專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)方法。
棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是隨著棉花組織和細胞培養(yǎng)的不斷進步而發(fā)展起來的。自從Beasley(Beasely C A.1971..Bioscience.21906-907)首次從陸地棉誘導(dǎo)出愈傷組織以來，棉花組織和細胞培養(yǎng)取得了一定的進展。現(xiàn)已建立了棉花組織(Beasely C A，et al.1973.American Journal of Botany.60130-139，1974.American Journal of Botany.61188-194；Stewart，1977，Planta.137113-117，1981.Environmental andExperimental Botany 21301-315；Bajaj，1986 Ind J ExpBiol.24581-583；Gould，1991.Plant Cell Rep.1012-16；Hemphill，1998.Plant Cell Rep.17273-278)、細胞(Price，1977.Plant Science Letters.10115-119，1979.Planta.145305-307；Davidonis，1983.Plant Science Letters.3289-93；Gawel，1986.Plant Cell Rep 5457-459；Shoemaker，1986.Plant CellRep.5178-181；Trolinder，1987.Plant Cell Rep.6231-234；陳志賢，1987.中國農(nóng)業(yè)科學(xué).20(5)6-11；Finer，1988.Plant CellRep.7399-402)和原生質(zhì)體(Firoozabady，1986.Plant Cell Rep5127-131；陳志賢，1989.植物學(xué)報。31(12)966-969；Peeters，1994.Plant Cell Rep.13208-211)等培養(yǎng)系統(tǒng)，并進行了細胞分化、胚胎發(fā)生機理以及胚胎發(fā)生能力的遺傳分析等相關(guān)研究(Trolinder，1988a.Plant Cell，Tissue and Organ Culture.1231-42，1988b.Plant Cell，Tissue and Organ Culture.1243-53；張獻龍，1992.作物學(xué)報18(3)176-181；張家明，1997中國農(nóng)業(yè)科學(xué)30(3)36-43)，為植物基因工程應(yīng)用于棉花遺傳改良打下了基礎(chǔ)。
目前，棉花遺傳轉(zhuǎn)化主要是利用根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行的。1984年Horsch等首先建立根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化植物技術(shù)體系，這種方法已被用于許多雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化(Fraley，1986.CRC Critical Reviews inPlant Science.41-46)。用該方法轉(zhuǎn)化棉花的報道最早見于1987年。Umbeck等(1987.Bio/Technology.5263-266)首次采用該方法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Npt-II)和氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)導(dǎo)入陸地棉栽培品種珂字棉312、310中。通過體細胞胚胎發(fā)生途徑獲得了含Npt-II和Cat基因的轉(zhuǎn)化再生植株。同年，F(xiàn)iroozabady(1987.Plant.Mol.Biol.10105-116)等進一步完善了轉(zhuǎn)化再生技術(shù)體系，成功地將Npt-II基因和章魚堿合成酶基因(Ocs)轉(zhuǎn)入了陸地棉栽培品種珂字201。后來的研究更集中在將人們感興趣的目的基因?qū)朊藁?。各國研究者們利用根農(nóng)桿菌已分別將蘇云金桿菌殺蟲毒蛋白基因B.t.(Perlark，1990.Bio/Technology.8939-943；Cousins，1991.Aust.J Plant Physiol.18481-494)、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI(王偉，1998.高技術(shù)通訊.8(5)1-5)、2，4-D單氧化酶基因tfdA(Bayley，1992.Theor Appl Genet.83645-649；Lyon，1993.TransgenicResearch.2162-169)等導(dǎo)入了陸地棉。
