單性結(jié)實(shí)（parthenocarp)或轉(zhuǎn)基因。進(jìn)一步的，本發(fā)明的植物可以 是用于提高谷物產(chǎn)量性狀的雜合子或純合子，優(yōu)選純合子。盡管可以將SPIKE或其產(chǎn)量提 高部分轉(zhuǎn)移至任何植物中以提供具有提高的谷物產(chǎn)量的植物，但是本文所描述的方法和植 物優(yōu)選涉及谷物禾本科（禾谷科、禾谷家族，cereal grass family)，更優(yōu)選水稻。
[0120] 具有提高的谷物產(chǎn)量的近交水稻系可以使用輪回選擇和回交、自交和/或雙單倍 體技術(shù)或用來形成親本系的任何其它技術(shù)來開發(fā)。在選擇和回交的方法中，可以通過使輪 回親本與第一供體植物（其不同于輪回親本并且在本文中稱為"非輪回親本"）雜交以將提 高的谷物產(chǎn)量基因滲入到靶受體植物（稱為輪回親本）。所述輪回親本是其中需要提高谷 物產(chǎn)量的植物，優(yōu)選秈稻品種。任選地，所述輪回親本具有商業(yè)可取的特性，諸如但是不限 于抗病性、抗蟲性、耐雜草性等。所述非輪回親本包含編碼SPIKE的核酸序列。非輪回親本 可以是與輪回親本生雜交可育（cross-fertile)的任何植物種類或近交系。將由輪回親本 與非輪回親本之間雜交產(chǎn)生的子代回交至所述輪回親本。然后篩選所產(chǎn)生的植物群體。可 以許多不同的方式來篩選所述群體。然后將表現(xiàn)出提高的谷物產(chǎn)量并且包含編碼SPIKE的 必需的核酸序列的Fl雜交植物進(jìn)行選擇并且自交并且在許多代中進(jìn)行選擇以使得水稻植 物變得越來越近交。這種連續(xù)的自交和選擇的工藝可以進(jìn)行〇~5或更多代。這種育種和 選擇的結(jié)果是產(chǎn)生與提高的谷物產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的基因以及與商業(yè)利益性狀相關(guān)聯(lián)的其它基 因遺傳上同質(zhì)（同源，homogenous)的系。
[0121] 替代使用生物測(cè)定的表型病理篩選，可以使用本文中所描述的分子標(biāo)記、雜交探 針、或多核苷酸中的一種或多種來進(jìn)行標(biāo)記輔助的選擇（MAS)，來識(shí)別包含編碼SPIKE的核 酸序列的那些子代。替代地，可以使用MS來確認(rèn)由定量生物測(cè)定獲得的結(jié)果。一旦做出了 適合的選擇，則重復(fù)所述過程。將向輪回親本的回交和選擇提高的谷物產(chǎn)量的工藝重復(fù)約 五代或更多代。由這種工藝產(chǎn)生的子代對(duì)于SPIKE是雜合的。然后將最后的回交代自交， 以提供具有提尚的谷物廣量的純合純育種后代。
[0122] 本文中所描述的具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻系可以用于附加的雜交中以聲稱具 有提高的谷物產(chǎn)量的雜交植物。例如，通過本文所描述的方法生產(chǎn)的具有提高的谷物產(chǎn)量 的第一近交水稻植物可以與具有商業(yè)需要的性狀（諸如但不限于抗病性、抗蟲性、耐雜草 性等）的第二近交水稻植物雜交。這種第二近交水稻系可以具有或可以不具有相對(duì)提高的 谷物產(chǎn)量。
[0123] 標(biāo)記輔助的選擇和回交
[0124] 本文中描述了 SPIKE標(biāo)記輔助的選擇（MAS)和標(biāo)記輔助的回交（MABC)
[0125] 分子標(biāo)記可以包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)或簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR)。開發(fā)作物物 種中的分子標(biāo)記的主要?jiǎng)訖C(jī)是，通過標(biāo)記輔助的選擇（MS)和標(biāo)記輔助的回交（MBC)在植 物育種中增加效率的潛力。使用遺傳標(biāo)記等位基因來識(shí)別在一個(gè)或多個(gè)基因座含有所需基 因型并且預(yù)計(jì)將所需要的基因型與所需要的表型一起轉(zhuǎn)移給它們的子代的植物。遺傳標(biāo)記 等位基因可以用來識(shí)別在一個(gè)基因座或在多個(gè)未連鎖的或連鎖的基因座（例如單倍型）含 有所需要的基因型并且預(yù)計(jì)將所需的基因型與所需的表型一起轉(zhuǎn)移給它們的子代的植物。
[0126] 在所需表型（例如提高的谷物產(chǎn)量）和多態(tài)染色體基因座被確定為一起分離之 后，能夠使用這些多態(tài)基因座來選擇相應(yīng)于所需表型的等位基因：一種稱為標(biāo)記輔助的 選擇的工藝（MAS)。簡(jiǎn)言之，在來自待選擇植物的生物樣品中檢測(cè)與標(biāo)記核酸相對(duì)應(yīng)的 核酸。這種檢測(cè)可以采用探針核酸與標(biāo)記的雜交的形式，例如使用等位基因特異性雜交、 Southern分析、Northern分析、原位雜交、引物雜交，隨后是PCR擴(kuò)增標(biāo)記的區(qū)域等。本文 中描述了各種用于檢測(cè)標(biāo)記的程序。在驗(yàn)證了生物樣品中的特定標(biāo)記和/或標(biāo)記等位基因 的存在（或不存在）之后，選擇所述植物，即用于通過選擇性育種來產(chǎn)生子代植物。
