一種心臟組織固定劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種心臟組織固定劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病理標(biāo)本的制作和組織切片需要先進行固定。固定效果不好，HE染色、免疫組化、原位雜交就難以進行，因此，組織固定是形態(tài)學(xué)研究中不可缺少的重要步驟。現(xiàn)有的組織固定劑有醛類固定劑(福爾馬林、多聚甲醛、戊二醛等)、沉淀脫水類固定劑(甲醇、乙醇、丙酮等)、酸類固定劑(鉻酸、丹寧酸、冰醋酸等)Bouin固定劑、Zenker氏固定劑、Carrnoy氏固定劑。
[0003]心臟組織具有其特定的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，比如膜內(nèi)組織及房室間隔含大量磷脂多糖成分，富含心肌纖維蛋白，且心內(nèi)膜含有膠原纖維蛋白，現(xiàn)有的固定劑固定心臟組織時，會出現(xiàn)各種劣勢和缺點。比如:酸類固定劑中的鉻酸、丹寧酸單獨使用時滲透比較緩慢，對于離體心臟組織不能起到快速定型固定的效果；沉淀脫水類固定劑有使材料收縮的作用，易導(dǎo)致組織變形，切片時硬度太高，容易發(fā)生空泡現(xiàn)象等缺點，易導(dǎo)致病理切片出現(xiàn)假陽性結(jié)果，故不適于需要做心臟組織的固定劑。
[0004]因此，有必要提供一種心臟組織固定劑及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種心臟組織固定劑，該心臟組織固定劑采用復(fù)合配方，含有2，4，6_三硝基苯酚、甲醛、鉻酸和乙酸，該心臟組織固定劑對房室隔膜等膜性結(jié)構(gòu)有快速滲透作用，能快速滲透定型，可兼顧心臟組織核酸、蛋白的保護以及組織形態(tài)上的保存；該心臟組織固定劑還可使心臟組織保持適當(dāng)?shù)挠捕?，易獲得完整連續(xù)的切片，避免空泡現(xiàn)象，從而能對房室間隔等重大心肌膜性疾病進行有效的檢測，降低出現(xiàn)假陽性結(jié)果的概率。本發(fā)明還提供了一種心臟組織固定劑的制備方法和應(yīng)用。
[0006]第一方面，本發(fā)明提供了一種心臟組織固定劑，該心臟組織固定劑含有2，4，6_三硝基苯酚、甲醛、鉻酸和乙酸；
[0007]所述固定劑各組分的重量百分比為:
[0008]2,4,6-三硝基苯酚 0.79% ?0.92% ；
[0009]甲醛6.6% ?11%;
[0010]鉻酸0.38% ?0.58% ；
[0011]乙酸4.2% ?6.8%;
[0012]余量為水。
[0013]優(yōu)選地，所述固定劑各組分的重量百分比為:
[0014]2，4，6_ 三硝基苯酚 0.85%;
[0015]甲醛8.8%;
[0016]鉻酸0.48%;
[0017]乙酸5.1%;
[0018]余量為水。
[0019]優(yōu)選地，所述固定劑各組分的體積百分比為:
[0020]飽和2，4，6-三硝基苯酚溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%) 70% ；
[0021]甲醒(體積分?jǐn)?shù)40%) 20% ；
[0022]飽和鉻酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%) 5%；
[0023]乙酸(100%)5% ；
[0024]具體地，實際應(yīng)用中本發(fā)明提供的心臟組織固定劑的配方不限于本發(fā)明所述乙酸，根據(jù)需要，其他弱有機酸、或者其他弱有機酸與乙酸中的至少一種可以作為本發(fā)明采用的乙酸的替代。
[0025]心臟的心肌富含心肌纖維蛋白，且心內(nèi)膜含有膠原纖維蛋白，本發(fā)明提供的固定劑采用復(fù)合配方，能對心臟組織形態(tài)保存完好；此外，對房室隔膜等膜性結(jié)構(gòu)也能快速滲透，并可使心臟組織保持適當(dāng)?shù)挠捕龋兄讷@得完整的病理性組織切片，避免切片時出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，從而保證對房室間隔等重大心肌膜性疾病進行有效的檢測，而降低出現(xiàn)假陽性結(jié)果的概率。
[0026]此外，本發(fā)明提供的心臟組織固定劑降低了固定過程中對蛋白質(zhì)抗原表位的覆蓋或破壞作用，對于蛋白有較高的保護效率，不影響切片用于做免疫組化病理實驗。
[0027]本固定劑采用本發(fā)明提供的固定劑制備得到的切片經(jīng)過一定的步驟處理后，能夠用于RT-PCR、原位雜交、免疫組化、免疫熒光等分子病理學(xué)實驗。
[0028]苦味酸(即2，4，6_三硝基苯酚)可使蛋白質(zhì)、核酸等沉淀，并防止過度硬化，能提高后續(xù)染色過程中組織的著色能力，但是苦味酸在組織中的滲透緩慢，且會使組織強烈收縮。
