杏鮑菇原始母種的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及食用菌原始母種制備方法領域，特別是指一種杏鮑菇原始母種的制作方法。
【背景技術】
[0002]我國食用菌總產(chǎn)量、年產(chǎn)值逐年增長，是全球最大的食用菌生產(chǎn)消費國，占世界年總產(chǎn)量的70%，成為我國農(nóng)業(yè)領域僅次于糧、油、果、菜的第五大作物。其中，杏鮑菇是一種大型肉質(zhì)傘菌，又名刺芹側耳，是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種。杏鮑菇營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、維生素及鈣、鎂、銅、鋅等礦物質(zhì)，可以提高人體免疫功能，對人體具有抗癌、降血脂、潤腸胃以及美容等作用。由于其具有營養(yǎng)豐富、口感好、貨架期長、易工廠化栽培等特點，近年來受到國內(nèi)外消費者和投資者的普遍歡迎，具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>[0003]目前我國對于，食用菌工廠化生產(chǎn)發(fā)展迅速，在生產(chǎn)過程中，對于菌種的重要性是第一位的。而我國工廠化杏鮑菇生產(chǎn)量在總產(chǎn)量中迅速增加，而市場對高品質(zhì)的杏鮑菇需求也在逐年增加，由于受投資水平、技術水平、研發(fā)水平的限制，工廠化杏鮑菇生產(chǎn)隨著菌種的逐年使用，生物轉(zhuǎn)化率逐漸降低、抗雜能力下降、產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸降低、生產(chǎn)成本步步攀升，大部分杏鮑菇工廠的菌種制作和引種都是很不規(guī)范，尤其是原始母種，造成種子質(zhì)量不穩(wěn)定，菌種退化現(xiàn)象嚴重，生物轉(zhuǎn)化率下降嚴重，極易造成雜菌污染?，F(xiàn)有技術中有“一種杏鮑菇母種馴化方法201210353266.5”發(fā)明專利申請，只簡單披露了母種的純化過程，沒有將母種的培養(yǎng)和純化全過程進行控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種適合工廠化運用的杏鮑菇原始母種的制作方法，提高了菌種抗雜能力、提高產(chǎn)量和品質(zhì)、保證了產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定性。
[0005]本發(fā)明提出一種杏鮑菇原始母種的制作方法，先是進行杏鮑菇原始母種的培養(yǎng)，再進行杏鮑菇原始母種的提純;包括以下步驟，
[0006]杏鮑菇原始母種的培養(yǎng):
[0007]A、挑選種菇:從疏過蕾1-2天的育菇房，挑選多個六成熟，有本品種典型性狀，健壯、美觀、無病蟲害的菇子10-20個作為種菇，采摘的時候戴上無菌手套，采摘后放到無菌塑料袋里面，并封嚴實袋口；
[0008]B、準備用具:把種菇、經(jīng)過檢測無菌的PDA培養(yǎng)皿、無菌水及全部操作用具滅菌后放入消過毒的超凈工作臺里面；
[0009]C、沖洗種菇:在無菌、正壓的情況下，戴上無菌手套用無菌水把種菇逐個沖洗干凈，分開放到超凈工作臺上，開紫燈消毒30分鐘后，再開潔凈正壓風，把種菇表面的水分吹干、備用；
[0010]D、接種:戴上無菌手套，把杏鮑菇一分為二的切開，并在菌蓋和菌柄處用無菌手術刀切取菌種塊，用無菌的接種勾，轉(zhuǎn)入無菌的PDA培養(yǎng)皿中心，每個種菇取兩塊，轉(zhuǎn)接到兩個無菌的培養(yǎng)皿之中；
[0011 ] E、封口裝袋:用封口膜把接完種的PDA培養(yǎng)皿邊緣封口并標記，再裝入密封的無菌袋；
[0012]F、恒溫培養(yǎng):消毒培養(yǎng)箱，將裝袋后的TOA培養(yǎng)皿，放到恒溫培養(yǎng)箱里，溫度調(diào)到25± 0.5 °C，進行黑暗、避光無風或弱風培養(yǎng)4-8天；