[0127] 對(duì)大量植物進(jìn)行提高的谷物產(chǎn)量的篩選是昂貴、耗時(shí)且不可靠的。將本文所描述 的基因連鎖核酸用作提高谷物產(chǎn)量的遺傳標(biāo)記，是一種在育種方案中選擇能夠育性恢復(fù)的 植物的有效方法。例如，標(biāo)記輔助的選擇在田間評(píng)價(jià)提高的谷物產(chǎn)量中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，MS 可以在一年中的任何時(shí)間進(jìn)行，而與生長(zhǎng)季節(jié)無關(guān)。另外，環(huán)境的影響與MAS無關(guān)。
[0128] MAS在植物育種中的另一種應(yīng)用是輔助通過回交育種的輪回親本基因型的恢復(fù)。 回交育種是一種將子代與其親本之一雜交的方法?；亟煌ǔＳ糜谝粋€(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因座從 供體親本基因滲入到在其他情況下來自輪回親本的所需遺傳背景中這一目的而進(jìn)行。回交 的循環(huán)次數(shù)越多，輪回親本對(duì)所產(chǎn)生的種類的遺傳貢獻(xiàn)越大。這往往是必要的，因?yàn)楣w親 本植物在其他情況下可能是不可取的。相反，作為強(qiáng)化育種（intensive breeding)方案的 結(jié)果的種類可能僅在一個(gè)所需的性狀上存在缺陷，諸如提高的谷物產(chǎn)量。可以進(jìn)行回交來 選擇或反對(duì)（抵制，against) -個(gè)性狀。
[0129] 可以通過本領(lǐng)域中已經(jīng)確立的多種方法來檢測(cè)與群體的成員之間的遺傳多態(tài)性 相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記（例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、同工酶標(biāo)記（isozyme marker)、等位基因特 異性雜交（ASH)、植物基因組的擴(kuò)增可變序列（amplified variable sequences of the plant genome)、自持續(xù)序列復(fù)制（self-sustained sequence replication)、簡(jiǎn)單序列重 復(fù)（SSR)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP))。
[0130] 大多數(shù)遺傳標(biāo)記依賴于核酸的用于檢測(cè)它們的一種或多種性質(zhì)。例如，一些用于 檢測(cè)遺傳標(biāo)記的技術(shù)利用探針核酸與相應(yīng)于所述遺傳標(biāo)記的核酸的雜交。雜交形式包括但 不限于溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定。通過將探針（其典型地為與待檢測(cè)的核酸的 子片段的相對(duì)應(yīng)的子片段或合成寡核苷酸）與限制性消化基因組DNA的雜交來檢測(cè)作為 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)的標(biāo)記。選擇限制酶以提供在不同的個(gè)體中至少兩個(gè)替代 (或多態(tài)性）長(zhǎng)度的限制性片段，并且限制酶在系與系之間往往不同。確定為每次雜交產(chǎn)生 信息片段的（一個(gè)或多個(gè)）限制酶在本領(lǐng)域中是眾所周知的簡(jiǎn)單程序。在適合的基質(zhì)（例 如瓊脂糖）中通過長(zhǎng)度分離并且轉(zhuǎn)移至膜（例如硝基纖維素、尼龍）后，在導(dǎo)致探針與靶平 衡結(jié)合的條件下將標(biāo)記的探針雜交，隨后通過洗滌除去過量的探針?？梢钥寺『?或合成 針對(duì)標(biāo)記基因座的核酸探針。適合于與核酸探針使用的可檢測(cè)標(biāo)記包括任何可通過光譜、 放射性同位素、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢測(cè)的組合物。有用的 標(biāo)記包括用于以標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin)偶聯(lián)物、磁珠、焚光染料、放射 性標(biāo)記、酶和比色標(biāo)記染色的生物素。其它標(biāo)記包括結(jié)合標(biāo)記有熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶的 抗體的配體。標(biāo)記標(biāo)記物可以諸如通過使用針對(duì)標(biāo)記基因座的標(biāo)記的PCR引物來容易地實(shí) 現(xiàn)。
