專利名稱：用混合雙鏈寡核苷酸在植物中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)遺傳改變的用途的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明領(lǐng)域涉及改良現(xiàn)有植物品系的方法，并涉及具有希望的性狀的新品系的開發(fā)。通過重組DNA技術(shù)獲得遺傳改變過的植物的現(xiàn)有方法，能夠?qū)㈩A(yù)先構(gòu)建的外源基因?qū)腚S機(jī)的、特異位點(diǎn)，即所謂轉(zhuǎn)基因。相反，本發(fā)明使得技術(shù)人員能夠?qū)χ参锏奶囟ìF(xiàn)存基因進(jìn)行特殊改變。本發(fā)明使用具有混合的RNA-樣核苷酸和DNA-樣核苷酸的雙鏈寡核苷酸實(shí)現(xiàn)所述改變，以下稱之為“混合雙鏈寡核苷酸”或MDON。2.發(fā)明背景2.1 MDON及其實(shí)現(xiàn)特定遺傳改變的用途混合雙鏈寡核苷酸(MDON)及其在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遺傳改變的用途披露于授予Kmiec的US5,565,350中(Kmiec I)。Kmiec I特別披露了具有兩條鏈的MDON，其中，第一股鏈含有至少8個(gè)RNA-樣核苷酸的兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段由4到大約50 DNA-樣核苷酸的第三片段隔開，該片段被稱為“插入DNA片段”。第一股鏈的核苷酸與第二股鏈的DNA-樣核苷酸堿基配對(duì)。所述第一和第二股鏈還通過一段單鏈核苷酸額外連接在一起，以便所述第一和第二股鏈?zhǔn)菃我还押塑账徭湹囊徊糠?。Kmiec I還披露了將特定遺傳改變導(dǎo)入靶基因的方法。根據(jù)Kmiec I，選擇所述RNA片段的序列，使其與靶基因的第一和第二片段的序列同源，即相同。所述插入DNA片段的序列與位于第一和第二片段之間的靶基因的序列同源，只有一個(gè)不同部位，該部位被稱為“異源區(qū)”。該異源區(qū)可以進(jìn)行插入或缺失，或者可以含有一個(gè)或幾個(gè)與靶基因序列錯(cuò)配的堿基，以便實(shí)現(xiàn)取代。根據(jù)Kmiec I，由所述異源區(qū)指導(dǎo)對(duì)所述靶基因的序列進(jìn)行改變，使得該靶基因變成與MDON的序列同源。Kmiec I特別披露了含有可用于MDON的核苷酸的核糖和2’-O甲基核糖，即2’-甲氧基核糖，并披露了可用作DNA-樣核苷酸的含有天然存在的脫氧核糖的核苷酸。
申請(qǐng)日為1996年6月17日的美國專利申請(qǐng)流水號(hào)08/664,487，即現(xiàn)在的美國專利US5,731,181(Kmiec II)特別披露了用MDON在植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遺傳改變，并且披露了可用于在特定靶基因上實(shí)現(xiàn)遺傳改變的RNA-樣和DNA-樣核苷酸的類似物和衍生物的進(jìn)一步例子。
披露具有插入DNA片段的MDON的用途的科技文獻(xiàn)包括Yoon等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.932071-2076，和Cole-Straus，A.等，1996，科學(xué)2731386-1389。據(jù)以上科技文獻(xiàn)披露，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的輸送可以獲得在10個(gè)細(xì)胞中有大約有一個(gè)細(xì)胞發(fā)生突變的頻率。不過，這些科技文獻(xiàn)沒有披露MDON可用于在植物細(xì)胞中產(chǎn)生遺傳改變。
本說明書中使用的術(shù)語MDON應(yīng)當(dāng)被理解成與在其它地方所使用的術(shù)語“嵌合突變載體”、“嵌合修復(fù)載體”、和“嵌合質(zhì)體”同義。2.2 轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和由轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生植物在由Kmiec I和II所披露的用于將MDON輸入靶細(xì)胞的技術(shù)中，最適用于植物細(xì)胞的技術(shù)是原生質(zhì)體的電穿孔。業(yè)已報(bào)導(dǎo)了某些雙子葉植物種由原生質(zhì)體培養(yǎng)物再生可育植株的例子，例如，煙草(Nicotiana tobacum)，US5,231,019和Fromm，M.E.等，1988，自然312，791，和大豆品種(Glycine max)，授予Widholm，J.M.的WO92/17598。不過，盡管Prioli，L.M.等，生物技術(shù)7，589，Shillito，R.D.等1989，生物技術(shù)7，581報(bào)導(dǎo)了用非轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行了成功地分離，但由轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體培養(yǎng)物再生可育的單子葉植物被認(rèn)為是不可能用常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。通常，單子葉植物的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體產(chǎn)生不能再生的組織，或者如果該組織被再生的話，所得到的植物是不育的。
業(yè)已開發(fā)了將千堿基大小的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入具有完整或部分完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的其它技術(shù)。US4,945,050，US5,100,792和US5,204,253涉及通過將質(zhì)粒附著在微粒上，然后彈射推進(jìn)通過細(xì)胞壁將質(zhì)粒輸入完整植物細(xì)胞的方法，該細(xì)胞在下文中被稱為“粒子轟擊轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞。例如，US5,489,520披露了由粒子轟擊轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生可育玉米植株。用于將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入具有完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞懸浮液的其它技術(shù)，包括用碳化硅纖維刺穿細(xì)胞壁，參見授予Coffee R.和Dunwell，J.M.的US5,302,523。
