辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種辣椒灰霉病的苗期接種鑒定方法，尤 其是對辣椒抗灰霉病資源材料的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國辣椒大棚栽培發(fā)展迅速。由于冬春季大棚內(nèi) 溫度低、濕度大、結(jié)露持續(xù)時(shí)間長，非常適合辣椒灰霉病的發(fā)生。因此，該病已成為我國大棚 辣椒生產(chǎn)中最主要病害之一，病害損失輕則減產(chǎn)15%~20%，重則減產(chǎn)30%以上。但是到目 前為止，針對辣椒灰霉病的研究較少，對辣椒灰霉病抗性鑒定及其抗性遺傳機(jī)制的研究進(jìn) 展更為緩慢，而這些研究的開展都需要一套科學(xué)的接種鑒定方法為基礎(chǔ)。
[0003] 國內(nèi)外對灰霉病的防治主要以控制溫、濕度，培育壯苗為主，配合噴藥保護(hù)，防止 病害蔓延。而實(shí)際上若遭遇連續(xù)陰雨天氣，以我國現(xiàn)有的栽培條件，難以做到對大棚溫、濕 度的理想控制。若主要依賴化學(xué)藥劑來控制病情，則一方面長期農(nóng)藥使用會(huì)導(dǎo)致抗藥性菌 株產(chǎn)生，以致防治效果逐年下降；另一方面，大量使用農(nóng)藥會(huì)對環(huán)境造成不良影響，也會(huì)帶 來食品安全的威脅。想要克服此類不利因素，最為直接且經(jīng)濟(jì)有效的措施就是選育和種植 抗灰霉病的新品種。而大量篩選獲得的抗源材料為育成具有抗病性的新品種提供了抗病親 本，是新品種選育工作的基礎(chǔ)。
[0004] 目前，有關(guān)灰霉病的抗性鑒定方法報(bào)道的僅有番茄、非洲菊和草莓這幾種作物，辣 椒尚屬空白。前幾種作物由灰霉病發(fā)生所帶來的經(jīng)濟(jì)損失主要集中在花期和掛果期，故其 鑒定方法或是通過離體接種，或是在掛果期直接進(jìn)行田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)來確定其抗感水平。辣 椒灰霉病在苗期和成株期均能引起危咅，而苗期灰霉病往往引起整株死亡，甚至成片死亡， 造成更為嚴(yán)重的后果。離體接種方法雖然簡單，但由于苗期辣椒植株幼嫩，灰霉菌雖屬于兼 性寄生菌，但其腐生能力極強(qiáng)，離體接種結(jié)果往往無法正確區(qū)分出抗感水平，也無法反映辣 椒對灰霉菌活體侵染的抗性情況。因此，針對辣椒灰霉病的抗性鑒定需要建立一套快速簡 便、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確的活體接種鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對目前辣椒灰霉病抗病育種上沒有一套抗性鑒定方法這一 現(xiàn)狀，提供一套簡易、高效、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確的人工接種鑒定辣椒抗灰霉病能力的方法，為辣 椒抗性種質(zhì)的篩選鑒定提供技術(shù)支撐。
[0006] 本發(fā)明"辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法"包括以下步驟。
[0007] 1、接種體制備：保存于4°C條件下的辣椒灰霉病菌菌株ciflerea )接種 在平板PDA培養(yǎng)基上活化，取新鮮菌絲塊接入新的平板PDA培養(yǎng)基上，20°C下黑暗培養(yǎng)14 d，收集灰霉菌孢子并配成106 /mL的孢子懸浮液待用。
[0008] 2、培育接種用辣椒苗：育苗盤(穴深6cm，單穴口徑6cm，單穴底徑3cm)表面消毒， 裝入已滅菌的混合基質(zhì)，播種鑒定材料，5粒每穴，每份材料種植30穴以上，置于20°C ~25°C 溫室大棚內(nèi)土層上生長，常規(guī)管理。待長出子葉后，間苗，每穴保留3株，生長至四葉期，進(jìn) 打接種鑒定。
[0009] 3、接種方法：將孢子液滴加在苗心生長點(diǎn)上，接種菌液量3〇μL7株。接種前將水澆 透，接種后在育苗盤上支起小棚密閉，每日于小棚四周澆水，以保持濕度。
[0010] 4、調(diào)查方法：調(diào)查記錄接種日期、病害癥狀始現(xiàn)期。21d后，調(diào)查各鑒定材料的病 株數(shù)，計(jì)算發(fā)病株率。按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性水平分類。
[0011]
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢與性能特點(diǎn)如下。
[0013] (1)首次在我國建立了辣椒灰霉病抗性鑒定方法。
[0014] (2)本發(fā)明的接種方法操作簡便，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，病情判別靈敏度高，可顯著 區(qū)分不同品種對灰霉病的抗感差異。
[0015] (3)運(yùn)用生長點(diǎn)滴加灰霉菌孢子液的接種方法，接種部位和接種量一致、接種后發(fā) 病均勻、結(jié)果穩(wěn)定性好，可操作性強(qiáng)。
[0016] (4)采用小棚密閉、棚外澆水的保濕方法，符合自然生產(chǎn)過程中大棚內(nèi)的發(fā)病條 件，因此鑒定結(jié)果更接近于田間自然感病結(jié)果。
[0017] (5)適合同時(shí)對大批量材料進(jìn)行抗灰霉病鑒定和篩選，有利于提高抗病材料的篩 選效率。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)例一。
[0019] 以11個(gè)辣椒品種材料為研究對象，采用生長點(diǎn)接種法鑒定其對辣椒灰霉病的抗 性。
[0020] 1、接種體制備。