[0029]甲醛與蛋白質(zhì)能發(fā)生分子間的交聯(lián)反應(yīng)，并經(jīng)過絡(luò)合交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，此外，甲醛還能保存脂肪和類脂體，對染色體、線粒體和高爾基體具有良好的固定作用，但是單純的醛類固定劑無法阻止組織固定后續(xù)的脫水、滲透和包埋過程對樣品脂類的抽提，因而其對心內(nèi)膜墊等心臟中膜性組織的固定效果不理想，而且其毒性大，操作時一般需要在實驗室通風(fēng)櫥中進行。相比胚胎等結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的組織，心臟柔韌性和組織通透性較高，因此，用于心臟組織的固定劑配方可以采用較低濃度的甲醛。
[0030]鉻酸是蛋白質(zhì)的良好固定劑，還可幫助保存糖類，但其滲透力較低，滲透比較緩慢對于離體心臟組織不能起到快速定型固定的效果。
[0031]乙酸能固定染色質(zhì)，其主要機理是使核酸沉淀，組蛋白溶解，阻止染色體收縮，使染色體結(jié)構(gòu)免于破壞；但是單獨使用會使原生質(zhì)膨脹，故容易使組織變形，組織細胞發(fā)生裂解，而損壞整體切片觀察效果。
[0032]本發(fā)明采用鉻酸、甲醛、苦味酸及乙酸配成一定濃度的復(fù)合固定劑，其中，乙酸可以乙酸滲透性強，甲醛與蛋白質(zhì)能發(fā)生分子間的交聯(lián)反應(yīng)，二者可使得細胞膜的蛋白質(zhì)變性，增強細胞膜的透過性，提高了固定劑對心臟組織的固定滲透效果，從而有助于苦味酸和鉻酸的滲透。
[0033]在固定劑各組分有良好滲透效果的前提下，本發(fā)明提供的心臟組織固定劑中的甲醛和苦味酸配合使用對富含心肌纖維蛋白及膠原纖維蛋白的心肌組織固定效果較好，能使心臟組織保持適當(dāng)?shù)挠捕?，克服乙酸單獨使用會引起組織膨脹的缺陷，使之適于切片處理，尤其是連續(xù)完整進行切片處理，合適的硬度對心臟組織切片形態(tài)的完整性有很大提升，力口強了切片后對后續(xù)分子病理操作的實用性。
[0034]本發(fā)明提供的心臟組織固定劑中的甲醛和鉻酸采用的濃度對心臟膜內(nèi)組織及房室間隔這種含大量磷脂多糖成分的物質(zhì)穿透效果較佳，能克服切片容易導(dǎo)致房間隔缺損、室間隔缺損等重大心臟疾病觀察而出現(xiàn)得假陽性或檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。而且本發(fā)明提供的心臟組織固定劑中的甲醛和乙酸、苦味酸配合使用可有效保存染色體。此外，與馬爾福林等單純的醛類固定劑相比，本發(fā)明采用的甲醛濃度大大降低，減小了固定劑的毒性。
[0035]總之，本發(fā)明提供的心臟組織固定劑各組分通過相互協(xié)調(diào)，可防止心臟組織溶裂，避免組織收縮，維持組織原有形態(tài)；且其能快速而均勻的滲透心臟組織，且不易使原生質(zhì)膨脹，故能快速定型并固定。
[0036]第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的心臟組織固定劑的制備方法，取鉻酸鹽或重鉻酸鉀溶于水，再加入2，4，6_三硝基苯酚、甲醛和乙酸，得到所述心臟組織固定劑。
[0037]優(yōu)選地，所述鉻酸鹽為鉻酸鉀。
[0038]優(yōu)選地，所述2，4，6-三硝基苯酚為述2，4，6-三硝基苯酚的飽和溶液，其飽和度為0.9% ?1.2%ο
[0039]優(yōu)選地，所述甲醛為備用的40%的甲醛。
[0040]優(yōu)選地，所述乙酸為冰醋酸。
[0041]優(yōu)選地，所述重鉻酸鉀溶于水制得12%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的重鉻酸鉀溶液備用。
[0042]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的心臟組織固定劑的制備方法為現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0043]本發(fā)明提供的心臟組織固定劑的制備方法，制備過程簡單快速，加入乙酸后，其與重鉻酸鉀或鉻酸鹽作用生成鉻酸，而鉻酸是蛋白質(zhì)的良好固定劑，提高了對心臟組織的固定滲透效果。
[0044]此外，該心臟組織固定劑的配制方法簡單。
[0045]第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的心臟組織固定劑或第二方面所述的心臟組織固定劑的制備方法在制備組織切片、免疫組化、原位雜交或蘇木素-伊紅染色(HE染色)中的應(yīng)用。
[0046]優(yōu)選地，制備組織切片為制備小鼠心臟組織石蠟切片。
[0047]本發(fā)明提供的心臟組織固定劑及其制備方法和應(yīng)用具有如下有益效果:
[0048](I)本發(fā)明提供的心臟組織固定劑能使心臟組織形態(tài)保存完好，且房室隔膜等膜性結(jié)構(gòu)也能快速滲透，從而保證對房室間隔等重大心肌膜性疾病進行有效的檢測；
[0049](2)采用本發(fā)明提供的心臟組織固定劑能得到組織形態(tài)完整，且具有合適硬度的切片，從而能連續(xù)完整地進行切片，避免切片出現(xiàn)