[0131] 然后使用最典型地放射自顯影或其它類似檢測(cè)技術(shù)（例如，熒光照相術(shù)、液體閃 爍計(jì)數(shù)器等）來檢測(cè)雜交的探針。本領(lǐng)域中廣泛可獲得具體的雜交方案的實(shí)例。
[0132] 擴(kuò)增的可變序列是指在同一物種的成員之間表現(xiàn)出高核酸殘基可變性的植物基 因組的擴(kuò)增序列。所有的生物體均具有可變的基因組序列并且每種生物體（除了克隆之 外）具有不同組的可變序列。一旦確定，具體可變序列的存在可以用來預(yù)測(cè)表型性狀。優(yōu) 選地，來自植物的DNA充當(dāng)用于以側(cè)接DNA的可變序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增的模板。擴(kuò)增所述 可變序列，然后進(jìn)行測(cè)序。
[0133] 體外擴(kuò)增技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。技術(shù)實(shí)例包括體外方法，包括聚合酶鏈 反應(yīng)（PCR)、連接酶鏈反應(yīng)（LCR)、O，β -復(fù)制酶擴(kuò)增和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)（例如， NASBA)?；旧先魏蜶NA均可以轉(zhuǎn)化為適合于限制性消化、PCR擴(kuò)增和使用逆轉(zhuǎn)錄酶及聚 合酶測(cè)序的雙鏈DNA。
[0134] 例如在擴(kuò)增反應(yīng)中用作引物且用作核酸序列探針的寡核苷酸典型地是根據(jù)固相 亞磷酰胺三酯法來化學(xué)合成或可以簡(jiǎn)單地商業(yè)訂購。
[0135] 替代地，自持續(xù)序列復(fù)制可以用來識(shí)別遺傳標(biāo)記。自持續(xù)序列復(fù)制是指一種使用 在基本等溫條件下在體外指數(shù)復(fù)制的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增的方法，其通過使用涉及逆轉(zhuǎn) 錄病毒復(fù)制的三種酶活性：（1)逆轉(zhuǎn)錄酶、（2)核糖核酸酶H和（3) DNA-依賴性RNA聚合酶。 通過模擬通過cDNA中間體的RNA復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒策略，這種反應(yīng)累積了原始靶的cDNA 和RNA拷貝。
[0136] 具有許多不同類型的分子標(biāo)記，包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP)、等位基因特異 性雜交（ASH)、單核苷酸多態(tài)性（SNP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR)和同工酶標(biāo)記。SSR數(shù)據(jù)是通過 將引物雜交至植物基因組的保守區(qū)而生成的，該保守區(qū)側(cè)接SSR序列。然后使用PCR來擴(kuò) 增引物之間的重復(fù)。然后將擴(kuò)增的序列進(jìn)行電泳以確定尺寸并因此測(cè)定二、三和四核苷酸 重復(fù)。
[0137] 通過以上列舉的任何方法（例如RFLP、AFLP、SSR等）確定SPIKE在表現(xiàn)出優(yōu)選的 表型性狀的植物的基因組中的存在。如果來自植物的核酸對(duì)于所需的遺傳標(biāo)記呈陽性，可 以將該植物自交以形成真正的具有相同基因型的育種系或其可以與具有相同標(biāo)記或具有 其它所需特性的植物雜交以形成有性雜交的雜種世代。
[0138] 本發(fā)明的材料和方法可以類似地用來在除了水稻之外的谷物草（諸如小麥、高粱 和玉米）中賦予提高的谷物產(chǎn)量。
[0139] 實(shí)施例
[0140] 在下列實(shí)施例中進(jìn)一步限定本文所描述的方法和實(shí)施方式，其中所有的份和百分 比均按重量計(jì)并且度是攝氏度，除非另有說明。本發(fā)明的某些實(shí)施方式限定在本文的實(shí)施 例中。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是它們僅以示例性 的方式給出。由本文的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并 且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和 修改以使其適應(yīng)各種用途和條件。
[0141] 結(jié)果
[0142] NIL-SPIKE 的表征
