032] 實(shí)施例三：抗體陽性分群同步凈化
[0033] 在本實(shí)施例中，上述抗體檢測(cè)結(jié)果的抗體合格豬只，即抗體陽性分群豬只，在母豬 分娩時(shí)，采集仔豬斷臍帶中的體液，送至實(shí)驗(yàn)室，將收集的母豬分娩時(shí)仔豬斷臍帶中的體 液，分別提取DNA與RNA。其中，提取的RNA通過套式RT-PCR方法檢測(cè)豬瘟病毒；提取的 DNA通過PCR方法檢測(cè)豬偽狂犬病毒。所述提取的DNA通過PCR方法擴(kuò)增豬偽狂犬病毒的 gD基因片段與gE基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0034] 檢測(cè)陽性（帶毒者）豬只，母豬斷奶后立即淘汰，仔豬隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)免疫，不再留 種，肥豬銷售。
[0035] 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)具體步驟如下：
[0036] 1)樣品處理
[0037] 母豬分娩時(shí)仔豬斷臍帶中的體液3_5mL作為樣本。較佳的，收集臍帶中的體液4mL 作為樣本，1500rpm/min離心15min，取上清200 μ L，分別提取DNA和RNA。
[0038] 2)提取 RNA
[0039] 體液總RNA粗提，陽性病毒作為陽性對(duì)照。
[0040] ①取前處理上清樣品200 μ L，加到I. 5mL的Eppendorf管中，再加入1000 μ L RNA Trizol振蕩混勾，室溫靜置IOmin ;
[0041] ②加入200 μ L氯仿，混勻器上振蕩混勻5s (不能過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可 以用手顛倒混勻），冰浴lOmin，12000rpm/min 4°C離心10min ;
[0042] ③取上清于另一新Eppendorf管中，加等體積異丙醇（4°C預(yù)冷）混勾，室溫或4°C 靜置15min ;
[0043] ④4°C，12000rpm/min離心10min(Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放 置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上沾干液體或者用槍吸干殘余液體，加入ImL 75 %乙 醇，顛倒洗滌；
[0044] ⑤7500rpm/min離心5min，將Eppendorf斜倒置，用槍靠管口小心吸盡液體，常溫 干燥20min左右。
[0045] ⑥溶于25 μ L無 RNA酶污染的水中，-20°C短期保存、_70°C長(zhǎng)期保存或立即進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄。
[0046] 在本實(shí)施例中，所有RNA提取試劑、各種加樣槍頭、Eppendorf管及其他接觸樣品 的器具都必須是無RNA酶污染，操作時(shí)應(yīng)戴一次性手套并經(jīng)常更換。
[0047] RNA 的反轉(zhuǎn) cDNA 體系（20 μ L)
[0048]
[0049] 體系配制好后置于PCR儀中反應(yīng)，42°C、60min的延伸，70°C、5min反轉(zhuǎn)錄酶滅活。 反應(yīng)結(jié)束，將樣品分裝，標(biāo)記好后放入-20°C保存。
[0050] 3) DNA 的提取
[0051] 參照天根公司提供的血樣、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，設(shè)立 陰、陽性對(duì)照。將提取好的DNA存放4°C備用，若長(zhǎng)時(shí)間存放放置-20°C保存。
[0052] 4) RT-PCR 和 PCR 擴(kuò)增：
[0053] ①豬瘟病毒套式RT-PCR檢測(cè)方法主要采用套式RT-PCR豬瘟檢測(cè)方法，具體如 下：
[0054] 引物：
[0055]
[0056] 首先，采用Pup-I與Pdown-I分別為上、下游引物，以上述步驟2)提取獲得的體液 總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，進(jìn)行外套PCR反應(yīng)。
[0057] 反應(yīng)體系：
[0058]
[0059] 擴(kuò)增條件：％°C 3min - (%°C 45s，55°C lmim，72°C Imim)35 個(gè)循環(huán)一WC延伸 5min〇
[0060] 隨后，采用Pup-2與Pdown-2分別為上、下游引物，以外套PCR獲得的PCR產(chǎn)物為 模板，進(jìn)行內(nèi)套PCR反應(yīng)。
[0061] 反應(yīng)體系：
[0062]