雖然根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化取得了以上進展，但限制其廣泛使用的最大局限仍在于嚴格的基因型限制。大多數(shù)研究仍限于珂312、315和201等模式品種上。這些轉(zhuǎn)化的模式品種只能作為含有有價值外源基因的種質(zhì)材料，再通過傳統(tǒng)育種手段將其有用性狀轉(zhuǎn)育至生產(chǎn)上大面積推廣的品種中。這勢必延長了轉(zhuǎn)基因棉花品種的選育和推廣周期。因此也有研究者嘗試用其它方法解決以上問題。如McCabe(1993.Plant Cell，Tissue and Organ Culture.33(30)227-236)、Chlan(1995.Plant Mol Biol Rep.13(1)31-37)和John(1996.PNAS USA.93(23)12768-12773)等用基因槍法轉(zhuǎn)化棉花莖尖分生組織。但該方法存在易產(chǎn)生假陽性嵌合體等缺陷。
從目前來看，較為現(xiàn)實的辦法仍然是利用簡便易行、成熟可靠的根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但需克服基因型局限、提高轉(zhuǎn)化和再生頻率以及轉(zhuǎn)化植株的定植成活率等。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)化植株再生頻率低的缺點，本發(fā)明的目的是提供一種新的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括以下步驟a.用帶有外源基因的載體轉(zhuǎn)化植物受體組織；b.將轉(zhuǎn)化的受體組織置于選擇培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)，產(chǎn)生幼苗；c.再生植株長出后，以轉(zhuǎn)化植株的頂芽或側(cè)芽作接穗，以同種植株作嫁接砧木進行嫁接；d.使嫁接植物自然生長，結(jié)實。
上述方法中用帶有外源基因的載體轉(zhuǎn)化植物受體組織可以是現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法，例如，將轉(zhuǎn)化植物受體組織與有轉(zhuǎn)化能力的根農(nóng)桿菌接觸，該菌株所含Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)含有外源目的基因和選擇標記基因，轉(zhuǎn)化所述組織。
植物受體組織可以是來自成熟或未成熟的植物種子，經(jīng)消毒和滅菌，在發(fā)芽培養(yǎng)基上發(fā)芽，長出子葉、胚芽、胚軸、胚根或長出幼苗的根莖葉等。所述的種胚的胚組織最好是未成熟的下胚軸和子葉。未成熟種子是那些在生理上未完成營養(yǎng)物質(zhì)積累，發(fā)育上未達到種子發(fā)育的最后階段的種子。
本發(fā)明涉及的植物是指任何可進行嫁接的植物，這些植物包括農(nóng)作物、蔬菜、水果、園藝類以及木本植物，農(nóng)作物是棉花、大豆、蕓苔屬(油菜)，蔬菜是西瓜、番茄，水果是蘋果、梨樹和櫻桃，園藝類是各種觀賞花，木本植物是楊樹。
有轉(zhuǎn)化能力的根農(nóng)桿菌包含一個稱之為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒(或Ti質(zhì)粒)，該質(zhì)粒具備一種固有的能力，可將其自身的稱之為T-DNA(轉(zhuǎn)化-DNA)的片段轉(zhuǎn)化成感染植物細胞的基因組，野生型根農(nóng)桿菌利用此種能力來遺傳轉(zhuǎn)化植物的感染細胞，以至植物細胞成為腫瘤細胞。把野生型根農(nóng)桿菌的T-DNA中致瘤基因用外源目的基因和選擇標記基因替換，僅保留邊界序列，含有這種人工改造的Ti質(zhì)粒根農(nóng)桿菌被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域。
受體組織與根農(nóng)桿菌接觸是把胚萌發(fā)后的無菌苗切塊放入稀釋的根農(nóng)桿菌菌液中浸泡適宜的時間。選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入抗生素類物質(zhì)，使其能夠篩選轉(zhuǎn)化組織中標記基因，含有卡那霉素和潮酶素的培養(yǎng)基。