[0143] 在此處指定為SPIKE (SPIKELET編號(hào)）的數(shù)量性狀基因座（QTL) qTSN4,通過使用用 于SPIKE的NIL (NIL-SPIKE)來進(jìn)行表征（圖1A)。NIL-SPIKE具有比IR64更大的穗（圖 1B)、葉（圖1C)和穗頸（圖1D)。在產(chǎn)量相關(guān)性狀中，其具有更高的TSN(圖1E)、旗葉寬度 (FLW ;圖1F)、根干重（RDW ;圖1G)和實(shí)粒率（圖2A)，但具有更低的穗數(shù)/植物和1000-粒 重（圖2B，2C)。顯著地，與實(shí)粒率一起，改善了谷粒的外觀（圖1H)，推測(cè)是由于增加的維 管束數(shù)（VBN;圖II)加強(qiáng)了向較大數(shù)量的小穗的同化供應(yīng)（assimilate supply)。因此，在 四個(gè)種植季節(jié)中，NIL的谷物產(chǎn)量/m2(GYS)均一致地高于IR64,在四個(gè)季節(jié)中的三個(gè)中是 顯著的（圖1J)。與IR64(~400g/m 2)相比，NIL的平均GYS在旱季時(shí)高出28%且在雨季 高出24%。因此，通過增大庫容大?。╯ink size)(高TSN)、源尺寸（寬FLW和高RDW)以 及轉(zhuǎn)運(yùn)能力（高VBN)而實(shí)現(xiàn)了 NIL的GYS增加且不降低谷粒外觀。此外，至抽穗的天數(shù)未 改變（圖2D)。因此，SPIKE高度有用于提高產(chǎn)量而不改變局部適應(yīng)性狀。
[0144] 高分辨率連鎖圖譜和SPIKE的識(shí)別
[0145] 為了識(shí)別SPIKE的基因，使用用于評(píng)價(jià)TSN的7996BC4F3植物來進(jìn)行高分辨率連鎖 分析。候選區(qū)域處于標(biāo)記Ind4和Indl2之間（18. Okbp)，其中Michigan State University 的水稻基因組注釋項(xiàng)目（Rice Genome Annotation Project)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了三個(gè)基因（圖 2A)。除了 TSN之外，所提議的基因與二次分枝數(shù)和葉寬的增加相關(guān)聯(lián)（圖7)。幼穗中的 表達(dá)分析顯示，僅表達(dá)了 0s04g52479 (Nall:NARROW LEAF 1)(圖8)，因此是SPIKE的最可 能的候選物。SPIKE的預(yù)測(cè)的氨基酸序列的分析顯示在IR64和NIL-SPIKE之間存在三個(gè) 氨基酸取代，它們中的一個(gè)處于胰蛋白酶樣絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中（圖9)。另 外，SPIKE蛋白顯示出與短柄草（Brachypodium)、小麥、高粱和玉米具有>84%的同一性以 及在胰蛋白酶樣絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的高類似性。這種類似性表明了 SPIKE 蛋白質(zhì)家族在這些物種之間的生物化學(xué)功能的保守性。
[0146] SPIKE的表達(dá)分析
[0147] SPIKE在多個(gè)器官中一致性表達(dá)（圖2B)。為了在植物發(fā)育期間分析SPIKE的表 達(dá)，在轉(zhuǎn)基因 IR64植物中在天然SPIKE啟動(dòng)子的控制下表達(dá)β-葡糖醛酸酶（⑶S)報(bào)告 基因。組織化學(xué)分析顯示了在穗頸和莖、葉（圖6Α~6C)、冠根、側(cè)根（圖2C)和幼穗（圖 2D)的胚芽鞘、維管束中的⑶S活性。除了胚芽鞘之外，⑶S表達(dá)的模式與NIL-SPIKE中的 器官增大一致。定量RT-PCR顯示，幼穗中在各個(gè)時(shí)期的SPIKE的表達(dá)在NIL-SPIKE中比在 IR64中的一致性更高，且在21 - 50-mm時(shí)期為IR64的兩倍（P = 0. 05 ;圖2E)。結(jié)果顯示， 幼穗期的SPIKE表達(dá)的增加提高了小穗數(shù)。
[0148] 通過轉(zhuǎn)基因分析的SPIKE的基因驗(yàn)證
[0149] 為了驗(yàn)證收集的數(shù)據(jù)并且為了洞察SPIKE的功能，生成了過表達(dá)子系（使用 組成型啟動(dòng)子）和沉默系（使用人工micr 〇RNA:amiRNA)。通過轉(zhuǎn)化將與泛素啟動(dòng)子 (Ubi:SPIKE)融合的含有來自NIL-SPIKE的SPIKE的cDNA的DNA片段導(dǎo)入到IR64中。過 表達(dá)子轉(zhuǎn)基因植物顯示出與NIL-SPIKE相似的表型，包括大穗和寬旗葉（圖3A、圖3B)。攜 帶單個(gè)拷貝的植物具有比IR64顯著更高的TSN和FLW (圖3C、3D)。攜帶多個(gè)拷貝的植物 比具有單個(gè)拷貝的那些具有顯著更大的TSN和FLW，表明TSN和FLW與SPIKE的表達(dá)一起 增加。在該事件中觀察到了攜帶多個(gè)拷貝的顯著更高的轉(zhuǎn)錄本（圖7A)。這表明了 SPIKE 轉(zhuǎn)錄本對(duì)植物表型的劑量效應(yīng)。此外，T0Ubi : SPIKE植物的TSN和FLW隨拷貝