火焰南天竹的再生培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種火焰南天竹的再生培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 火焰南天竹是一種新型的綠化苗木，它冬季葉色嬌艷似火深受人民的喜愛。由于 火焰南天竹植株矮小，莖節(jié)短，節(jié)間只有普通南天竹的1/10,枝條細(xì)弱，扦插繁殖困難且繁 殖速度慢。自從1995年上海植物園作為資源收集引進(jìn)該品種以來，我國(guó)對(duì)火焰南天竹的研 究才開始，生產(chǎn)上通常采用扦插育苗法，繁殖周期長(zhǎng)，繁殖率極低，在生產(chǎn)中不能取得很好 的效果。隨著近年組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是利用植物組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)，進(jìn) 行苗木繁殖，更是對(duì)常規(guī)繁殖技術(shù)的一次重大革命，顯示了其強(qiáng)大的生命力和廣闊的發(fā)展 前景。采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)繁殖既可以得到整齊一致的無性系材料，又能提高繁殖系數(shù)， 在短期內(nèi)獲得大量苗木，克服常規(guī)繁殖的弊端，為火焰南天竹的快速推廣和產(chǎn)業(yè)化提供保 障，具有較為廣泛的社會(huì)效益、生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 但是，由于火焰南天竹的節(jié)間短、增殖系數(shù)低，傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于火焰南天 竹的培養(yǎng)效果較差。而且，目前隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，越來越多的研究轉(zhuǎn)向與對(duì) 植物基因的研究，轉(zhuǎn)基因的研究是其中的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題，轉(zhuǎn)基因的成功與否依賴一 個(gè)高效、穩(wěn)定的再生體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷而提供一種高效穩(wěn)定的以葉片為外植 體的火焰南天竹的再生培養(yǎng)方法。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明所述的火焰南天竹的再生培養(yǎng)方法，包括：
[0007] (1)以火焰南天竹的葉片為外植體，接種于含有TDZ和2, 4-D的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行 再生培養(yǎng)，獲得再生不定芽；
[0008] (2)將所述的再生不定芽置于芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得無根植株；
[0009] (3)取所述無根植株的莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得火焰南天竹再生植株。
[0010] 本發(fā)明以葉片作為外植體，在再生培養(yǎng)基中添加 TDZ和2, 4-D兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 劑，可誘導(dǎo)火焰南天竹的葉片產(chǎn)生再生不定芽，再生不定芽經(jīng)伸長(zhǎng)、生根后即可獲得火焰南 天竹再生植株。
[0011] 優(yōu)選的，所述的葉片取自火焰南天竹的無菌組培苗。一般選取30~35天葉齡的 無菌組培苗上嫩綠、平展的葉片，去除葉尖和葉緣，剪成2~4_2的葉塊進(jìn)行接種。
[0012] 所述無菌組培苗的獲取方法包括：取火焰南天竹的頂芽，消毒后置于分化培養(yǎng)基 上進(jìn)行培養(yǎng)，將分化的植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲取無菌組培苗。優(yōu)選的，所述的分化培養(yǎng)基為 改良MS+6-BA1. 5mg/L+IBA0. 4mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. Og/L，ρΗ5· 8,所述的繼代培養(yǎng)的培 養(yǎng)基為 MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. Og/L，ρΗ5· 8。
[0013] 所述的再生培養(yǎng)基的配方可以為：改良MS+TDZ+2,4-D+蔗糖25~35g/L+瓊脂5~ 7g/L。具體的，再生培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度可以為30g/L，瓊脂的濃度可以為6g/L。
[0014] 再生培養(yǎng)時(shí)，使用合適的濃度、比例的TDZ和2, 4-D，能夠提高不定芽的再生率及 每外植體的再生芽數(shù)，優(yōu)選的，所述再生培養(yǎng)基中，TDZ的濃度為1. 5~2. 5mg/L，2, 4-D的 濃度為〇· 2~0· 3mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選的，TDZ的濃度為2. 5mg/L，2, 4-D的濃度為0· 2mg/L ; 或TDZ的濃度為1. 5mg/L，2, 4-D的濃度為0. 2mg/L。采用前者的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，不 定芽再生率可達(dá)95. 8%，采用后者的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，可以維持較高的不定芽再生率 (81. 5% )的同時(shí)減少玻璃化芽。
[0015] 優(yōu)選的，所述的再生培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，所述暗培養(yǎng)的時(shí)間為12~21天。更優(yōu)選的， 所述暗培養(yǎng)的時(shí)間為14天。
[0016] 再生不定芽一般長(zhǎng)至1cm左右，即可接種到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選的，所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基含有6-BA0. 4~0. 6mg/L和ΝΑΑ0. 1~0. 2mg/L。進(jìn) 一步優(yōu)選的，所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基含有6-BAO. 5mg/L和NAAO. lmg/L。
[0018] 所述的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的配方可以為：改良MS+0. 4~0· 6mg/L+NAA0. 1~0· 2mg/L+ 蔗糖25~35g/L+瓊脂5~7g/L。具體的，芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度可以為30g/L，瓊 脂的濃度可以為6g/L。