在授予Krzyzek，Laursen和P.C.Anderson的US5,384,253中披露了對(duì)具有復(fù)雜的細(xì)胞壁的玉米細(xì)胞進(jìn)行電穿孔的技術(shù)。該技術(shù)使用內(nèi)果膠裂合酶(E.C.3.2.1.15)和內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶(E.C.4.2.2.3)的組合產(chǎn)生比真正的原生質(zhì)體能更容易再生成可育植物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。不過，該技術(shù)被報(bào)導(dǎo)僅適用于來自品系A(chǔ)188×品系B73的雜交的F1細(xì)胞系。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用MDON的新方法，該方法特別適用于所述植物細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是將MDON附著在顆粒上的技術(shù)，該顆粒能夠彈射通過細(xì)胞壁，將MDON釋放在細(xì)胞內(nèi)，以便在該植物細(xì)胞的靶基因上產(chǎn)生突變。能夠通過該技術(shù)導(dǎo)入的突變是能在合適條件下賦予突變的細(xì)胞生長優(yōu)勢(shì)的突變，和能導(dǎo)致通過肉眼檢查可檢測到的表型的突變。所述突變被稱為“可選擇的突變”。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過一種過程將除可選擇的突變之外的突變導(dǎo)入植物細(xì)胞的靶基因的方法，該方法包括將能在植物細(xì)胞中導(dǎo)入可選擇的突變的第一MDON和能導(dǎo)致不可選擇的突變的第二MDON的混合物導(dǎo)入的步驟。
本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的上述實(shí)施方案突變的細(xì)胞培養(yǎng)，以便獲得能產(chǎn)生種子的植物(上文稱之為“可育植物”)，并由該可育植物產(chǎn)生種子和其它植物。
本發(fā)明還包括可以通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的具有新的特征的可育植物。4.發(fā)明詳述4.1重組誘發(fā)性寡核堿基和混合雙鏈寡核苷酸本發(fā)明可以用具有在Kmiec I或Kmiec II中披露的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性的MDON實(shí)現(xiàn)，以上文獻(xiàn)被收作本文參考文獻(xiàn)。Kmiec I和/或Kmiec II的MDON含有兩個(gè)互補(bǔ)鏈，其中之一含有至少一段RNA-型核苷酸(“RNA片段”)，該片段與另一股鏈的DNA-型核苷酸堿基配對(duì)。
Kmiec II披露可以用含有嘌呤和嘧啶堿基的非核苷酸取代核苷酸。普通轉(zhuǎn)讓的申請(qǐng)日為1998年5月12日的美國專利申請(qǐng)流水號(hào)09/078,063和申請(qǐng)日為1998年5月12日的流水號(hào)09/078,064(以上專利分別被全文收作本文參考文獻(xiàn))披露了可用于本發(fā)明的其它分子。本文所說的“重組誘發(fā)性寡核堿基(recombinagenicoligonucleobase)”是指可用于本發(fā)明的分子。重組誘發(fā)性寡核堿基包括MDON，在Kmiec II中披露的含有非核苷酸的分子，以及在上述普通轉(zhuǎn)讓的專利申請(qǐng)中披露的分子。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，通過用氟、氯或溴官能團(tuán)取代2’-羥基或者在2’-O上增加一個(gè)取代基使得MDON的RNA-型核苷酸抗Rnase。合適的取代基包括由Kmiec II中披露的取代基，C1-6烷烴。其它取代基包括US5,334,711(Sproat)披露的取代基和由EP629387和EP679657(均為Martin申請(qǐng))披露的取代基，以上專利被收作本文參考文獻(xiàn)。在本文中，核糖核苷酸的2’-氟、氯或溴衍生物或具有用在Martin申請(qǐng)或Sproat中披露的取代基取代過的2’-OH的核糖核苷酸被稱為“2’-取代核糖核苷酸”。在本文中，術(shù)語“RNA-型核苷酸”是指通過未取代的磷酸二酯鍵或由Kmiec I或Kmiec II披露的任何非天然鍵連接在MDON的其它核苷酸上的2’-羥基或2’-取代核苷酸。在本文中，術(shù)語“脫氧核糖型核苷酸”是指具有2’-H的核苷酸，它可以通過未取代的磷酸二酯鍵或由Kmiec I或Kmiec II披露的任何非天然鍵連接在MDON的其它核苷酸上。
本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案包括僅僅通過未取代的磷酸二酯鍵連接的MDON。另一種實(shí)施方案包括由取代的磷酸二酯鍵、磷酸二酯鍵衍生物和Kmiec II披露的非磷基鍵實(shí)現(xiàn)的連接。另一種特定實(shí)施方案包括MDON，其中，每一個(gè)RNA-型核苷酸是2’-取代核苷酸。2’-取代核糖核苷酸的特定優(yōu)選實(shí)施方案是2’-氟，2’-甲氧基，2’-丙氧基，2’-烯丙氧基，2’-羥乙氧基，2’-甲氧乙氧基，2’-氟丙氧基，和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2’-取代核糖核苷酸的更優(yōu)選的實(shí)施方案是2’-氟，2’-甲氧基，2’-甲氧乙氧基，和2’-烯丙氧基取代的核苷酸。在一種實(shí)施方案中，所述MDON寡聚體是通過未取代的磷酸二酯鍵連接的。
盡管更容易合成僅具有單一類型2’-取代RNA-型核苷酸的MDON，本發(fā)明可以用具有兩種或兩種以上類型RNA-型核苷酸的MDON實(shí)現(xiàn)。通過在兩個(gè)RNA型三核苷酸之間導(dǎo)入脫氧核苷酸引起的間斷不會(huì)影響RNA片段的功能，因此，術(shù)語RNA片段包括這種“間斷RNA片段”。非間斷RNA片段是指連續(xù)的RNA片段。在另一種實(shí)施方案中，RNA片段可以含有交替的Rnase抗性和未取代的2’-OH核苷酸。本發(fā)明的MDON優(yōu)選具有少于100個(gè)的核苷酸，更優(yōu)選少于85個(gè)核苷酸，但超過50個(gè)核苷酸。所述第一和第二股鏈?zhǔn)俏稚?克里克堿基配對(duì)的。在一種實(shí)施方案中，MDON的鏈?zhǔn)峭ㄟ^一個(gè)諸如單鏈6、5或4核苷酸的接頭共價(jià)連接的，因此，所述第一和第二股鏈?zhǔn)蔷哂袉我?’和單一5’末端的單寡核苷酸鏈的片段?？梢酝ㄟ^添加“發(fā)卡帽”保護(hù)所述3’和5’末端，以便3’和5’末端核苷酸與相鄰核苷酸是沃森-克里克配對(duì)的?？梢栽谒龅谝缓偷诙涉湹倪h(yuǎn)離3’和5’末端的接合處添加第二個(gè)發(fā)卡帽，以便穩(wěn)定所述第一和第二股鏈之間的沃森-克里克配對(duì)。
所述第一和第二股鏈含有兩個(gè)與靶基因的兩個(gè)片段同源的區(qū)域，即，與所述靶基因有相同的序列。一個(gè)同源區(qū)含有RNA片段的核苷酸，并可以含有連接DNA片段的一個(gè)或幾個(gè)DNA-型核苷酸，還可以含有不在插入DNA片段內(nèi)的DNA-型核苷酸。以上兩個(gè)同源區(qū)由一個(gè)具有不同于所述靶基因的序列的區(qū)域(被稱為“異源區(qū)”)分離，并各自與該異源區(qū)相鄰。所述異源區(qū)可以包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)錯(cuò)配的核苷酸。所述錯(cuò)配的核苷酸可以是連續(xù)的或由一個(gè)或兩個(gè)與所述靶基因同源的核苷酸分離。另外，所述異源區(qū)還可以含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或五個(gè)或更少核苷酸的插入。另外，MDON的序列與所述靶基因的序列的差別在于從MDON上缺失了一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、或五個(gè)或更少的核苷酸。在這種情況下，所述異源區(qū)的長度和位置被視為所述缺失的長度，即使沒有MDON的核苷酸處在所述異源區(qū)之內(nèi)。與以上兩個(gè)同源區(qū)互補(bǔ)的靶基因的兩個(gè)片段之間的距離在希望一個(gè)或多個(gè)取代時(shí)與所述異源區(qū)的長度相同。當(dāng)所述異源區(qū)含有一個(gè)插入片段時(shí)，所述同源區(qū)在MDON中的間隔距離大于其互補(bǔ)的同源片段在所述基因中的間隔距離，而且，當(dāng)所述異源區(qū)編碼一個(gè)缺失時(shí)，可以采用一個(gè)轉(zhuǎn)變。