[0021] 辣椒灰霉病菌菌株ciflerea)是由江西省南昌辣椒種植大棚采集到的 具有典型灰色霉層的灰霉病病苗上分離純化得到。其純化過程為：從采集的病苗上用滅菌 的接種針挑取少量霉層(分生孢子及分生孢子梗)接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)平 板(培養(yǎng)皿）中，于20°C培養(yǎng)2d，從菌落邊緣挑取灰霉菌菌絲接入新的PDA培養(yǎng)基平板上， 2d后再次將菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接，如此反復(fù)，直至培養(yǎng)基中長出的菌絲不含其它雜菌為止。 將純化后的灰霉菌菌絲接種至裝有PDA培養(yǎng)基的無菌試管中，20°C培養(yǎng)至產(chǎn)生菌核后，保 存于4°C條件下。使用前由保存試管中挑取菌核或菌絲塊移至裝有PDA培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng) 皿中央進(jìn)行活化（20°C，3-5 d)，于菌落邊緣用打孔器取新鮮菌絲塊接入新PDA培養(yǎng)基上， 20°C下黑暗培養(yǎng)14d后，用少量無菌水將灰霉菌分生孢子洗下，配成10 6 /mL的孢子懸浮液 待用。PDA培養(yǎng)基的配方為：200g 土豆、20g蔗糖和15g瓊脂粉，蒸餾水1L。
[0022] 2、供試?yán)苯菲贩N材料準(zhǔn)備。
[0023] 用0. 5%的高錳酸鉀浸泡育苗盤進(jìn)行表面消毒。裝入已滅菌的混合基質(zhì)，播種鑒定 材料，5粒每穴，每份材料種植32穴，置于20°C ~25°C溫室大棚內(nèi)土層上生長，常規(guī)管理。待 長出子葉后，間苗，每穴保留3株。待幼苗生長至四葉期（四葉一心)，進(jìn)行接種鑒定。
[0024] 3、接種方法。
[0025] 使用移液器將孢子液滴加在辣椒苗心的生長點(diǎn)上，使孢子液液滴懸掛于苗心，滴 加菌液量3〇μL7株。接種前將育苗盤用水澆透，接種后在育苗盤上支起塑料膜小棚密閉，于 小棚四周澆水，以保持濕度。
[0026] 4、調(diào)查方法。
[0027] 處理后的辣椒苗在接種14d左右開始出現(xiàn)癥狀，以后每隔2d觀察1次，21d統(tǒng)計(jì)發(fā) 病率(產(chǎn)生明顯的灰色霉層)。按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性水平分類。
[0028]
[0029] 本實(shí)例結(jié)果如下表所示，在鑒定的11份材料中，2份材料發(fā)病率小于10%，屬于抗 病材料；7份材料發(fā)病率在10-30%之間，屬于中抗材料；剩下兩份材料的發(fā)病率都較高，其 中1份屬于中感材料，1份屬于高感材料。該實(shí)例的鑒定結(jié)果與這些材料的田間實(shí)際發(fā)病情 況一致，表明此套辣椒苗期灰霉病抗性接種鑒定法是一種環(huán)境條件可控、接種效率高、結(jié)果 準(zhǔn)確和反應(yīng)靈敏的方法，可廣泛用于辣椒種質(zhì)資源篩選和品種抗病性鑒定。
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，首先活化并培養(yǎng)灰霉病菌，配制分 生抱子懸浮液；然后在滅菌基質(zhì)中播種，培育接種用辣椒苗，滴加抱子液進(jìn)行接種；密閉保 濕，21d后調(diào)查各鑒定材料的發(fā)病率，按W下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性水平分類：〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，其特征在于灰霉 菌抱子液的接種濃度為1〇6 /mU接種量為30化每株苗。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，其特征在于辣椒 苗的生長溫度及接種后放置的溫室溫度為2(TC~25°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，其特征在于辣椒 苗的接種時(shí)期為四葉期。5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，其特征在于辣椒 苗的接種部位為苗必生長點(diǎn)，并使抱子液液滴懸掛于苗必。6. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鑒定的苗期接種方法，其特征在于接種 后在育苗盤上支起塑料膜小棚密閉，于小棚四周德水，W保持濕度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種辣椒灰霉病苗期接種鑒定方法，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)要點(diǎn)為：培養(yǎng)灰霉病菌（<i>Botrytis？cinerea</i>），收集病菌孢子，配制成106/mL的灰霉菌孢子懸浮液，辣椒種子播種在滅菌的土壤中，置于20℃~25℃溫室大棚內(nèi)，待生長至四葉期后，在苗心生長點(diǎn)上滴加孢子液接種，小棚密閉保濕，21d后進(jìn)行灰霉病調(diào)查。本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)是：苗期鑒定，操作簡便，高效快速，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。主要用于快速篩選辣椒資源品種中抗病性種質(zhì)和品種的抗病性鑒定，為抗病新品種選育和抗病品種合理布局服務(wù)。
【IPC分類】A01G7/06, C12Q1/02
【公開號(hào)】CN105557347
【申請?zhí)枴緾N201410535419
【發(fā)明人】黃蓉, 黃瑞榮, 胡建坤, 陳學(xué)軍, 方榮, 繆南生
【申請人】江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月13日