所提及的外源目的基因是指在生產(chǎn)上有應(yīng)用價值的基因抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因、抗逆基因以及品質(zhì)改良基因；所述的抗蟲基因是豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因、大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)基因、水稻巰基蛋白酶抑制劑(OC)基因、菜豆α-淀粉酶抑制劑(α-Al)基因、豌豆外源凝集素(P-lec)基因、雪花蓮?fù)庠茨?GNA)基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑-II(PI-II)基因、蘇云桿菌毒蛋白(B.t.toxin)基因、通過人工修飾的抗蟲基因，以及兩個抗蟲基因融合構(gòu)成的抗蟲基因。
再生植株是在受體組織與根農(nóng)稈菌接觸后，經(jīng)共培養(yǎng)，目的在于促使T-DNA插入植物基因組。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中不含抗生素，但是，在其中添加乙酰丁香酮和去除微量元素Co。共培養(yǎng)時間不應(yīng)過長，否則會造成根農(nóng)桿菌生長過于旺盛，并影響隨后的殺菌。共培養(yǎng)時在培養(yǎng)基上加上無菌濾紙也是為了防止受體組織表面的根農(nóng)桿菌旺盛生長。
共培養(yǎng)后的組織塊轉(zhuǎn)入抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷，將愈傷轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出胚狀體，經(jīng)分化培養(yǎng)基把胚狀體培養(yǎng)成為幼苗，即再生植株。
再生芽高度在1.5cm以上時即可嫁接，再生植株的頂芽和側(cè)芽均可作嫁接的接穗。頂芽是指植株生長點及周圍的幼葉，側(cè)芽是指植株葉腋長出的芽。
嫁接的砧木以同種植物或近緣植物較好。棉花嫁接砧木最好采用棉屬植物，棉花子葉期至吐絮前均可進行嫁接。
本發(fā)明利用美國5
3 Prime公司的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II酶聯(lián)免疫鑒定試劑盒(NPTII ELISA KIT)提供的方法，對轉(zhuǎn)化植株后代進行快速鑒定以及檢測純合轉(zhuǎn)基因株系。
本發(fā)明開創(chuàng)性地利用嫁接代替移栽，極大地提高了轉(zhuǎn)化植株的定植成活率，縮短了緩苗時間并建立了轉(zhuǎn)化植株當代的繁殖系數(shù)。嫁接的方法適用于提高轉(zhuǎn)基因棉花再生植株的定植效率。只要在當代急需要生產(chǎn)的，均可以采用本發(fā)明所述的嫁接方法在當代得到足夠的材料。本發(fā)明不僅局限于棉花，而且適用于在研究各種可嫁接植物材料過程中的生產(chǎn)和保存等。


圖1顯示下胚軸在卡那霉素抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2個月后愈傷組織的生長情況。圖2經(jīng)Npt-ELISA檢測呈陽性的愈傷組織經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)獲得體系胞胚。圖3示體系胞胚狀體的萌發(fā)。圖4用于Npt-II ELISA、PCR和PCR Southern檢測的再生植株。圖5嫁接。圖6嫁接7天后接口處即可見到愈傷組織生成。圖7嫁接90天后的轉(zhuǎn)基因棉株。
實施例實施例1 嫁接轉(zhuǎn)基因棉株的獲得本實施例用來說明使用根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對陸地棉(Gossypiumhirsutum L.)栽培品種籽苗下胚軸切段進行轉(zhuǎn)化的步驟。所用的菌株帶有標記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT-II)基因和目的基因，目的基因包括豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因、蘇云金桿菌毒蛋白(B.t.toxin)基因、Cry1A(c)和CpTI融合基因以及雪花蓮?fù)庠茨?GNA)基因。