所述MDON的RNA片段各自是一個(gè)同源區(qū)的一部分，即在序列上與一段靶基因片段相同的區(qū)域，所述片段一起優(yōu)選含有至少13個(gè)RNA-型核苷酸，并優(yōu)選16-25個(gè)RNA-型核苷酸或更優(yōu)選18-22個(gè)RNA-型核苷酸或最優(yōu)選20個(gè)核苷酸。在一種實(shí)施方案中，所述同源區(qū)的RNA片段由一個(gè)間插DNA片段分離并與該片段相鄰，即“連接”。在一種實(shí)施方案中，所述異源區(qū)的每一個(gè)核苷酸是所述間插DNA片段的核苷酸。含有MDON的異源區(qū)的間插DNA片段被稱為“增變片段”。
普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請(qǐng)流水號(hào)09/078,063(申請(qǐng)日1998年5月12日)和流水號(hào)09/078,064(申請(qǐng)日1998年5月12日)披露了一種雙鏈重組誘發(fā)性寡核堿基，其中，一股鏈的序列與靶基因的序列相同，并且僅有互補(bǔ)鏈的序列含有一個(gè)異源區(qū)。這種結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)或幾個(gè)錯(cuò)配的堿基或“異源雙鏈”結(jié)構(gòu)。被用于本發(fā)明的異源雙鏈重組誘發(fā)性寡核堿基的異源區(qū)位于含有所述脫氧核苷酸的鏈上。在一種實(shí)施方案中，所述異源區(qū)位于含有5’末端核苷酸的鏈上。4.2由MDON導(dǎo)入的突變的位點(diǎn)和類型通常，用于植物細(xì)胞的MDON的設(shè)計(jì)必須在由Kmiec I和II中披露的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。在哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞中，由MDON導(dǎo)入的在一個(gè)位點(diǎn)上與靶基因不同的遺傳學(xué)改變是用一個(gè)互補(bǔ)于MDON在錯(cuò)配位置上的核苷酸的核苷酸取代靶基因的錯(cuò)配位置上的核苷酸。相反，在植物細(xì)胞中，可以在互補(bǔ)于含有所述DNA增變片段的鏈上的錯(cuò)配位置的5’末端的一個(gè)堿基的核苷酸處發(fā)生變化。所述靶基因的核苷酸被在所述錯(cuò)配位置上互補(bǔ)于DNA增變片段核苷酸的核苷酸取代。因此，突變的靶基因在兩個(gè)位置上與MDON不同。
通過MDON導(dǎo)入靶基因的突變位于靶基因片段之間，它與MDON同源區(qū)的核糖核苷酸部分同源，下文稱之為“RNA片段”。所導(dǎo)入的具體突變?nèi)Q于所述異源區(qū)的序列。可以通過使用分別含有一個(gè)插入或缺失的異源區(qū)將一個(gè)插入或缺失導(dǎo)入所述靶基因?？梢酝ㄟ^使用在MDON的異源區(qū)上具有一個(gè)錯(cuò)配的MDON獲得在靶基因上的一個(gè)取代。在最常見的實(shí)施方案中，所述錯(cuò)配能將靶基因現(xiàn)有的堿基轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)于MDON的錯(cuò)配堿基的堿基。所述靶基因上的取代位置可以在相當(dāng)于錯(cuò)配的位置上，或者更常見的是取代位于緊挨著所述錯(cuò)配位置的5’末端的靶鏈的位置上，即互補(bǔ)于MDON緊挨著MDON的錯(cuò)配堿基的3’末端的位置上。
錯(cuò)配導(dǎo)致的取代的每一個(gè)位點(diǎn)的相對(duì)頻率是特定基因和細(xì)胞類型的特征。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，當(dāng)取代的位置對(duì)實(shí)施本發(fā)明重要時(shí)，通常要指明確定在具體目標(biāo)基因上的取代位點(diǎn)的初步研究。4.3通過微載體和微纖維輸送MDON通過彈射穿透用金屬微載體(微球體)將大型DNA片段導(dǎo)入具有纖維素細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的用途是相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的(以下稱之為biolistic輸送)。US4,945,050，US5,100,792和US5,204,253涉及用于篩選彈射目的的微載體和裝置的一般技術(shù)。
用于將DNA片段附著在微載體上的條件不適用于MDON。本發(fā)明提供了用于將足夠數(shù)量的MDON附著到微載體的技術(shù)，以便可以采用biolistic輸送。在一種合適的技術(shù)中，按順序加入冰鎮(zhèn)微載體(60mg/ml)，MDON(60mg/ml)，2.5M氯化鈣和0.1M亞精胺；輕輕攪拌該混合物，例如，通過渦旋攪拌10分鐘，并在室溫下放置10分鐘，然后將微載體稀釋在5倍體積的乙醇中，離心，并重新懸浮在100％乙醇中。使用如下附著溶液的濃度可以獲得良好的結(jié)果8-10μg/μl微載體，14-17μg/ml MDON，1.1-1.4M氯化鈣和18-22mM亞精胺。在以下條件下獲得了最佳結(jié)果8μg/μl微載體，16.5μg/ml MDON，1.3M氯化鈣和21mM亞精胺。
還可以用微纖維穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜將MDON導(dǎo)入植物細(xì)胞，以便實(shí)施本發(fā)明。授予Coffee等的US5,302,532披露了用30×0.5μm和10×0.3μm碳化硅纖維實(shí)現(xiàn)Black Mexican Sweet的懸浮玉米培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化。任何能用于導(dǎo)入DNA、用微纖維轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)械技術(shù)均可用于輸送MDON進(jìn)行衍變。
進(jìn)行MDON的微纖維輸送的一種合適的技術(shù)如下文所述。將無菌微纖維(2μg)懸浮在含有大約10μg MDON的150μl植物培養(yǎng)基中。讓懸浮培養(yǎng)物沉淀，并將等體積的沉積細(xì)胞和無菌纖維/MDON懸浮液渦旋攪拌10分鐘，并鋪平板。根據(jù)具體的性狀馬上加入選擇培養(yǎng)基或者推遲大約120小時(shí)之后加入。
