一種快速獲得日本結(jié)縷草組培苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種快速獲得日本結(jié)縷草組培苗的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)縷草為多年生草本植物，隸屬于禾本科虎耳草亞科。一般認為有11個種及部分 變種，而作為草坪草種質(zhì)資源被研宄利用的有5個種。其中的日本結(jié)縷草是重要的草坪草， 它很多的優(yōu)良特性，如適應性廣、抗旱性強、耐磨耐踐踏、耐熱耐鹽堿等，使得它被廣泛運用 于城市運動場、城市綠化、公路護坡及水土保持。
[0003] 然而綠色期短的缺點限制了日本結(jié)縷草進一步的擴大應用。并且結(jié)縷草為四倍體 植株，授粉方式為雌雄同株異花型。傳統(tǒng)育種的方式很難改良綠色期短的性狀，并且也難于 獲得品系較純，遺傳背景一直的日本結(jié)縷草種子。應用轉(zhuǎn)基因的技術(shù)篩選培育符合生產(chǎn)需 求的品種就有著巨大的優(yōu)勢。
[0004] 應用轉(zhuǎn)基因手段改良物種的基礎(chǔ)是建立高效優(yōu)質(zhì)的再生體系，在這方面已經(jīng)有很 多的學者進行了研宄。Al-khayri等用日本結(jié)縷草成熟胚誘導了愈傷組織，從而得到再生植 株；Inokuma通過培養(yǎng)日本結(jié)縷草懸浮細胞系，進而純化得到原生質(zhì)體再生株系；Noh等人 以結(jié)縷草的幼穗、莖尖為外植體材料誘導愈傷組織，并獲得了再生植株。但這些辦法的周期 過長，誘導出胚性愈傷組織通常需要3個月以上的時間，再由胚性愈傷組織長成植株可能 要半年左右的時間，這增大了分子育種工作者篩選和選育優(yōu)良植物品系的周期。Yaxin Ge 等人用日本結(jié)縷草的匍匐莖做的再生體系，大大縮短了時間，在報道中，2月左右的時間就 能獲得轉(zhuǎn)基因植株。但植物體內(nèi)的內(nèi)生菌難以消除，從而大大影響了基因轉(zhuǎn)化的效率。本課 題組構(gòu)建的再生體系，能保證快速獲得再生植株（50天左右），也同時避免了染菌的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為加快日本結(jié)縷草組培苗的建成過程，提高生產(chǎn)效益，本發(fā)明的目的在于提供一 種快速獲得日本結(jié)縷草組培苗的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的快速獲得日本結(jié)縷草組培苗的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)將滅菌的日本結(jié)縷草種子以水浸種3天；
[0008] 2)浸種后的種子吹干至表面發(fā)白，以剛沒過種子的水培養(yǎng)至萌發(fā)出l-2mm的芽；
[0009] 3)將萌芽后的種子接種到固體MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至幼苗 地上部高3cm，此時幼苗葉鞘底部出現(xiàn)表面粗糙的節(jié)點；
[0010] 4)剝?nèi)ビ酌缟系姆N皮，沿節(jié)點上沿切斷幼苗，注意保留節(jié)點，去除節(jié)點以上的莖 葉，將余下的植株放到ZJ-SM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至莖端長出芽；
[0011] 5)去除莖端長出的芽，將植株放回ZJ-SM培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至根端長出芽；
[0012] 6)將根端長出的芽切下放到固體1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長出5cm長的根，得到完 整的植株；
[0013] 7)將完整的植株煉苗后移植，得到日本結(jié)縷草組培苗。
[0014] 其中，所述的水優(yōu)選為無菌水。
[0015] 其中，步驟1)所述滅菌的方法為：將種子加入滅菌液后攪拌40min，用水漂洗3-5 次后去除表面水分。
[0016] 所述去除表面水分，為吹干或用無菌濾紙吸干水分。
[0017] 所述滅菌液為Tween-20含量為2. 500ml/L、次氯酸鈉原液含量為250ml/L的水溶 液。
[0018] 其中，所述ZJ-SM培養(yǎng)基為含激動素（kinetin)的濃度為1.0-8.0ymol/L、含 2,4-D的濃度為0.1 ymol/L、蔗糖質(zhì)量百分含量為2%、植物凝膠的含量為0.3%(w/v)的 固體MS培養(yǎng)基。
[0019] 所述激動素的濃度優(yōu)選為4. 0-6. 0 ymol/L，最優(yōu)選為4. 0 ymol/L〇 [0020] 其中，步驟2)所述培養(yǎng)至萌發(fā)出l-2mm的芽，所需時間為3天。
[0021] 其中，步驟3)所述培養(yǎng)至幼苗株高3cm，所需時間為12天。
[0022] 其中，步驟4)所述培養(yǎng)至莖端長出芽，所需的時間為4天。