本實施例詳細描述如下根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)從根農(nóng)桿菌儲液中(20％甘油，-70C保存)取少量菌液，于含有相應(yīng)抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。取單菌落再度轉(zhuǎn)接于同樣的液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長旺盛期(約36h)。取少許菌體轉(zhuǎn)接于20ml含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜(約17h)，次日以2％的接種量轉(zhuǎn)接于20ml不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，并補加乙酰丁香酮至終濃度為100uM/L。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-5h，到達對數(shù)生長中期時，用液體MS基本培養(yǎng)基稀釋到肉眼稍見渾濁(OD600＝0.1)，以備轉(zhuǎn)化之用。根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基為YEB。YEB培養(yǎng)基成份(1L)Beef Extract Proteose Peptone Yeast Extract Sucrose MgSO4.7H2O pH5g 5g 10g 5g 0.5g 7.2注固體YEB培養(yǎng)基需加1.5％的Agar。
轉(zhuǎn)化受體的制備本發(fā)明采用成熟及未成熟棉花種子的胚組織作為外植體進行根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。陸地棉栽培品種棉籽經(jīng)濃硫酸脫絨后用自來水沖凈，15％H2O2表面消毒2-4h，無菌水沖洗3次并于其中浸泡24h，待露白后剝?nèi)シN皮，于GA7培養(yǎng)盒中的發(fā)芽培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)。發(fā)芽培養(yǎng)基成份(1L)1/2 MS鹽，Agar 6.0g，pH 5.8。
3-5d后用于轉(zhuǎn)化。取健壯的無菌苗下胚軸切成0.5-0.7cm的節(jié)段，放入稀釋的根農(nóng)桿菌菌液中浸泡10-15min。
以種皮剛轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚挠啄鄯N子萌發(fā)而來的下胚軸切段作為轉(zhuǎn)化受體，同時將抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的MS大量元素加倍，并以成熟種子萌發(fā)的無菌苗下胚軸作為對照，比較兩種方法的抗性愈傷組織出愈狀況及體細胞胚狀體分化頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化2個月后由幼嫩種子下胚軸誘導(dǎo)而來的抗性愈傷組織出愈率達90％以上，略高于對照水平。在經(jīng)過胚狀體誘導(dǎo)階段之后統(tǒng)計，前者的分化頻率高于后者，三個供試品種(J7、JH321、L9)分別達9％、7％和2％，而對照的相應(yīng)品種的分化頻率分別僅為4％、4％和0。(見表1)表1幼嫩種子下胚軸轉(zhuǎn)化結(jié)果基因型 外植體數(shù)抗性愈傷組織出愈率 分化頻率J7100 93 9L9100 90 2JH321 100 90 7J7(CK)100 82 4L9(CK)100 77 0JH321(CK) 100 90 4共培養(yǎng)下胚軸或子葉經(jīng)過根農(nóng)桿菌菌液浸泡侵染后，用無菌濾紙將其表面的菌液吸干，置于覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上。共培養(yǎng)培養(yǎng)基成份(1L)MS鹽 維生素2，4-D KT 葡萄糖 Gelrite MgCl2Acetosyringone pH(去除CoCl2)B50.1mg0.1mg 30g 2.0g 0.75g 200uM 4.5共培養(yǎng)的目的在于促使根農(nóng)稈菌將其T-DNA插入植物基因組中，因此共培養(yǎng)培養(yǎng)基中不含抗生素。共培養(yǎng)的時間不應(yīng)過長，否則會造成根農(nóng)桿菌生長過于旺盛，影響隨后的殺菌。共培養(yǎng)時培養(yǎng)基上加無菌濾紙也是為了防止胚組織表面的根農(nóng)桿菌旺盛生長。