[0063] 擴(kuò)增條件：95°C 3min - (95°C 45s，55°C lmim，72°C lmim)35 個(gè)循環(huán)-72°C延伸 5min〇
[0064] ②豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)方法
[0065] 首先，參照偽狂犬檢測(cè)方法（GB/T 18641-2002)擴(kuò)增豬偽狂犬病毒gD基因片段， 片段大小為217bp。
[0066] 引物：
[0067] 上游引物 Upl :5' -CACggAggACgAgCTggggCT-3'
[0068] 下游引物 Up2 :5, -gTCCACgCCCCgCTTgAAgCT-3'
[0069] 反應(yīng)體系：
[0070]
-/
[0071] 反應(yīng)條件：
[0072] 95°C 5min -（94°C lmin，57°C lmin，72°C lmin) 30 個(gè)循環(huán)一 72°C延伸 lOmin，最后 4°C保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)。
[0073] 其次，根據(jù)已公布的PRV Becker株基因組序列（GenBank:JF797219)基因序列設(shè) 計(jì)鑒別診斷豬偽狂犬病毒gE基因，目的片段為350bp。
[0074] 引物：
[0075] 上游引物 gEup: 5'-ATG CGG CCC TTT CTG CTG CY-3，
[0076] 下游引物 gEdown:5'-CGA CAC GGC GTC GCA GCC GC-3'
[0077] 反應(yīng)體系：
[0078]
[0079] 反應(yīng)條件：
[0080] 95°C預(yù)變性 5min，94°C lmin，60°C lmin，72°C延伸，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C lOmin。
[0081] 5)瓊脂糖凝膠電泳，分析比對(duì)結(jié)果
[0082] 取PCR和套式RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物10 μ 1，于0. 8 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。
[0083] 陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立，且在擴(kuò)增出目的片段則表示陽性。
[0084] ①豬偽狂犬病毒：
[0085] 同時(shí)檢測(cè)到217bp的gD基因片段和350bp的gE片段陽性為野毒感染淘汰；
[0086] 僅檢測(cè)到gE基因片段，為了安全期間，隔離觀察，采集血樣進(jìn)行鑒別診斷；
[0087] 僅檢測(cè)到gD基因片段則表明為疫苗毒株，不淘汰。
[0088] ②豬瘟病毒：外套PCR獲得806bp的基因片段，內(nèi)套PCR獲得基因片段大小為 512bp，則判斷為陽性。
[0089] 淘汰標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)到豬偽狂犬病毒gE和豬瘟為陽性或其中之一為陽性，母豬斷奶淘 汰，仔豬隔離飼養(yǎng)，不再留種，淘汰。
[0090] 實(shí)施例四：定期抽檢與全面檢測(cè)
[0091] 維持經(jīng)上述方法凈化后的種豬群，每季度按20% -30%抽樣，按實(shí)施例一方法檢 測(cè)豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒等免疫抗體1次?？贵w檢測(cè)陰性加強(qiáng)疫苗的 免疫接種，抗體檢測(cè)陽性豬群堅(jiān)持定期檢測(cè)和飼養(yǎng)管理。
[0092] 較佳的，每季度按20%抽樣。
[0093] 每半年全部仔豬斷臍帶時(shí)，按實(shí)施例三的方法，采集臍帶中體液，并檢測(cè)豬瘟病毒 和豬偽狂犬病毒，淘汰陽性豬只。淘汰標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)到豬偽狂犬病毒和豬瘟為陽性或其中之一 為陽性，母豬斷奶淘汰，仔豬隔離飼養(yǎng)，不再留種，淘汰。
[0094] 經(jīng)過1-2年，開展豬瘟和豬偽狂犬病的檢測(cè)-淘汰-免疫等監(jiān)測(cè)凈化工作，即可完 全控制豬瘟、豬偽狂犬病毒，建立起健康穩(wěn)定的種豬群。
[0095] 實(shí)施例五：
[0096] 在實(shí)施凈化技術(shù)時(shí)，還要做好各項(xiàng)配套措施的落實(shí)，采取綜合防控技術(shù)。
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