[0013]G、篩選提純用種:培養(yǎng)期間，每天觀察培養(yǎng)皿的生產(chǎn)參數(shù)，對于I個種菇轉(zhuǎn)接的兩個培養(yǎng)皿，都表現(xiàn)最佳的生長參數(shù)，則選為提純的原始母種；
[0014]杏鮑菇原始母種提純的具體步驟如下:
[0015]H、制作PDA培養(yǎng)皿，皿內(nèi)的培養(yǎng)基清晰、偏干、無雜質(zhì)、整個培養(yǎng)基厚度，均勻一致控制在3.0 ±0.5mm;
[0016]1、切杏鮑菇菌絲尖端:將把長滿培養(yǎng)皿1/2的杏鮑菇菌種、全部操作器具放到經(jīng)過紫外滅菌的超凈工作臺或生物安全柜里面，進行紫外或紫外加臭氧機避光滅菌20-40min;關閉紫外燈和臭氧機，開正壓風，用無菌刀片快速切杏鮑菇菌絲尖端I ±0.5mm，一個培養(yǎng)皿切10-12個這種長度的尖端，切完后蓋上培養(yǎng)皿蓋子；
[0017]J、分離出帶有菌絲尖端及培養(yǎng)基塊:把切分過的菌種培養(yǎng)皿，用很薄的無菌刀片，分離出切好的菌絲尖端，同時要切下菌絲尖端所依附的培養(yǎng)基塊并分離出來，二者合稱為囷種塊；
[0018]K、分皿:把經(jīng)過檢測無菌的培養(yǎng)皿、杏鮑菇菌種、全部操作器具在超凈工作臺或生物安全柜里面進行第二次紫外或紫外加臭氧機滅菌30-40min，戴上無菌手套，用接種勾把分離出的菌種塊，勾取移動到空白培養(yǎng)皿的中央，一個菌種塊放一個空白培養(yǎng)皿；
[0019]L、封口并標記:把轉(zhuǎn)接有菌種的培養(yǎng)皿封口并貼好標簽，放到密封的無菌塑料袋中；
[0020]M、培養(yǎng):把培養(yǎng)皿放到26土 1°C的恒溫培養(yǎng)箱里面，進行黑暗、避光、無風或弱風培養(yǎng)8-12天；
[0021]N、提純復壯:每天觀察記錄菌絲的各項生長指標，當菌絲長滿培養(yǎng)皿1/2-2/3的時候，選出優(yōu)勢的2個培養(yǎng)皿作為下次提純復壯的出發(fā)菌種，按照上面方法，對菌絲尖端切取，重復上述H至N步驟3-8次；
[0022]0、選種:對經(jīng)過提純，表現(xiàn)非常優(yōu)良的菌絲進行鏡檢、病毒檢測、出菇試驗，對三個指標都表現(xiàn)達標、出菇試驗指標最優(yōu)的菌種選作原始母種保藏。
[0023]優(yōu)選地，在“B、準備用具”步驟中的全部操作用具包括滅過菌的手術刀、接種勾、無菌燒杯、酒精燈、酒精棉球、無菌手套、火機。
[0024]所述“G、篩選提純用種”步驟中，所述生長參數(shù)包括培養(yǎng)皿的污染情況、菌種塊萌發(fā)的快慢、長滿培養(yǎng)皿時間、菌絲濃密度、菌絲光澤度、菌絲粗壯度、菌絲生長速度、菌絲邊緣整齊程度、菌絲伸展度、菌絲生長勢、。
[0025]“1、切杏鮑菇菌絲尖端”步驟中全部操作器具包括酒精燈、體式顯微鏡、滅過菌的手術刀、無菌手套、火機、酒精棉球；“K、分皿”步驟中全部操作器具酒精燈、酒精棉球、無菌手套、接種勾。
[0026]“K、觀察并提純復壯”步驟中，各項生長指標包括菌絲萌發(fā)的時間、菌絲長速、菌絲健壯度、菌絲光亮度、菌絲伸展度、菌絲粗細程度、菌絲邊緣整齊度，菌絲整體長勢。
[0027]所述“D、接種”、“E、封口裝袋”、“J、分離出帶有菌絲尖端菌種塊”、“K、分皿”、“L、封口并標記”步驟中，應在超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)，距酒精燈火焰周圍5cm的范圍內(nèi)操作。
[0028]所述“D、接種”步驟中，在菌蓋和菌柄處用切取菌種塊為4mmX 4mm; “J、分離出帶有菌絲尖端及培養(yǎng)基塊”步驟中，所述培養(yǎng)基塊的塊徑為3-4_。
[0029]本發(fā)明的有益效果是；采用最優(yōu)部位定點取菌種塊，保證了原始母體的活力，SP“D、接種”步驟中在種菇的菌蓋和菌柄處切菌種塊，菌蓋和菌柄處的組織塊更嫩，含的營養(yǎng)物質(zhì)更多，更有利于菌絲萌發(fā)和培養(yǎng)健壯的菌絲體。