有研究表明，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮會促進農(nóng)桿菌致毒性。同時，Stachel等(1986.Cell.46325-333)還發(fā)現(xiàn)pH值較低時容易誘導(dǎo)Vir基因的表達。本發(fā)明研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化確有促進作用，尤其是當pH值較低和去除某些微量元素如Co的時候。然后接種到覆有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于28℃暗培養(yǎng)。
抗性愈傷組織的誘導(dǎo)將共培養(yǎng)2-3天的胚組織轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織誘導(dǎo)。2個月后，轉(zhuǎn)化組織在含Km的培養(yǎng)基上能正常脫分化，長出抗性愈傷組織；而作為對照的未轉(zhuǎn)化組織在同樣的培養(yǎng)基上卻未能誘導(dǎo)出愈傷組織(圖1)?？剐杂鷤M織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份(1L)MS鹽 維生素 2，4-D KT葡萄糖 Gelrite MgCl2KmCefpHB5 0.1g0.1g 30g2.0g 0.75g 80mg 500mg 5.82-3個月后，取每一塊抗性愈傷組織的一部分進行Npt-II活性檢測，呈陽性的原愈傷組織克隆得以保留和繼代。Npt-II呈陽性的愈傷組織經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)獲得體細胞胚狀體，繼而進行植株再生。本發(fā)明采用ELISA法將Npt-II活性檢測呈陽性的原克隆保留，同時棄去陰性原克隆。
取棉花轉(zhuǎn)化愈傷組織或再生植株葉片0.2g，裝入1.5ml Effendorf管，冰浴條件下用小玻璃棒迅速研磨，將葉片磨成勻漿狀，加入提

，混勻后4℃14000rpm離心8min，取上清液，即為待測樣品。利用美國5 Prime 3Prime公司的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II酶聯(lián)免疫鑒定試劑盒(NPTII ELISA KIT)提供的方法測定樣品。
由下表可以看出，在含Km的抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長出的愈傷組織并非均為Npt-II陽性，其中有相當大的比例(37.5-52.3％)為假陽性。因此，及時檢測和淘汰是減輕繁重繼代及后期工作的有效方法。本發(fā)明采用的愈傷組織階段標記基因的相關(guān)檢測包括但不限于Npt-II基因。愈傷塊數(shù)Npt-II陽性塊數(shù) 比例％1 32 2062.52 44 2147.73 50 2958.0胚狀體的誘導(dǎo)挑選灰黃疏松的NptII陽性愈傷組織繼代至胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份(1L)Ms鹽維生素葡萄糖GelriteMgCl2pH(KNO3加倍) B530g 2.0g 0.75g5.8植株再生待米黃色致密的顆粒狀胚狀體(圖2)生成以后，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行植株再生。分化培養(yǎng)基成份(1L)MS鹽維生素葡萄糖 Aspragine GlutaminGelriteMgCl2pH(KNO3加倍)B523g 0.5g 1.0g2.0g 0.75g 6.5胚狀體在分化培養(yǎng)基上經(jīng)過成熟、萌發(fā)(圖3)和植株再生等階段而獲得再生植株。當棉花再生植株長至10片左右真葉(圖4)時，采用Npt-II(或其它抗性基因產(chǎn)物)再次檢測以及PCR和PCR Southern雜交鑒定，均呈陽性者初步確定為轉(zhuǎn)化植株，這種轉(zhuǎn)化植株帶有必須的外源基因，即目的基因，采用嫁接的方法加以繁殖。
轉(zhuǎn)化植株的頂芽和側(cè)芽均可作為接穗，嫁接砧木應(yīng)采用棉屬植物，砧木在子葉期至吐絮前均可進行嫁接用鋒利刀片削去砧木的頂端部分，只保留子葉和1-2片真葉。將莖桿從中間縱向剖開(約3-4cm)，插入削成扁平狀的接穗，用細繩系緊并用Parafilm石蠟?zāi)だp裹(圖5)。整個植株用透光性好的塑料袋或地膜罩蓋保濕。前7d應(yīng)避免陽光直接照射。7d后去除石蠟?zāi)ず图毨K，10d后去除罩蓋，置于陽光下使其正常生長，結(jié)實。
