改良亞麻薺油的脂肪酸分布的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年1月23日提出的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/589, 806的權(quán)益，并且 將其全文以引用方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和植物中的脂肪酸合成的調(diào)控。更具體地，本公開提 供用于改良亞麻薺 （Camelina sativa)油中的脂肪酸組成的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0004] 亞麻# (Camelina Sativa(L)Crtz.)是具有相對(duì)短的生長(zhǎng)期、抗寒且耐旱的油料 種子作物，并且可使用相對(duì)較少肥料生長(zhǎng)于邊際土地上。由于能夠生長(zhǎng)于主要食用作物不 生長(zhǎng)的區(qū)域和條件中，因此亞麻薺最近已在加拿大和美國(guó)被提出用于生物產(chǎn)業(yè)應(yīng)用，例如 生物柴油、潤(rùn)滑劑和油脂化學(xué)原料。
[0005] 亞麻薺油是從種子中提取的并且通常包含25%到35%的單不飽和脂肪酸和50% 到60%的多不飽和脂肪酸（PUFA)。高PUFA含量賦予了在精制油中的低氧化穩(wěn)定性，因此 限制了亞麻薺油在工業(yè)中的應(yīng)用。除了其低氧化穩(wěn)定性外，超過(guò)一個(gè)雙鍵的存在也會(huì)導(dǎo)致 例如復(fù)分解和臭氧分解的過(guò)程中的不合需要的副產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜诟牧紒喡樗j油中的脂肪酸的方法、構(gòu)建體等。
[0007] 在一個(gè)方面，提供用于改良亞麻薺中的脂肪酸分布的方法，其包括相對(duì)于對(duì)照亞 麻薺植物阻抑FAD2和FAD3的表達(dá)。在一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括阻抑FAEl的表 達(dá)。
[0008] 在另一方面，提供用于改良亞麻薺中的脂肪酸分布的方法，其包括相對(duì)于對(duì)照亞 麻薺植物阻抑FAD3的表達(dá)。
[0009] 在另一方面，提供用于改良亞麻薺中的脂肪酸分布的方法，其包括相對(duì)于對(duì)照亞 麻薺植物阻抑FAD2的表達(dá)。
[0010] 在另一方面，提供相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD3的轉(zhuǎn)基因亞麻薺 植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞麻薺油是從所述植物中提取的。
[0011] 在另一方面，提供相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD2的轉(zhuǎn)基因亞麻薺 植物。
[0012] 另一方面提供相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD2和FAD3的轉(zhuǎn)基因亞麻 薺植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，亞麻薺油是從所述植物的種子中提取的。
[0013] 另一方面提供相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和FAEl的轉(zhuǎn)基 因亞麻薺植物。
[0014] 在另一方面，提供包含F(xiàn)AD3的分離的核酸分子。
[0015] 另一方面提供包含阻抑FAD3的核酸序列的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物細(xì)胞 包含所述構(gòu)建體。
[0016] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :80、83和86 (FAD2)中所述的amiRNA的構(gòu)建體。
[0017] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :89、92和95 (FAD3)中所述的amiRNA的構(gòu)建體。
[0018] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :98和101 (FAEl)中所述的amiRNA的構(gòu)建體。
[0019] 在另一方面，提供用于產(chǎn)生高油酸亞麻薺油的方法，其包括（a)阻抑亞麻薺中的 FAD2、FAD3和FAE1，由此生成轉(zhuǎn)基因亞麻薺植物，和（b)從所述轉(zhuǎn)基因亞麻薺植物的種子中 提取油，其中所述油是高油酸的。
[0020] 在另一方面，提供用于降低亞麻薺油中的多不飽和脂肪酸的方法，其包括（a)阻 抑亞麻薺中的FAD2和FAD3,由此生成轉(zhuǎn)基因亞麻薺植物，和（b)從所述轉(zhuǎn)基因亞麻薺植物 產(chǎn)生的所述種子中提取油，其中所述油的多不飽和脂肪酸水平相對(duì)于來(lái)自非轉(zhuǎn)基因植物的 油降低。
[0021] 在另一方面，提供高油酸亞麻薺油，其中所述油包含至少60%油酸（占總脂肪酸 的％ )。在一些實(shí)施方案中，高油酸亞麻薺油是指具有至少約50%到90%油酸的亞麻薺 油。例如，高油酸亞麻薺油可具有約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%油酸。
[0022] 在另一方面，提供低亞麻酸（18 :3 Λ 9,12,15)亞麻薺油，其中所述油包含不超過(guò) 10%的亞麻酸（占總脂肪酸的％ )。
[0023] 在另一方面，提供用于降低亞麻薺中的亞麻酸（18 :3Δ 9,12,15)的方法，其包括 相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物阻抑FAD3。
[0024] 在另一方面，提供用于在亞麻薺中增加蓖麻油酸并降低12-羥基-順式-9， 15-十八碳二稀酸（densipolic acid)的方法，其包括相對(duì)于表達(dá)油酸輕化酶的對(duì)照亞麻 薺植物阻抑FAD2和FAD3。在一些實(shí)施方案中，高蓖麻油酸油是指具有至少約15%到30% 蓖麻油酸的亞麻薺油。例如，高蓖麻油酸亞麻薺油可具有約15%、20%、25%或30%蓖麻油 酸。