可用于將MDON輸入衍變細(xì)胞核基因的技術(shù)也可用于導(dǎo)致植物細(xì)胞的質(zhì)體基因的衍變。通過質(zhì)體的biolistic輸送，接著再進(jìn)行質(zhì)粒的不合規(guī)則的重組插入所進(jìn)行的質(zhì)體轉(zhuǎn)化為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。Svab，Z.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87，8526-8530。初步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)化的頻率低于細(xì)胞核轉(zhuǎn)化頻率的10倍到100倍。隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過使用顯性選擇性狀可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化頻率與細(xì)胞核轉(zhuǎn)化頻率相當(dāng)，所述選擇性狀如細(xì)菌氨基糖苷3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶基因，該基因能產(chǎn)生壯觀霉素抗性。Svab，Z.&Maliga，P.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90，913-917。
根據(jù)本發(fā)明，可以用上述相同技術(shù)將進(jìn)行質(zhì)體基因衍變的MDON導(dǎo)入質(zhì)體。當(dāng)希望導(dǎo)入的突變是一種選擇突變時(shí)，可以單獨(dú)使用MDON。當(dāng)所希望的突變是非選擇性的時(shí)，可將相關(guān)MDON與能導(dǎo)入一個(gè)選擇性質(zhì)體突變的MDON一起導(dǎo)入，例如，psbA基因上的能產(chǎn)生三嗪抗性的突變，或與能產(chǎn)生一種選擇性狀的線性或環(huán)狀質(zhì)粒組合。
上述技術(shù)可適用于除MDON之外的重組誘發(fā)性寡核堿基。4.4原生質(zhì)體電穿孔在另一種實(shí)施方案中，可以通過對(duì)源于植物部分的原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔將重組誘發(fā)性寡核堿基輸送到該植物細(xì)胞中。所述原生質(zhì)體是通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，通過對(duì)植物部分，特別是葉片進(jìn)行酶促處理而產(chǎn)生的。例如，參見Gallois等，1996，分子生物學(xué)方法55，89-107(Humana出版社，Totowa，NJ)。在電穿孔之前，所述原生質(zhì)體不需要在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
電穿孔的合適條件為在0.3ml的總體積中有3×105原生質(zhì)體，MDON的濃度為0.6-4μg/ml。4.5導(dǎo)入突變本發(fā)明可用于在植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遺傳改變，本文稱之為“衍變”。在一種實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，即不是原生質(zhì)體。
將MDON用于衍變植物細(xì)胞的方法可以通過同時(shí)導(dǎo)入一種性狀而獲益，該性狀有利于區(qū)分和分離(以下稱之為“選擇”)業(yè)已導(dǎo)入了MDON的細(xì)胞和未導(dǎo)入MDON的細(xì)胞。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述選擇是通過形成MDON和質(zhì)粒的混合物而實(shí)現(xiàn)的，該質(zhì)粒能導(dǎo)致產(chǎn)生一種選擇性狀的基因的瞬時(shí)表達(dá)，即允許在某種條件下存活的基因，例如，卡那霉素抗性基因。在上述條件下，消除缺乏所述選擇性狀的細(xì)胞可以消除未導(dǎo)入MDON的細(xì)胞。用瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)體導(dǎo)入選擇性狀可以通過反復(fù)使用一種標(biāo)準(zhǔn)化選擇程序?qū)⒍鄠€(gè)遺傳變化連續(xù)導(dǎo)入植物細(xì)胞。
在另一種實(shí)施方案中，可以用衍變導(dǎo)入一種選擇性狀。制備能在第一個(gè)靶基因上導(dǎo)致選擇突變的第一MDON和能在第二靶基因上導(dǎo)致非選擇突變的第二MDON的混合物。根據(jù)本發(fā)明，至少大約1％的具有所述選擇突變的細(xì)胞還在所述第二靶基因上含有一個(gè)突變，該突變是由第二MDON導(dǎo)入的。更常見的是，至少大約10％的具有所述選擇突變的細(xì)胞還在所述第二靶基因上具有一個(gè)突變。
本發(fā)明的該實(shí)施方案的一種用途是研究目標(biāo)基因的功能。提供能導(dǎo)致選擇突變的MDON和能導(dǎo)致會(huì)“剔除”目標(biāo)基因(例如插入一個(gè)終止密碼子或移碼突變)的突變的MDON的混合物。可以從具有所述選擇突變的群體中回收業(yè)已剔除了一個(gè)或幾個(gè)拷貝的目標(biāo)基因的細(xì)胞?？蓪⑺黾?xì)胞再生成植物，以便可以測定所述目標(biāo)基因的功能。
可以通過任何突變導(dǎo)致一種選擇性狀，該突變能導(dǎo)致一種表型改變，這種改變能在合適的選擇條件下產(chǎn)生選擇生長優(yōu)勢(shì)或便于觀察的表型改變，如生長在愈傷組織中的植物細(xì)胞顏色的改變。所述選擇性狀本身可以是一種需要的性狀，例如，除草劑抗性，或所述選擇性狀僅僅可用于促進(jìn)具有通過衍變導(dǎo)入的非選擇性狀的植物的分離。可以用能導(dǎo)致希望的突變的MDON和能導(dǎo)致選擇突變的MDON的混合物將需要的非選擇性狀導(dǎo)入細(xì)胞，然后在所述選擇條件下培養(yǎng)。根據(jù)該方案進(jìn)行的選擇，所具有的優(yōu)點(diǎn)是能確保每一個(gè)選擇的細(xì)胞不僅接收了所述MDON的混合物，而且接收了該混合物的細(xì)胞隨后容易通過MDON進(jìn)行衍變。
還可將能在合適條件下導(dǎo)致致死表型改變的突變(被稱為負(fù)選擇突變)用于本發(fā)明中。所述突變能導(dǎo)致負(fù)的選擇性狀，負(fù)的選擇性狀可以通過制備衍變細(xì)胞的復(fù)制平板進(jìn)行選擇，選擇一個(gè)復(fù)制件，并從非選擇的復(fù)制件中回收具有理想性狀的衍變細(xì)胞。4.6能夠衍變以便產(chǎn)生選擇性狀的特定基因在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，利用MDON將突變導(dǎo)入乙酰乳酸合酶(ALS)基因，該基因又被稱為乙酰羥基氨基酸合酶(AHAS)基因?；酋ｋ宄輨┖瓦溥蜻輨┦且吧虯LS酶的抑制劑。業(yè)已披露了能使植物抗磺酰脲和咪唑啉的作用的顯性突變。參見US5,013,659和US5,378,824(Bedbrook)和Rajasekaran K.等1996，分子育種2，307-319(Rajasekaran K.)。Bedbrook在表2中披露了被證實(shí)能使得酵母ALS酶抗磺酰脲除草劑的若干突變(以下稱之為“Bedbrook”突變)。Bedbrook指出，每一個(gè)Bedbrook突變?cè)诒粚?dǎo)入植物ALS基因之后能使得植物抗磺酰脲和咪唑啉除草劑。已經(jīng)了解到，在大多數(shù)植物中，編碼ALS的基因是重復(fù)的。可將突變導(dǎo)入任一個(gè)ALS基因的任何等位基因。