嫁接能利用砧木發(fā)達的根系，因此所需緩苗時間很短。7d后解除石蠟?zāi)ず图毨K，即可看到砧木和接穗已通過愈傷組織緊密地連結(jié)在一起(圖6)，新的真葉也已開始生長。同期移出培養(yǎng)盒的試管苗，經(jīng)嫁接的植株長勢旺盛，順利開花并結(jié)鈴(圖7)，比移栽植株提前了1-2個月。這對于生長周期較長的棉花來說是至關(guān)重要的。嫁接亦可挽救一些利用移栽方法難于成活的幼苗，如根系發(fā)育不良的幼苗以及一部分無根苗、根苗和畸形苗等，極大地提高了轉(zhuǎn)化植株的定植成活率。利用頂芽和側(cè)芽的嫁接以及嫁接后去除頂端優(yōu)勢、誘使轉(zhuǎn)化植株的側(cè)芽更多萌生以便二次嫁接等方法，在轉(zhuǎn)化植株當代即可獲得生產(chǎn)的大量再生植株。以這些遺傳背景完全相同的植株為材料，在轉(zhuǎn)基因植株當代(T0)即可進行各項分子鑒定、酶學(xué)檢測以及生物學(xué)檢測等。
我們利用4種基因型轉(zhuǎn)化植株頂芽的嫁接成活率達95.2-100％，側(cè)芽的也可達86.8-92.5％，遠高于直接移栽入土法、水培練苗法及蛭石練苗法的移栽成活率(表2)。并用于進一步鑒定。目前已收獲T2代種子。表2-1轉(zhuǎn)基因陸地棉的直接移栽效果基因型 幼苗數(shù)存活幼苗數(shù) 存活率 緩苗時間L9 7 3 42.9 39～44J7 10 5 50.0 44～50JH321 10 4 40.0 42～46XLZ1 9 5 55.5 40～43表2-2轉(zhuǎn)基因陸地棉水培后的移栽效果基因型 幼苗數(shù) 存活幼苗數(shù) 存活率 緩苗時間L99 4 44.4 42～46J77 3 42.9 40～51JH321 8 3 37.5 45～53XLZ1 104 40.0 48～55表2-3轉(zhuǎn)基因陸地棉經(jīng)蛭石培養(yǎng)后的移栽效果基因型 幼苗數(shù) 存活幼苗數(shù) 存活率 緩苗時間L96 2 33.3 60～65J78 3 37.5 71～73JH321 103 30.0 66～69XLZ1 9 2 22.2 58～63表2-4轉(zhuǎn)基因陸地棉的嫁接效果基因型 頂芽嫁接 側(cè)芽嫁接接穗數(shù)存活率 緩苗時間 接穗數(shù) 存活率緩苗間L910 100.0 7～9 17 88.2 8～10J 21 95.2 8～10 38 86.8 9～12JH321 20 100.0 8～11 31 90.3 9～12XLZ1 25 96.0 6～8 40 92.5 8～10實施例2 共培養(yǎng)培養(yǎng)基變化的作用重復(fù)實例1的步驟，本發(fā)明去除共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的微量元素Co，將pH值調(diào)至4.5，并添加乙酰丁香酮至終濃度為200uM，同時以添加等量乙酰丁香酮、pH值為5.8以及不添加乙酰丁香酮、pH值為5.8兩種處理為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成對轉(zhuǎn)化效率有明顯的影響。由下表可以看出(表3)，GP1培養(yǎng)基中不添加乙酰丁香酮、pH值為5.8，抗性愈傷組織的出愈率和愈傷組織的鮮重均較低；GP2培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮，pH值仍為5.8，抗性愈傷組織的出愈率和愈傷組織的鮮重已較前一種有了較為明顯的提高；GP3培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮，同時去除微量元素Co，并將pH值調(diào)至4.5，對誘導(dǎo)抗性愈傷組織的效果最好。愈傷組織不但長滿下胚軸的切面，而且逐漸擴展到整個下胚軸表面，出愈率也有了極大的提高。表3共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分對轉(zhuǎn)化效率的影響培養(yǎng)基 愈傷組織重量 抗性愈傷組織出愈率XLZ1J7 L9 XIZ1J7 L9GP1 33.041.039.00.310.290.39GP2 51.060.058.00.440.540.48GP3 86.092.088.00.780.620.71實施例3 轉(zhuǎn)化植株后代的快速鑒定和獲得純合轉(zhuǎn)基因株系重復(fù)實例1的步驟，本發(fā)明采用發(fā)芽培養(yǎng)基中添加Km來鑒定轉(zhuǎn)化后代，將Km濃度由500～750mg/L提高到1000mg/L時，效果十分理想。接種5天后發(fā)現(xiàn)，Npt-II陰性和陽性植株的種子的生長均受到很大抑制，胚軸和胚根的伸長速度遠遠低于生長在不含Km的發(fā)芽培養(yǎng)基上的正常種苗，但子葉顏色上明顯有差異。