[0030]采用超短切取杏鮑菇菌絲尖端技術，現(xiàn)有技術中切取杏鮑菇菌絲尖端為2_3mm，而本發(fā)明開創(chuàng)性地采取切取Imm菌絲尖端，能使菌絲生產(chǎn)更快、生長勢更強、生長潛力充分發(fā)揮出來。
[0031]杏鮑菇原始母種提純過程中采用二次滅菌技術，即在“1、切杏鮑菇菌絲尖端;”和“K、分皿;”步驟中兩次對超凈工作臺內(nèi)的培養(yǎng)皿、操作器具進行紫外結合臭氧消毒，徹底地滅菌，保證菌種塊不受雜菌感染，因為切杏鮑菇菌絲尖端的過程中主要是在超凈工作臺內(nèi)，在體式顯微鏡的載物鏡上進行的，主要超凈工作臺的窗口在操作過程中開的正壓風小，正壓風如太大會影響要切割操作，在操作過程中容易有不潔凈的空氣進入，同時這個動作要快，所以在做完這個程序的基礎上，移出體式顯微鏡，再對其超凈工作臺內(nèi)進行紫外結合臭氧消毒。
[0032]采用黑暗無風培養(yǎng)技術，“F、恒溫培養(yǎng)”步驟中，恒溫培養(yǎng)箱里為黑暗、避光無風或弱風環(huán)境，因為菌絲體的營養(yǎng)生長階段不需要光照，光照會抑制菌絲的伸長生長，不利于菌絲體內(nèi)營養(yǎng)的積累，在菌絲培養(yǎng)階段在一定的氧氣情況下，空間內(nèi)的空氣越靜越有利于萌發(fā)和減少感染污染，培養(yǎng)溫度在25°C左右，這個偏高點的溫度，能加快菌絲的生長速度，更有利于提純過程中獲得更純的杏鮑菇母種?！癕、培養(yǎng)”步驟中，26 ± 1°C的恒溫培養(yǎng)箱能使菌絲的加速生長，使菌絲頂端的純度更高，更好的提純到高純度的杏鮑菇菌種?！?、切杏鮑菇菌絲尖端”步驟中，要在快速切取菌絲尖端，能減少菌絲在體視顯微鏡下暴露的時間，開正壓風，能最大程度地減少雜菌感染。
[0033]“D、接種”、?、封口裝袋”、“J、分離出帶有菌絲尖端菌種塊”、“K、分皿”、“L、封口并標記”等多個步驟操作，都在距酒精燈火焰周圍5cm的范圍內(nèi)，能減少雜菌感染。
[0034]通過試驗確定了原始母種的制作、提純工藝，通過完善和創(chuàng)新杏鮑菇原始母種的制作、純化工藝參數(shù)，使工廠化生產(chǎn)的杏鮑菇，產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定，抗污染能力強，始終保持種子最原始的種性，不退化、不變異、不老化，能夠縮短菌種菌齡。這種工藝能方便和規(guī)范大、中型杏鮑菇瓶栽和袋栽公司原始母種的生產(chǎn)和使用，為杏鮑菇菌種的純度和種性提供了有效保障。
[0035]經(jīng)過對比試驗，提純的菌種與對照的普通菌種相比有以下優(yōu)勢；
[0036](I)在母種培養(yǎng)階段，提純的菌種其菌絲的濃密度、整齊度、光澤度優(yōu)于對照，同時提純菌種的長滿試管的菌齡在17天，生產(chǎn)上常用菌種的菌齡在20天，提純異常試管母種的比率比對照異常管的比率低8%左右。
[0037](2)在原種培養(yǎng)階段，提純菌種的菌絲，其顏色比對照更潔白，更有光澤，其生長勢比對照更強，長滿菌種瓶的菌齡在15天左右，對照菌種一般在17天左右。
[0038](3)在栽培種階段，提純菌種長滿栽培瓶的時間是16天左右，對照長滿瓶的菌齡在18天左右。
[0039](4)在生產(chǎn)瓶培養(yǎng)階段，在相同培養(yǎng)條件下提純菌種長滿生產(chǎn)瓶的時間一般在22天，對照的長滿瓶的時間在24天;其感染率提純的一般在0.2%。，對照的一般在0.4%0。
[0040](5)在育菇和采菇階段，提純的比對照的一般情況下快I天左右的時間，生長的菇更健壯和緊密，品質(zhì)比對照好，在產(chǎn)量上面，提純的每瓶成品菇產(chǎn)量比對照每瓶成品菇產(chǎn)量平均高14克，提高每瓶產(chǎn)量在8%左右，現(xiàn)在生產(chǎn)8萬瓶的量，每天可以增收1120公斤，每公斤瓶栽成品菇的價格一般在9元左右，每天公司可以增收I萬