事實(shí)上，已證實(shí)3個(gè)Bedbrook突變能在植物中產(chǎn)生除草劑抗性，即取代Pro→Ala197，A1a→Asp205和Trp→Leu591。Rajasekaran報(bào)導(dǎo)突變Trp→Ser591能產(chǎn)生對(duì)磺酰脲和咪唑啉的抗性，而Ser→Asn660能導(dǎo)致對(duì)咪唑啉除草劑的抗性。用Bedbrook的序列編號(hào)將Rajasekaran的結(jié)果報(bào)導(dǎo)在本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，不同植物的ALS基因具有不同長度。為清楚起見，采用這樣一種編碼系統(tǒng)，其中，在每一種物種中，同源位點(diǎn)用相同的位點(diǎn)編號(hào)表示。因此，所標(biāo)明的突變位點(diǎn)是由它周圍的序列決定的。例如，Rajasekaran的突變Trp→Ser591位于棉花ALS基因的563號(hào)殘基，不過被標(biāo)明為Bedbrook的591號(hào)位點(diǎn)，因?yàn)橥蛔兊腡rp是由Bedbrook的表2中環(huán)繞Trp591的序列環(huán)繞的。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)位于位點(diǎn)660或在Bedbrook的表2中(該表被收作本文的參考文獻(xiàn))列出的一個(gè)位點(diǎn)上的天然存在的氨基酸的任何取代可被用于在植物的ALS基因中產(chǎn)生選擇突變。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，所述選擇突變可以是在編碼光合系統(tǒng)II的D1亞基的葉綠體基因psbA上的突變，參見Hirschberg，J.等1984，Z.Natursch39，412-420和Ohad，N.，＆Hirschberg，J.，植物細(xì)胞4，273-282。據(jù)Hirschberg，J.等報(bào)導(dǎo)，突變Ser→Gly264會(huì)導(dǎo)致對(duì)諸如2-氯-4-乙基氨基-6-異丙基氨基-s-三嗪(阿特拉津)的三嗪除草劑的抗性。PsbA基因上的能導(dǎo)致阿特拉津除草劑抗性的其它突變披露于Erickson J.M.等的文章中，1989，植物細(xì)胞1，361-371(以下稱之為“Erickson突變”)，該文獻(xiàn)被收作本文參考文獻(xiàn)。當(dāng)需要將第二種新的性狀導(dǎo)入葉綠體時(shí)，優(yōu)選使用由Erickson突變引起的選擇性狀。
科技文獻(xiàn)中包含能產(chǎn)生選擇性狀的其它突變的進(jìn)一步報(bào)導(dǎo)。Ghislain M.等1995，植物雜志8，733-743披露了發(fā)生在Nicotianasylvestris二氫二吡啶甲酸合酶(DHDPS，EC4.2.1.52)基因上的Asn→Ile104突變，該突變能產(chǎn)生對(duì)S-(2-氨基乙基)L-半胱氨酸的抗性。Mourad，G.，&King，J.1995，植物生理學(xué)109，43-52披露了發(fā)生在擬南芥(Arabidopsis thaliana)的蘇氨酸脫水酶上的突變，該突變能導(dǎo)致對(duì)L-O-甲基蘇氨酸的抗性。Nelson，J.A.E.等1994，分子細(xì)胞生物學(xué)14，4011-4019披露了用Pro取代S14/rp59核糖體蛋白的C-末端Leu，可導(dǎo)致對(duì)翻譯抑制劑crytopluerine和吐根堿的抗性。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，可將上述每一種突變用于產(chǎn)生一種選擇性狀。Ghislain，Mourad和Nelson中的每一個(gè)被收作本文參考文獻(xiàn)。4.7能夠突變以便產(chǎn)生需要的非選擇性狀的基因例1雄性不育性用包括玉米(Zea maize)、番茄和大部分其它蔬菜在內(nèi)的雜交種子，常規(guī)種植某些商業(yè)種植的植物。雜交種子的生產(chǎn)需要用僅來自另一個(gè)純合系的花粉對(duì)一個(gè)純合系的植株進(jìn)行授粉，即不存在自花授粉。從純合的親本植株上清除產(chǎn)生花粉的器官的工作，是一項(xiàng)繁重和花費(fèi)較大的過程。因此，能誘導(dǎo)雄性不育性即抑制花粉產(chǎn)生或功能的突變，可以避免對(duì)所述過程的需要。
業(yè)已鑒定了花粉成熟或功能所必需的，但對(duì)植物的其它過程不重要的若干基因。查耳酮合酶(chs)是類黃酮合成的關(guān)鍵酶，類黃酮是存在于花和花粉中的色素。在矮牽牛中通過導(dǎo)入chs反義表達(dá)基因抑制chs，會(huì)導(dǎo)致植物的雄性不育性。Van der Meer，I.M.等，1992，植物細(xì)胞4，253-262。在大部分植物中存在一個(gè)chs基因家族。例如，參見Koes，R.E.等，1989，植物分子生物學(xué)12，213-226。類似地，通過插入轉(zhuǎn)座因子破壞玉米中的查耳酮合酶基因會(huì)導(dǎo)致雄性不育性。Coe，E.H.，遺傳學(xué)雜志72，318-320。Franken，P.等，1991，EMBO雜志10，2605-2612披露了玉米查耳酮合酶和重復(fù)基因whp的結(jié)構(gòu)。通常，在植物中，多基因家族的每一個(gè)成員僅在有限范圍的組織中表達(dá)。因此，本發(fā)明的該實(shí)施方案要求在具有多拷貝查耳酮合酶基因的物種中，鑒定在花藥中表達(dá)的特定chs基因，并且通過導(dǎo)入移碼和一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞該基因，或者破壞其啟動(dòng)子。
在番茄中業(yè)已證實(shí)產(chǎn)生花粉所必需的第二個(gè)基因，被稱為Lat52。Muschietti J.等，1994，植物雜志6，321-338。Lat52是與胰蛋白酶抑制劑相關(guān)的分泌型糖蛋白。業(yè)已在玉米(被稱為Zm13，Hanson D.D.等，1989，植物細(xì)胞1，173-179；Twell D.等，1989，分子基因遺傳學(xué)217，240-245)，稻(被稱為Psl，Zou J.等，1994，美國植物學(xué)雜志81，552-561)和橄欖(被稱為Ole eI，Villalba，M.等，1993，歐洲生物化學(xué)雜志276，863-869)中鑒定了Lat52的同系物。因此，本發(fā)明的該實(shí)施方案提供了一種通過導(dǎo)入一個(gè)移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞Lat52/Zm13基因或其同系物或通過破壞其啟動(dòng)子獲得雄性不育性的方法。
業(yè)已鑒定了對(duì)花粉生產(chǎn)必需的第三個(gè)基因是編碼苯丙氨酸銨鹽裂合酶(PAL，EC4.3.1.5)的基因。PEL是產(chǎn)生苯基類丙酮和類黃酮的關(guān)鍵酶。因?yàn)楸交惐悄举|(zhì)素的前體，它可能是產(chǎn)生抗病性的重要成分，在所述優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定了僅在花藥中表達(dá)的PAL異構(gòu)酶，并將其破壞，以便獲得雄性不育性。