陽性株種苗呈綠色，而陰性株呈黃色(表4)表4轉(zhuǎn)化植株后代在Km發(fā)芽培養(yǎng)基上的發(fā)芽情況序號幼芽重量胚軸和胚根的長度子葉的顏色 備注J12-10.258 3.0Y --J12-20.237 2.4Y --J12-30.211 2.1Y --J12-40.306 2.6Y --J12-50.371 3.2Y --J12-60.181 2.7Y --J12-70.434 2.5G +J12-80.894 2.3G +J12-90.593 2.5G +J12-10 0.289 2.4G +J12-11 0.573 2.5G +J12-12 0.494 2.7G +--Npt-II negative plant；+Npt-II positive plantYYellowGGreen.
該方法用于轉(zhuǎn)基因棉純合后代的快速獲得，可采取如下步驟農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花外植體，誘導(dǎo)抗性愈傷組織，經(jīng)過體細胞胚胎發(fā)生和植株再生等階段，最終獲得T0代再生植株，經(jīng)分子檢測確證其為轉(zhuǎn)基因植株后，再通過生物檢測篩選出抗蟲性好的植株，單株收獲T1代種子，經(jīng)卡那霉素抗性檢測棄去約1/4純隱性后代個體(單位點插入情況)，其余全部種入大田；T1代群體單株收獲種子(T2代)，每株檢測30-40粒種子，如全部為卡那霉素抗性表型，即意味著該T1代單株為轉(zhuǎn)基因純合植株，所獲得的T2代群體即為轉(zhuǎn)基因純合株系。此程序簡單快速，在T2代就可以得到純合株系。根據(jù)上述方法，對轉(zhuǎn)基因T0代種植后，單株收獲T1種子，種植T1代植株，用NPTII檢測81株，61株陽性，即NptII顯性，20株陰性，分離比3.05∶1，符合孟德爾規(guī)律，把陽性T1代植株自交收獲T2代種子，從T2代植株中檢測出6個陽性純合轉(zhuǎn)基因株系。實施例4 不同植物表達載體對抗性愈傷組織出愈的影響重復(fù)實例1的步驟，不同的是采用雙價抗蟲基因植物表達載體pBinLK，其含有碗豆外源凝集素基因(Pea Lectin)和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(Soybean Kunitz Tripsin Inhibitor)基因，獲得了含有以上兩種抗蟲基因的陸地棉植株，并收獲T2代種子。采用雪花蓮?fù)庠此?Galanthus nivalsagglutinin，GNA)基因作為目的基因，構(gòu)建抗蟲植物表達載體pBinGNA，獲得了含有該基因的陸地棉轉(zhuǎn)化植株，并收獲T1代種子。采用蘇云桿菌(Bacillusthuringiensis，B.t.)殺蟲毒蛋白基因作為目的基因，構(gòu)建抗蟲植物表達載體pBinMoBc和pBinoBc，獲得了含有該基因的陸地棉轉(zhuǎn)化植株，并收獲T1代種子。研究表明，不同植物表達載體對相同基因型下胚軸的轉(zhuǎn)化效率沒有明顯差異，表現(xiàn)在抗性愈傷組織的出愈率的愈傷鮮重上均無大的差異(表5)。表5不同植物表達載體對抗性愈傷組織出愈的影響*植物表達載體 抗性愈傷組織的出愈率 愈傷鮮重XLZ1JH321J7 XLZ1JH321J7pBinLK86.080.082.0 0.590.600.66pBinGNA 84.088.090.0 0.570.690.70pBinMoBc 82.088.090.0 0.710.680.55pBinoBc 92.090.086.0 0.570.640.61*外植體數(shù)各為50。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括以下步驟a.用帶有外源基因的載體轉(zhuǎn)化可嫁接植物的受體組織；b.將轉(zhuǎn)化的受體組織置于選擇培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)，產(chǎn)生幼苗；c.再生植株長出后，以轉(zhuǎn)化植株的頂芽或側(cè)芽作接穗，以同種植物或近緣植物作嫁接砧木進行嫁接；d.使嫁接植物自然生長，結(jié)實。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用帶有外源基因的載體轉(zhuǎn)化植物受體組織是將待轉(zhuǎn)化植物受體組織與有轉(zhuǎn)化能力的根農(nóng)桿菌接觸，該菌株所含Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)含有外源目的基因和選擇標記基因，轉(zhuǎn)化所述組織。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是可嫁接植物。