 月旨，培養(yǎng)基pH值為5.6~6.0。
[0019] 作為優(yōu)選，所述步驟4)中生根培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA0.1~0.5mg/L+IBA0.5~ 1.0mg/L+20~30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.2g/L活性炭，培養(yǎng)基pH值為5.6~6.0;接種的新稍莖 段基部要有切口，接種后要暗培養(yǎng)3天。
[0020] 本發(fā)明與已有技術(shù)相比，其有益效果體現(xiàn)在：
[0021] 1.本發(fā)明應(yīng)用組織培養(yǎng)的手段進(jìn)行金邊黃楊快速繁殖，不受季節(jié)環(huán)境限制，可以 克服金邊黃楊苗扦插繁殖過程中容易感染病害的缺點(diǎn)，而且扦插繁殖往往會(huì)使獲得的植株 壽命會(huì)縮短，木本植物還會(huì)出現(xiàn)偏冠的現(xiàn)象。
[0022] 2、.利用小的莖尖培養(yǎng)不但有脫毒效果，而且莖尖可以直接分化成苗，生長周期短 (2至3個(gè)月即可生根移栽成活），表型觀察變異率低，從而能產(chǎn)生大量無病害且遺傳性狀一 致的種苗。而通過愈傷組織途徑獲得試管苗，可能會(huì)發(fā)生無性系變異，從而產(chǎn)生不同表型的 突變體，可以擴(kuò)大種質(zhì)資源，促進(jìn)新品種選育。
[0023] 3.本方法可以通過不同外植體進(jìn)行再生，材料利用率高，培養(yǎng)基激素配比合理，試 管苗萌發(fā)率高，長勢(shì)旺盛。
[0024] 4.本發(fā)明使用的消毒方法可以兼顧成活率、污染率和褐化率，可以達(dá)到高萌發(fā)率， 低污染率及褐化率。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明方法流程圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明方法誘導(dǎo)的金邊黃楊叢生芽；
[0027] 圖3為本發(fā)明方法誘導(dǎo)的金邊黃楊愈傷組織；
[0028] 圖4為本發(fā)明方法愈傷組織分化的金邊黃楊不定芽。
[0029] 圖5為本發(fā)明方法誘導(dǎo)生根的金邊黃楊試管苗。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 1.外植體預(yù)處理和消毒：
[0032] 從苗圃里選取生長健壯、無病蟲害的枝條，選取幼嫩的莖尖及帶腋芽的莖段作為 外植體。將外植體去除成熟葉片，用4°C洗衣粉水中浸泡40分鐘，再用4°C流水沖洗1小時(shí)，在 超凈臺(tái)上將外植體置于75%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗一至兩次，再置于4°C質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1 %升萊溶液中浸泡，浸泡時(shí)間設(shè)置4min，6min，8min，15min和25min五個(gè)梯度，其中升萊 溶液中需加入lmL吐溫-80，無菌水沖洗4~5次，用無菌濾紙將多余水分吸干;待轉(zhuǎn)入初代培 養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0033]為了選擇最適預(yù)處理?xiàng)l件，將不同消毒時(shí)間處理的外植體均接種在成分為1^+6_ BA2 · 5mg/L+NAA0 · 5mg/L+30g//L蔗糖+8g//L瓊脂+0 · 2g//L活性炭的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基pH值為 5.6，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)8001x，光照16h/d，溫度25°C，兩周后統(tǒng)計(jì)褐化率、污染率、萌發(fā)率(表 1) 〇
[0034]表1不同升汞消毒時(shí)間對(duì)金邊黃楊頂芽與帶腋芽莖段初代培養(yǎng)的影響
[0036]從本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，消毒升汞消毒6分鐘可以在保證高萌發(fā)率、低褐化率的同 時(shí)，達(dá)到較好的殺菌效果。
[0037] 2.初代培養(yǎng)：
[0038] 將莖尖或者帶腋芽的莖段在超凈臺(tái)上切成1~2cm的小段，形態(tài)學(xué)上端向上接種在 啟動(dòng)培養(yǎng)基上；每瓶接種3~4個(gè)外植體。培養(yǎng)室溫度為25°C，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度 ΙΟΟΟΙχ;啟動(dòng)培養(yǎng)基成分為MS+6-BA2 · 5+NAA0 · 5mg/L+30g//L蔗糖+8g/L瓊脂，pH值為5 · 6，另 外以帶腋芽莖段為對(duì)象，通過三種處理探究最佳金邊黃楊褐化防控措施(表2);接種10天后 莖尖的頂芽或莖段的腋芽發(fā)生萌動(dòng)，培養(yǎng)30~40天新梢可長到2~3cm;
[0039] 表2金邊黃楊組織培養(yǎng)褐化控制方式
[00411注:供試材料升汞消毒時(shí)間均為6min。
[0042] 本試驗(yàn)結(jié)果可知：啟動(dòng)培