例2改變塊莖的糖代謝一旦收獲之后，馬鈴薯塊莖在儲(chǔ)存期間會(huì)遇到病害、縮水和發(fā)芽。為了避免以上損失，儲(chǔ)存溫度被降低到35-40°F。不過，在低溫下，塊莖中的淀粉會(huì)轉(zhuǎn)化成糖，這一過程被稱為“冷甜化”，它會(huì)降低塊莖的商業(yè)和營養(yǎng)價(jià)值。對(duì)冷甜化過程來說有兩種酶是重要的酸性轉(zhuǎn)化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。Zrenner，R.等，1996，植物198，246-252和Spychalla，J.P.等，1994，植物生理學(xué)雜志144，444-453。馬鈴薯酸性轉(zhuǎn)化酶的序列披露于EMBL數(shù)據(jù)保藏號(hào)X70368(序列1)中，而馬鈴薯UDP葡萄糖焦磷酸酶的序列由Katsube，T.等披露，1991，生物化學(xué)30，8546-8551，因此，本發(fā)明的該實(shí)施方案提供了通過導(dǎo)入移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞酸性轉(zhuǎn)化酶或UDP葡萄糖焦磷酸酶基因或通過破壞其啟動(dòng)子防止冷甜化的方法。
例3減輕由于PPO導(dǎo)致的收獲后褐變多酚氧化酶(PPO)是高等植物中酶促褐變的主要原因。PPO能催化單酚轉(zhuǎn)化成鄰二酚和鄰二羥基酚再轉(zhuǎn)化成鄰醌。所述醌產(chǎn)物隨后聚合并與細(xì)胞蛋白中的氨基酸基團(tuán)反應(yīng)，由此導(dǎo)致變色。由PPO導(dǎo)致的褐變問題通常通過向食品中添加亞硫酸鹽來解決，而亞硫酸鹽業(yè)已被證實(shí)與某些可能的健康危害和消費(fèi)者反感相關(guān)。PPO通常起著保護(hù)植物不受病原體或昆蟲類害蟲危害的作用，因此，對(duì)于植物的生活力來說并不重要。因此，本發(fā)明的該實(shí)施方案提供了通過導(dǎo)入移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞PPO基因或通過破壞其啟動(dòng)子，在蘋果、葡萄、鱷梨、梨和香蕉中預(yù)防酶促褐變的方法。
植物基因組中的PPO基因的數(shù)量是可變的；在番茄和馬鈴薯中，PPO形成一個(gè)多基因家族。Newman，S.M.等，1993，植物分子生物學(xué)21，1035-1051，Hunt M.D.等1993，植物分子生物學(xué)21，59-68；Thygesen，P.W.等，1995，植物生理學(xué)109，525-531。葡萄僅含有一個(gè)PPO基因。Dry，I.B.等，1994，植物分子生物學(xué)，26，495-502。當(dāng)目標(biāo)植物種含有多拷貝的PPO基因時(shí)，重要的是能夠破壞在商業(yè)制品中正常表達(dá)的PPO基因。例如，在可收獲大小的馬鈴薯中僅有一個(gè)PPO基因，該基因被稱為POT32，其序列的GENBANK保藏號(hào)為U22921(序列2)中，該序列被收作本文參考文獻(xiàn)。業(yè)已對(duì)其它馬鈴薯PPO異構(gòu)酶進(jìn)行了測序，并對(duì)其序列進(jìn)行了保藏，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出能專門使POT32失活的MDON。
例4減少飼料作物和木漿中的木質(zhì)素木質(zhì)素是一種復(fù)雜的異源芳族聚合物，它可以使高等植物防水并加強(qiáng)其細(xì)胞壁。木質(zhì)素是由苯基類丙酮單木質(zhì)素的自由基隨機(jī)聚合而成。由于從木漿中清除木質(zhì)素會(huì)涉及到資金和環(huán)境代價(jià)，木質(zhì)素對(duì)造紙業(yè)造成了嚴(yán)重問題。類似地，飼料作物的木質(zhì)素含量限制了其對(duì)反芻動(dòng)物的消化能力。事實(shí)上，業(yè)已在高粱(Porter，KS等，1978，作物科學(xué)18，205-218)和玉米(Lechtenberg，V.L.等1972，Agron，J.64，657-660)中鑒定了具有降低的木質(zhì)素含量的天然發(fā)生的突變，被稱為“brown mid-rib”，并嘗試用它飼養(yǎng)家畜。
玉米中的brown mid-rib突變涉及O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。Vignol，F(xiàn).，1995，植物細(xì)胞7，407-416。業(yè)已克隆了多種植物的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Burgos，R.C.等，1991，植物分子生物學(xué)17，1203-1215(白楊)；Gowri，G.等，1991，植物生理學(xué)97，7-14(苜蓿)和Jaeck，E.等，1992，分子植物微生物相互作用4，294-300(煙草)(序列3和序列4)，因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是破壞O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，以便在玉米或高粱的任何栽培種中以及在其它飼料作物種中和在用于生產(chǎn)木漿的植物中再現(xiàn)brown mid-rib表型。
參與木質(zhì)素生產(chǎn)的第二個(gè)基因是肉桂醇脫氫酶(CAD)基因，該基因業(yè)已克隆到煙草中。Knight，M。E.，1992，植物分子生物學(xué)19，793-801(序列5和序列6)。轉(zhuǎn)基因煙草植物使得CAD反義轉(zhuǎn)錄物具有較低的CAD含量，還能產(chǎn)生一種更容易提取的木質(zhì)素，明顯由于丁香基與鄰甲氧苯基單體比例的提高，并由于醛單體相對(duì)醇?xì)埢狭康脑黾?。Halpin，C.等，1994，植物雜志6，339-350，因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是通過導(dǎo)入移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞諸如苜蓿、玉米、高粱和大豆的飼料作物和諸如短葉松(Pinusechinata)、長葉松(Pinus palustris)、濕地松(Pinus elliottii)、火炬松(Pinus taeda)、北美鵝掌楸(Liriodendron tulipifera)和楊(Populus sp.)的紙漿樹木的CAD基因，或破壞其啟動(dòng)子。
例5降低油用種子中的不飽和和聚不飽和酯類源于諸如油菜(canola)、花生、向日葵和大豆的油用種子的植物油中，諸如油酸的不飽和脂肪酸和諸如亞油酸和亞麻酸的聚不飽和脂肪酸的存在，在長期儲(chǔ)存和高溫下會(huì)導(dǎo)致這種油氧化。因此，通常對(duì)植物油進(jìn)行氫化。不過，化學(xué)氫化作用會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)氫，這會(huì)產(chǎn)生非天然存在的立體異構(gòu)體，這種異構(gòu)體被認(rèn)為是對(duì)健康有害的。
脂肪酸合成是以在乙酰載體蛋白(ACP)上合成飽和脂肪酸開始的，然后通過脫氫酶的作用除去氫對(duì)。因此，需要抑制油用種子中這種脫氫酶的活性。