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的可嫁接植物是農(nóng)作物、蔬菜類、水果類、園藝類及其它木本植物。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的農(nóng)作物是棉花、大豆、蕓苔屬(油菜)；所述的蔬菜類是西瓜、番茄；所述的水果類是蘋果、梨樹和櫻桃；所述的園藝類是觀賞花；所述的木本植物是楊樹。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是棉花。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的受體組織是指成熟或未成熟種胚萌發(fā)的胚根、胚軸、胚芽或子葉，或者幼苗的根莖葉組織。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因是不但能夠改變受體植物性狀而且具有應(yīng)用價值的基因。
9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有應(yīng)用價值的基因是抗逆基因、抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因、品質(zhì)改良基因、纖維品質(zhì)改良基因以及報告基因。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的抗蟲基因是豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因、大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)基因、水稻巰基蛋白酶抑制劑(OC)基因、菜豆α-淀粉酶抑制劑(α-Al)基因、豌豆外源凝集素(P-lec)基因、雪花蓮?fù)庠茨?GNA)基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑-II(PI-II)基因、蘇云桿菌毒蛋白(B.t.toxin)基因、通過人工修飾的抗蟲基因，或者由兩個抗蟲基因融合構(gòu)成的抗蟲基因。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體帶有單價或多價目的基因。
12.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的待轉(zhuǎn)化植物受體組織與有轉(zhuǎn)化能力的根農(nóng)桿菌接觸是通過將二者在一起共培養(yǎng)進行的，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有乙酰丁香酮并去除了微量元素Co。
13.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，棉花再生芽高度在1.5cm以上時進行嫁接。
14.按照權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的嫁接砧木是棉屬植物。
15.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的棉屬植物是在子葉期至吐絮前作嫁接砧木的。
16.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的選擇標記基因用于對轉(zhuǎn)化組織、轉(zhuǎn)化植株、轉(zhuǎn)化植株后代的鑒定和純合轉(zhuǎn)基因株系的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法,包括:用帶有外源基因的載體轉(zhuǎn)化可嫁接植物的受體組織;將轉(zhuǎn)化的受體組織置于選擇培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的誘導(dǎo),產(chǎn)生幼苗;再生植株長出后,以轉(zhuǎn)化植株的頂芽或側(cè)芽作接穗,以同種植物或近緣植物作嫁接砧木進行嫁接;使嫁接植物自然生長,結(jié)實。利用本發(fā)明的方法可提高了轉(zhuǎn)化植株的定植成活率,縮短了緩苗時間。
文檔編號A01H1/00GK1229140SQ9910343
公開日1999年9月22日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月30日
發(fā)明者朱禎, 王偉 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所