[0025] 在另一方面，提供具有高油酸和巨頭鯨魚酸和降低的多不飽和脂肪酸的亞麻薺 油。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述油是從阻抑FAD2和FAD3的植物中提取的。在一些實(shí)施方案 中，高巨頭鯨魚酸亞麻薺油是指具有至少約20-40%巨頭鯨魚酸的亞麻薺油。例如，高巨頭 鯨魚酸亞麻#油可具有約20%、25%、30%、35%或40%巨頭鯨魚酸。
[0026] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :80、83和86 (FAD2)中所述的amiRNA的轉(zhuǎn)基因 植物。
[0027] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :89、92和95 (FAD3)中所述的amiRNA的轉(zhuǎn)基因 植物。
[0028] 在另一方面，提供包含SEQ ID NO :98和101 (FAEl)中所述的amiRNA的轉(zhuǎn)基因植 物。
[0029] 在另一方面，存在使用amiRNA改良亞麻薺油分布的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述 amiRNA 陳述于 SEQ ID N0:80、83、86(FAD2) ;SEQ ID N0:89、92 和 95(FAD3);和 / 或 SEQ ID NO :98、101 (FAEl)中。
[0030] 在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁南鄬?duì)于對(duì)照亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD2、FAD3和 FAEl的轉(zhuǎn)基因亞麻薺植物中提取的油。
[0031] 在另一方面，申請(qǐng)人提供用于降低亞麻薺中的12-羥基-順式-9,15-十八碳二烯 酸的方法，其包括相對(duì)于對(duì)照亞麻薺植物阻抑FAD3。
[0032] 在另一方面，提供用于改良亞麻薺中的脂肪酸分布的方法，其包括相對(duì)于對(duì)照亞 麻薺植物阻抑FAD2和FAEl的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因亞麻薺相對(duì)于對(duì)照亞麻薺 植物具有受到阻抑的FAD2和FAEl的表達(dá)
[0033] 在另一方面，申請(qǐng)人提供用于改良亞麻薺中的脂肪酸分布的方法，其包括相對(duì)于 對(duì)照亞麻薺植物阻抑FAD3和FAEl的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因亞麻薺相對(duì)于對(duì)照 亞麻薺植物具有受到阻抑的FAD3和FAEl的表達(dá)。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1 :含有amiRNA表達(dá)盒和選擇標(biāo)記DsRed的T-DNA插入物的示意性圖譜。 PsoyBcon :種子特異性大豆β伴大豆球蛋白啟動(dòng)子；Tphas :菜豆球蛋白（Phaseolin)終止 子序列；PCMV :組成型木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子；Tnos :來(lái)自土壤桿菌胭脂堿合酶基因的終 止子序列；
[0035] 圖2 :亞麻薺種子的靶標(biāo)脂肪酸分布；
[0036] 圖3 :高油酸亞麻薺 Τ2種子的脂肪酸分布；
[0037] 圖4 :18 :3-沉默的亞麻薺 Τ2種子的脂肪酸分布；
[0038] 圖5 :單個(gè)amiRNA表達(dá)盒的T-DNA插入物的示意性圖譜。A)FAD2 amiRNA和選擇 標(biāo)記 DsRed ;B)FAD3 amiRNA 和 DsRed ;和 C) FAEl amiRNA 和 DsRed。PsoyBcon :種子特異性 大豆β伴大豆球蛋白啟動(dòng)子；Tphas :菜豆球蛋白終止子序列；PCMV :組成型木薯葉脈花葉 病毒啟動(dòng)子；Tnos :來(lái)自土壤桿菌胭脂堿合酶基因的終止子序列。
[0039] 圖6 :串聯(lián)amiRNA表達(dá)盒的T-DNA插入物的示意性圖譜。Α)串聯(lián)amiRNA表達(dá)盒 FAD2 amiRNA、FAD3 amiRNA和FAEl amiRNA，其側(cè)接有種子特異性大豆β伴大豆球蛋白啟動(dòng) 子和菜豆球蛋白終止子序列Tphas的3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；Β)串聯(lián)amiRNA表達(dá)盒FAD2 amiRNA、 FAD3 amiRNA，且側(cè)接有種子特異性大豆β伴大豆球蛋白啟動(dòng)子和菜豆球蛋白終止子序列 Tphas的3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；FAEl amiRNA表達(dá)盒，其側(cè)接來(lái)自大豆的Gy 1和來(lái)自豌豆豆球蛋 白 A2 基因的 3' 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（Rerie 等人（1991)Mol. Gen. Genet. 225 :148-157)。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，雖然亞麻薺可經(jīng)受住不合需要的生長(zhǎng)條件，但常規(guī)亞麻薺油的 脂肪酸分布限制了其用途。亞麻薺油通常包含25%到35%的單不飽和脂肪酸和50%到 60%的多不飽和脂肪酸（PUFA)。高PUFA含量賦予了低氧化穩(wěn)定性，因此限制了亞麻薺油在 工業(yè)中的應(yīng)用。除了其低氧化穩(wěn)定性外，超過(guò)一個(gè)雙鍵的存在也會(huì)導(dǎo)致例如復(fù)分解和臭氧 分解的過(guò)程中的不合需要的副產(chǎn)物。因此，為了與其它工業(yè)原料競(jìng)爭(zhēng)，本發(fā)明人預(yù)期改良亞 麻薺油的脂肪酸分布。
[0041] 因此且在一個(gè)方面，申請(qǐng)人預(yù)期增加單不飽和脂肪酸，例如油酸（18 :1，順 式-9-十八碳烯酸）、巨頭鯨魚酸（20:1，順式-11-二十碳烯酸）和芥酸（22:1，順 式-13-二十二碳烯酸），而降低亞油酸（18 :2,順式，順式-9，12-十八碳二烯酸）及α亞 麻酸（18 :3,全順式-9,12,15-十八碳三烯酸）。
[0042] 如此，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，例如，脂肪酸去飽和酶2(FAD2)、脂肪酸去飽和酶3(FAD3)和/ 或脂肪酸延長(zhǎng)酶I