油酸合成中的第一種酶是硬脂酰-ACP脫氫酶(EC1.14.99.6)。業(yè)已克隆了來自紅花和蓖麻籽的硬脂酰-ACP脫氫酶，并進(jìn)行了測序。Thompson，G.A.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2578-2582(序列7)；Shankl in，J.&Somerville，C.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2510-2514(序列8)；Knutzon，D.S.等，1991，植物生理學(xué)96，344-345。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是通過導(dǎo)入一個(gè)移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞諸如大豆、紅花、向日葵、大豆、玉米和油菜的油用種子作物的硬脂酰-ACP脫氫酶基因或破壞其啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明可以破壞的第二種酶是ω-3脂肪酸脫氫酶(ω-3FAD)，這種酶能將亞油酸(一種二烯)轉(zhuǎn)化成亞麻酸(一種三烯)。在擬南芥中存在兩種ω-3 FAD異構(gòu)酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)計(jì)在大多數(shù)其它植物中也存在這兩種異構(gòu)酶。一種異構(gòu)酶是對(duì)質(zhì)體專一的，并且是合成種子的儲(chǔ)存油類的相關(guān)異構(gòu)酶。另一種是微粒體專一的。Iba.，K.等，1993，生物化學(xué)雜志268，24099-24105(序列9)披露了擬南芥質(zhì)體ω-3 FAD的克隆。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，通過導(dǎo)入一個(gè)移碼、一個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞諸如大豆、紅花、向日葵、大豆、玉米和油菜的油料種子的質(zhì)體ω-3 FAD基因，或破壞其啟動(dòng)子。
例6滅活S等位基因，以便得到近交系某些植物種業(yè)已形成了一種防止自花授粉的機(jī)制。在這些種中，例如小麥和稻，存在一個(gè)被稱為S的基因座，該基因座具有多個(gè)等位基因。能表達(dá)S等位基因的植物不能用表達(dá)相同的S等位基因的花粉授粉。Lee，H-K.，1994，自然367，560-563；Murfett，J.等，1994，自然367，563。S基因座的產(chǎn)物是RNase。McClure，B.A.等，1989，自然342，955-957。對(duì)所述植物來說S基因座的產(chǎn)物并不重要。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是通過導(dǎo)入一個(gè)移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞S基因座的基因或破壞其啟動(dòng)子，使得所述植物能夠自交。
例7乙烯不敏感性乙烯是一種氣體植物激素，它參與植物生長和發(fā)育。乙烯作用的一個(gè)不希望的方面是使得果實(shí)、蔬菜過分成熟并使得花萎蔫，導(dǎo)致腐爛和損失。業(yè)已克隆了擬南芥的乙烯受體，并被命名為ETR-1。Chang，C.等，1993，科學(xué)262，539-544(序列10)，一種突變型Cys→Tyr65會(huì)導(dǎo)致對(duì)乙烯的顯性不敏感性。表達(dá)所述擬南芥突變ETR-1的轉(zhuǎn)基因番茄植物也表現(xiàn)出對(duì)乙烯的不敏感性，這表明在大多數(shù)植物種中，Cys→Tyr65突變是乙烯作用的顯性抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案的一個(gè)方面，將Cys→Tyr65突變插入ETR-1基因，以便延長突變的果實(shí)類蔬菜或花的壽命。
在該實(shí)施方案的另一方面，可以通過破壞編碼乙烯合成的酶的一個(gè)基因?qū)麑?shí)或鮮花進(jìn)行防腐即1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACC合酶)和ACC氧化酶。對(duì)本發(fā)明的該實(shí)施方案來說，可以完全消除乙烯合成量，因此，成熟過程是通過外源乙烯產(chǎn)生的，或者保留一定的乙烯產(chǎn)量，以便果實(shí)能自動(dòng)成熟，但具有較長的儲(chǔ)存壽命。因此，預(yù)計(jì)破壞ACC合酶或ACC氧化酶基因的一個(gè)等位基因能夠?qū)е乱蚁┖铣伤降挠杏玫慕档?。另外，本發(fā)明提供了破壞一個(gè)等位基因同時(shí)導(dǎo)入一種突變，這樣會(huì)導(dǎo)致未被破壞的等位基因活性的部分喪失。
Abel，S.等1995，生物化學(xué)雜志270，19093-19099(序列12)和Gomez-Lim，M.A.等1993，基因134，217-221(序列11)分別披露了擬南芥ACC合酶和ACC氧化酶基因的序列，以上文獻(xiàn)被收作本文參考文獻(xiàn)。
例8卡那霉素抗性的恢復(fù)植物重組DNA技術(shù)能夠?qū)⒃从谝环N植物的基因和細(xì)菌基因?qū)氲诙N植物。例如，Kinney，A.J.1996，自然生物技術(shù)14，946，披露了將月桂ACP-硫酯酶基因?qū)胗筒朔N子以便獲得富含月桂酸的植物油。所述轉(zhuǎn)基因植物通常是使用一個(gè)卡那霉素抗性的抗生素抗性基因構(gòu)建的，該抗性基因被作為選擇性狀同時(shí)插入所述轉(zhuǎn)基因植物。所得到的轉(zhuǎn)基因植物繼續(xù)表達(dá)所述抗生素抗性基因，這樣會(huì)產(chǎn)生大量的抗性產(chǎn)物，并且該基因會(huì)進(jìn)入食物和/或環(huán)境中，這意味著存在著環(huán)境或健康危害。本發(fā)明的一種實(shí)施方案通過導(dǎo)入一個(gè)移碼、一個(gè)或幾個(gè)框內(nèi)終止密碼子破壞卡那霉素基因或破壞其啟動(dòng)子避免所述危險(xiǎn)。
例9改變儲(chǔ)存蛋白氨基酸含量種子和塊莖包括一類主要儲(chǔ)存蛋白，例如馬鈴薯中的patatins和玉米中的玉米醇溶蛋白。所述儲(chǔ)存蛋白的氨基酸組成通常不適合人類和動(dòng)物的需要，這取決于作物的種類，例如，玉米缺少賴氨酸和甲硫氨酸，而馬鈴薯缺少甲硫氨酸。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是使糧食作物的儲(chǔ)存蛋白發(fā)生突變，以便增加低含量氨基酸的量。Patatins是由一個(gè)多基因家族編碼的，該基因家族由Mignery，G.A.等，1988，基因62，27-44鑒定，而玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)由Marks，M.D.等，1985，生物化學(xué)雜志，260，16451459披露，以上文獻(xiàn)被收作本文參考文獻(xiàn)。另外，可以使甲硫氨酸或賴氨酸特異性tRNA的反密碼子突變成更常見的氨基酸。
例10利用MDON確定一個(gè)基因的功能克隆和測定組織特異性cDNA的序列的現(xiàn)有技術(shù)使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能方便地獲得許多基因的序列。用于確定這些基因功能的技術(shù)較少。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)MDON，以便將移碼或終止密碼子導(dǎo)入編碼未知功能的cDNA的基因。這樣可以對(duì)所述基因進(jìn)行特異性破壞?？梢苑N植具有所述特異性“剔除”的植物，并可以觀察剔除的作用，以便研究所述未知基因的功能。