[0019] 一般，再生不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)成3cm左右的無根植株時(shí)，即可取無根植株1~1. 5cm 的莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0020] 優(yōu)選的，所述的生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖和瓊脂的改良MS 培養(yǎng)基，所述的改良MS培養(yǎng)基以水為溶劑，由大量元素、微量元素和有機(jī)物質(zhì)組成，其中，
[0021] 大量元素包括：（NH4)2S04580 ~620mg/L、C0(NH2)480 ~520mg/L、KN039 30 ~ 970mg/L、CaCl2 · 2H20200 ~240mg/L、MgS04 · 7H20175 ~195mg/L 和 KH2P0475 ~95mg/L ;
[0022] 微量元素包括：KI0. 35 ~0· 45mg/L、H3B033 ~3. 2mg/L、MnS04 · 4H20L 1 ~1. 2mg/ L、ZnS04 · 7H204. 2 ~4. 4mg/L、Na2Mo04 · 2H200. 12 ~0· 13mg/L、FeS04 · 7H2027. 5 ~28mg/L 和 Na2-EDTA · 2H2037 ~37. 5mg/L ;
[0023] 有機(jī)物質(zhì)包括：肌醇45~55mg/L、煙酸0· 4~0· 6mg/L、鹽酸P比咳醇0· 4~0· 6mg/ L、鹽酸硫胺素0· 05~0· 15mg/L、泛酸f丐0· 8~1. 2mg/L、維生素 Cl. 8~2. 2mg/L和甘氨酸 1. 8 ~2. 2mg/L。
[0024] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的改良MS的組成為：
[0025] 大量元素：（NH4) 2S04600mg/L、CO (NH2) 500mg/L、KN03950mg/L、CaCl2 · 2H20220mg/L、 MgS04 · 7H20185mg/L 和 KH2P0485mg/L ;
[0026] 微量元素：KIO. 41mg/L、H3B033. lmg/L、MnS04 · 4H20L 15mg/L、ZnS04 · 7H204. 3mg/L、 Na2Mo04 · 2H200. 125mg/L、FeS04 · 7H2027. 8mg/L 和 Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L ;
[0027] 有機(jī)物質(zhì)：肌醇50mg/L、煙酸0· 5mg/L、鹽酸P比咳醇0· 5mg/L、鹽酸硫胺素0· lmg/L、 泛酸媽lmg/L、維生素 C2mg/L和甘氨酸2. Omg/L。
[0028] 優(yōu)選的，生根培養(yǎng)基中，所述的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為NAA，濃度為0. 4~0. 6mg/L。進(jìn) 一步優(yōu)選的，生根培養(yǎng)基中，NAA的濃度為0. 4mg/L。
[0029] 生根培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度為25~35g/L，瓊脂的濃度為5~7g/L，進(jìn)一步，蔗糖 的濃度可以為30g/L，瓊脂的濃度可以為6g/L。
[0030] 本發(fā)明中，再生培養(yǎng)基、芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基中涉及的改良MS， 均采用上述的改良MS的配方。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0032] 本發(fā)明建立了以葉片為外植體的火焰南天竹高效穩(wěn)定的再生體系，通過改良培養(yǎng) 基、培養(yǎng)條件，提高不定芽再生率（可達(dá)95. 8% )，促進(jìn)不定芽新梢生根，為火焰南天竹的分 子生物學(xué)以及基因工程研究提供了一條新的途徑，為火焰南天竹基因工程研究和基因轉(zhuǎn)化 提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為添加 TDZ2. 5mg/L和2, 4-DO. 2mg/L的再生培養(yǎng)基中葉片再生情況圖；
[0034] 圖2為添加 TDZ1. 5mg/L和2, 4-DO. 2mg/L的再生培養(yǎng)基中葉片再生情況圖；
[0035] 圖3為添加 TDZ2. 5mg/L和2, 4-DO. 2mg/L的再生培養(yǎng)基中平均每葉塊再生芽數(shù) 圖；
[0036] 圖4為添加 TDZ1. 5mg/L和2, 4-DO. 2mg/L的再生培養(yǎng)基中平均每葉塊再生芽數(shù) 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià) 形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 火焰南天竹的再生培養(yǎng)方法如下：
[0040] 1、無菌組培苗的獲得
[0041] 以火焰南天竹生長(zhǎng)健壯的枝條上飽滿的頂芽為外植體，流水沖洗3小時(shí)，升汞 殺菌8分鐘后用無菌水沖洗6~8次，接取種到分化培養(yǎng)基上，25 °C暗培養(yǎng)5天以后 25 μ mol · m2 · s 1光下培養(yǎng)，光周期每天8小時(shí)暗培養(yǎng)，16小時(shí)光照。外植體接種15天左 右芽開始萌發(fā)，40天后分化成為2-3厘米高的植株。將分化的小苗接種于繼代培養(yǎng)基中， 每35天繼代一次，獲得無菌組培苗。培養(yǎng)基在121°C條件下滅菌20min。繼代培養(yǎng)的溫度 為（25±2) °C，光照強(qiáng)度為25 μπιο? · m2 · s \光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)暗培養(yǎng)。
[0042] 分化培養(yǎng)基的組成為：改良MS+6-BA1. 5mg/L+IBA0. 4mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6. Og/L, pH5. 8〇
[0043] 繼代培養(yǎng)基的組成為：改良MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6. Og/L, pH5. 8〇
[0044] 改良MS以水為溶劑，組成為：
[0045] 大量元素：（NH4) 2S04600mg/L、CO (NH2) 500mg/L、KN03950mg/L、CaCl2 · 2H20220mg/L、 MgS04 · 7H20185mg/L 和 KH2P0485mg/L ;
[0046] 微量元素：KIO. 41mg/L、H3B033. lmg/L、MnS04 · 4H20L 15mg/L、ZnS04 · 7H204. 3mg/L、 Na2Mo04 · 2H200. 125mg/L 和鐵鹽：FeS04 · 7H2027. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L ;
[0047] 有機(jī)物質(zhì)：肌醇50mg/L、煙酸0· 5mg/L、鹽酸吡咳醇（維生素 B6)0. 5mg/L、鹽酸硫 胺素（維生素 Β1)0· lmg/L、泛酸鈣（維生素 B5) lmg/L、維生素 C2mg/L和甘氨酸2. Om