[0023] 其中，步驟5)所述培養(yǎng)至根端長出芽，所需的時間為15天。
[0024] 其中，步驟6)所述培養(yǎng)至長出根，所需的時間為10天。
[0025] 其中，步驟7)所述煉苗，所需時間為3天。
[0026] 其中，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為白天溫度28-30°C，夜間溫度24-26°C，光照時間16 小時/天，光照強度30001x。
[0027] 本發(fā)明還提供所述快速獲得日本結(jié)縷草組培苗的方法在日本結(jié)縷草良種繁育中 的應用。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于提供了一種結(jié)縷草快速再生的辦法，傳統(tǒng)的通過愈傷而獲 得再生植株的辦法一般需要4個月左右，而本發(fā)明只需要50天，大大縮短了獲得再生植株 的周期，為結(jié)縷草的轉(zhuǎn)化體系研宄提供了基礎(chǔ)。以本發(fā)明的方法能快速制備結(jié)縷草無性系 的植株，以便轉(zhuǎn)基因工作者能有遺傳背景一致的外植體進行基因研宄。本發(fā)明的方法還能 完成日本結(jié)縷草的快速擴繁。
[0029] 3)能將轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草進行快速的擴繁。
[0030] 本發(fā)明的關(guān)鍵點如下：
[0031] 1)制備無菌外植體時，一般用于消毒的酒精，次氯酸等消毒的化學藥劑會對植株 造成很大的傷害，甚至可能發(fā)生誘變而影響植株的再生。本發(fā)明是在種子時期進行滅菌的， 此時的種子有堅硬厚實的種皮保護而抵擋了清毒處理時，化學藥劑對植物的傷害。
[0032] 2)本發(fā)明的滅菌過程保留種子的種皮且滅菌液中需加入少量表面活性劑，這樣可 以延長滅菌的時間，且充分去除種子表面附著的菌而達到了消毒的效果。
[0033] 3) ZJ-SM培養(yǎng)基中的激動素及2, 4-D的含量為微量，使得結(jié)縷草長芽而又不會誘 導出愈傷組織。
[0034] 4)在切除節(jié)點時，保留切口處有小綠點的部分，因為小綠點是能分化成整個植株 的生長點。
[0035] 5)除芽，外植體在ZJ-SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，第一次冒出的芽要去除（一般從外植體 頂端冒出）。此時得芽并不是新長出的，而是植物本身含有。
【附圖說明】
[0036] 圖1為實施例4萌發(fā)出l_2mm小芽的種子的照片。
[0037] 圖2為實施例4幼苗葉鞘底部節(jié)點的照片。
[0038] 圖3為實施例4幼芽生根的照片。
[0039] 圖4為實施例4煉苗和移植的照片。
【具體實施方式】
[0040] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0041] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0042] 實施例1ZJ-SM培養(yǎng)基配方濃度篩選
[0043] ZJ-SM培養(yǎng)基中，激動素的作用是促進組織分化、生芽，2, 4-D起著生長素的作用， 促進不定根形成，促進生長。ZJ-SM培養(yǎng)基中激動素（kinetin)濃度和2, 4-D濃度的篩選實 驗如下：
[0044] 篩選激動素濃度：
[0045] 在含鹿糖質(zhì)量百分含量為2 %、植物凝膠的含量為0? 3 % (w/v)的固體MS培 養(yǎng)基上梯度設(shè)置含激動素的濃度為I. 〇 umol/L、2. 0 ymol/L、3. 0 ymol/L、4. 0 ymol/L、 5. 0 y mol/L、6. 0 y mol/L、7. 0 y mol/L、8. 0 y mol/L 及 0? 0 y mol/L (對照）。在上述培養(yǎng)基 上接種日本結(jié)縷草外植體，并統(tǒng)計出芽率。
[0046] 所述外植體的獲得方法如下：將滅菌的日本結(jié)縷草種子萌芽后在固體MS培養(yǎng)基 培養(yǎng)至地上部高3cm，此時幼苗葉鞘底部出現(xiàn)表面粗糙的節(jié)點，剝?nèi)ビ酌缟系姆N皮，沿節(jié)點 上沿切斷幼苗，注意保留節(jié)點，去除節(jié)點以上的莖葉，余下的含有節(jié)點的部分為外植體。
[0047] 培養(yǎng)19天后得到的出芽率結(jié)果如下：
[0048] 表1激動素濃度對出芽率的影響
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[0050] 從上述結(jié)果來看，加入激動素能大大增加植物出芽的數(shù)量。1.0 ymol/ L-8. 0 ymol/L濃度的激動素，誘導芽的效果都較好。在4. 0 ymol/L-6. 0 ymol/L間，誘導出 芽的效率穩(wěn)定，并且效率很高，三次重復都在55%以上。4. 0 y mol/L的效果最好，三次重復 實驗都有最高的出芽率。
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