一種黃藤組織培養(yǎng)快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種黃藤組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃藤(Daemonoropsmargaritae(Hance)Becc.)別名土黃蓮、黃蓮藤，為防已科多年生藤本植物。以藤莖或根為主要藥用部位，具有清熱解毒、利尿通便、治療飲食中毒、咽喉腫痛、霉菌性陰道炎等重要作用。隨著相關(guān)制劑，如:黃藤分散片、復(fù)方黃藤洗劑、黃藤素片、黃藤素栓等的深入開發(fā)利用，對(duì)黃藤資源的需求也日益增加，但因少有黃藤人工栽培，藥用黃藤主要靠采挖野生資源，以致其野生資源遭到毀滅性的破壞。
[0003]黃藤雌雄異株，為天然異花授粉植物，結(jié)實(shí)率易受環(huán)境影響，兼之種子成熟期長，不易長期保存，否則容易喪失活力，因此，自然狀態(tài)下黃藤種子的數(shù)量和質(zhì)量缺乏保證；且種子苗遺傳背景雜合，不能完全代表母株的遺傳特性，后代植株差異不齊。無性繁殖具有保持親本遺傳性狀的優(yōu)點(diǎn)，但黃藤無性繁殖只有扦插相關(guān)的研究報(bào)道，且尚無明確的成苗情況和繁殖效率比較研究(閆志剛等.吲哚丁酸和萘乙酸對(duì)黃藤插穗生根的影響.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008 (19):2) ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種黃藤組織培養(yǎng)快繁方法，它能夠快速繁殖出大量適合移栽的優(yōu)良黃藤種苗、滿足生產(chǎn)需要。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種黃藤組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體的選擇與消毒:取黃藤健壯植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，去除葉片，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1 %升汞消毒8-10min、無菌水沖洗3_5次，然后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)外植體初代誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，切成帶有一個(gè)腋芽的莖段，接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加了 0.5-1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，
[0008](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加了 0.5-1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的激動(dòng)素KT、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，
[0009](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的試管苗叢生芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到健壯植株，其中MS壯苗培養(yǎng)基中添加了 0.1-0.5mg/L吲哚乙酸IAA、0.5-0.1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為 5.8，
[0010](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株置于1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到完整帶根苗，其中1/2MS生根培養(yǎng)基中添加0.5-1.0mg/L的萘乙酸NAA、30g/L的香蕉泥、10g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，
[0011](6)煉苗移栽:將所述完整帶根苗在室溫下煉苗4-7天，待表面角質(zhì)形成后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基立即移栽到按質(zhì)量比為蛭石:泥炭土 = I:1的基質(zhì)中，生長一個(gè)月后移栽到大田。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
[0013](I)采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的黃藤叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到30-40倍，叢生芽健壯，接種到生根培養(yǎng)基后容易生根，生根率可達(dá)95%以上。
[0014](2)采用組織培養(yǎng)的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)培育出大量適合栽培種植的黃藤幼苗，保障黃藤種苗的增殖系數(shù)和種苗質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，滿足生產(chǎn)上的需要。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明。
[0016]實(shí)施例1
[0017]本發(fā)明所述的黃藤的組織培養(yǎng)快繁方法的一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0018](I)外植體的選擇與消毒:取黃藤健康植株新萌發(fā)的嫩芽置于封口袋中在4°C的冰箱中冷藏一周后作為外植體，去外除葉后，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1 %升汞消毒8_10min、無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0019](2)外植體初代誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用解剖刀切成1.0-1.5cm長的帶有一個(gè)腋芽的莖段接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到無菌試管苗，其中MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0020](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的吲哚丁酸IBA、0.2mg/L的激動(dòng)素KT、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8，叢生芽增殖系數(shù)為13.5。
[0021](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到健壯植株，其中MS壯苗培養(yǎng)基中添加0.2mg/L 2.4 二氯苯氧乙酸2.4_D、0.5-0.1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0022](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株置于1/2MS生根培養(yǎng)基中在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到完整帶根苗，其中1/2MS生根培養(yǎng)基中添加0.lmg/L萘乙酸NAA、10g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。生根率95%。
[0023](6)煉苗與移栽:打開組培瓶蓋，加入30_50ml的自來水，煉苗一周；待培養(yǎng)基表面形成角質(zhì)后，將幼苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)中；在基質(zhì)中生長一個(gè)月左右后，移栽到大田。移栽成活率96%。
[0024]實(shí)施例2
[0025]本發(fā)明所述的黃藤的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的另一個(gè)實(shí)例，包括以下步驟:
[0026](I)外植體的選擇與消毒:取黃藤健康植株新萌發(fā)的嫩芽置于封口袋中在4°C的冰箱中冷藏一周后作為外植體，去外去葉后，依次用2 %洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1 %升汞消毒8_10min、無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0027](2)外植體初代誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用解剖刀切成1.0-1.5cm長的帶有一個(gè)腋芽的莖段接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到無菌試管苗，其中MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的萘乙酸NNA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、0g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0028](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚丁酸IBA、0.2mg/L的激動(dòng)素KT、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8，叢生芽增殖系數(shù)為23.7。
[0029](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)30天得到健壯植株，其中MS壯苗培養(yǎng)基中添加0.5mg/L 2.4 二氯苯氧乙酸2.4_D、0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、2mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP、30g/L蔗糖和5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0030](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株置于1/2MS生根培養(yǎng)基中在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8_10小時(shí)/天的