4.8本發(fā)明的可育植物本發(fā)明包括具有分離的選擇點(diǎn)突變的可育植物，所述分離的選擇突變不是罕見的多態(tài)性，即在大約10,000個(gè)體的群體中不會(huì)出現(xiàn)。在本文中，點(diǎn)突變是指取代不超過6個(gè)連續(xù)核苷酸的突變，優(yōu)選不超過3個(gè)核苷酸，更優(yōu)選1個(gè)核苷酸，或者缺失或插入1-5個(gè)核苷酸，優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸。在本文中，分離的突變是指在遺傳學(xué)上不與任何其它突變密切連鎖的突變，其中，可以理解的是，大于100Kb，優(yōu)選大于40Kb和更優(yōu)選大于23Kb的突變不是密切連鎖的。
BIOLISTIC工作實(shí)施例在下面的工作實(shí)施例中，培養(yǎng)基和方法披露于Gelvin，S.B.等的著述中，1991，植物分子生物學(xué)手冊(cè)(Kluwer學(xué)術(shù)出版社)。按照以下方法用MDON涂敷金顆粒。首先制備用于涂敷的微粒，然后馬上用嵌合質(zhì)粒涂敷。為了制備所述微粒，將60mg金顆粒懸浮在1ml 100％乙醇中(參見注釋4)。對(duì)該懸浮液進(jìn)行三次超聲處理，每次30秒，以便分散金顆粒。以12,000×g的速度離心30秒，棄上清液。加入1ml 100％乙醇，渦旋攪拌15秒，以12,000×g的速度離心5分鐘，然后棄上清液。將洗滌過的金顆粒(直徑1.0μm，60mg/ml)懸浮在水中的25μ1懸浮液進(jìn)行緩慢渦旋攪拌，順序加入40μl MDON(50mg/ml)，75μl的2.5M氯化鈣，75μl的0.1M亞精胺。對(duì)所有溶液進(jìn)行冰鎮(zhèn)。對(duì)完成的混合物再進(jìn)行渦旋攪拌10分鐘，并讓金顆粒在室溫下再沉淀10分鐘。在100％乙醇中洗滌沉淀，并重新懸浮在50μl的無水乙醇中。用Biorad Biolistic槍進(jìn)行biolistic輸送，采用以下參數(shù)箱內(nèi)壓力1100psi，破裂盤×2在900psi時(shí)破裂，顆粒懸浮體積5μl。
NT-1(煙草)，雙子葉細(xì)胞懸浮液在28℃下，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上讓含有500萬個(gè)細(xì)胞的直徑大約為5cm的NT-1的細(xì)胞集落生長3天。用ALS-1或ALS-2涂敷金顆粒，并按上述方法轟擊。再培養(yǎng)所述細(xì)胞2.5天，懸浮，并轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了15-50ppb chlorosulfuron(GLEAMTM)的固體培養(yǎng)基上。在7-14天之后出現(xiàn)抗性集落。
所使用的MDON的序列如下(在與靶基因不同源的核苷酸下面劃線并加粗。小寫字母表示2’-O甲基核糖核苷酸)ALS-1TGCGCG-guccaguucaCGTTGcauccaacuaTT TT T(序列13)TCGCGC CAGGTCAAGTGCAACGTAGGATGATT3′5′ALS-2TGCGCG-guccaguucaCGATGcauccaacuaTT TT T(序列14)TCGCGC CAGGTCAAGTGCTACGTAGGATGATT3′5′ALS-1和ALS-2與ALS基因在Pro197(CCA)密碼子的第二個(gè)核苷酸上具有一個(gè)堿基的錯(cuò)配ALS-1是CAA，而ALS-2是CTA。在對(duì)ALS-1和ALS-2衍變的抗性細(xì)胞系的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序之后，分別發(fā)現(xiàn)所述靶密碼子上的突變?yōu)門hr(ACA)和Ser(TCA)。觀察到的突變相對(duì)根據(jù)MDON在哺乳動(dòng)物細(xì)胞編碼鏈上的作用預(yù)測的位點(diǎn)向5’方向移動(dòng)一個(gè)核苷酸，并在非編碼鏈上相對(duì)預(yù)期位點(diǎn)向3’方向移動(dòng)一個(gè)核苷酸?？偣茶b定了具有這種突變的3個(gè)ALS-1和5個(gè)ALS-2衍變體。未能從ALS-l DNA處理過的細(xì)胞獲得愈傷組織。
為了篩選chlorosulfuron抗性細(xì)胞，在轟擊之后2天將細(xì)胞從每一個(gè)轟擊板上轉(zhuǎn)移到含有5ml液體CSM2的15ml中。將試管顛倒若干次，以便分散細(xì)胞塊。然后將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有15ppbchlorosulfuron(Dupont，Wilmington，DE)的固化CSM培養(yǎng)基上。大約3-5周之后，選擇活躍生長的細(xì)胞(突出的、有淺顏色的集落)，并轉(zhuǎn)移到含有50ppb chlorosulfuron的固化CSM上。3-4周之后，選擇活躍生長的細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到含有200ppb chlorosulfuron的固化CSM上。然后分析在該處理中存活的細(xì)胞。
培養(yǎng)基1.NT-1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基(CSM)Murashige和Skoog鹽(GibcoBRL，Gland島，NY)，500mg/l MES，1mg/l硫胺素，100mg/l肌醇，180mg/l磷酸二氫鉀，2.21mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，30g/l蔗糖。用1M氫氧化鉀或鹽酸將pH調(diào)節(jié)到5.7，并高壓滅菌。對(duì)于固化培養(yǎng)基來說，在高壓滅菌之前加入8g/l瓊脂-瓊脂(Sigma，St.Louis，MO)。
2.鋪開培養(yǎng)基(POM)80％(v/v)CSM，0.3M甘露醇，20％(v/v)源于在原生質(zhì)體分離之前NT-1細(xì)胞懸浮液的初級(jí)離心的上清液。
煙草葉片，一種雙子葉植物通過獲得了bin19-衍生質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404對(duì)煙草品種Samsun葉片進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有nptII表達(dá)框，該表達(dá)框含有兩個(gè)基因一個(gè)基因編碼卡那霉素抗性，和一個(gè)編碼綠色熒光蛋白的基因的兩種突變之一(GFP，Chui，W.1996，當(dāng)代生物學(xué)6，325-330)。任何一種突變型GFP基因都不能產(chǎn)生GFP產(chǎn)物。在第六個(gè)密碼子上含有G→T取代的突變會(huì)產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子或在同一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生一個(gè)核苷酸的缺失，分別稱之為G-終止子和G-Δ。在選擇性MS104培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后，回收葉片，通過Northern印跡證實(shí)GFP基因的存在。GFP的頭8個(gè)密碼子的序列為GFP ATG GTC AGC AAG GGC GAG GAG CTG (序列15)G-終止 -------------------T----------- (序列16)G-Δ --------------------AGG AGC TGT (序列17)所使用的MDON的序列如下(在與G-終止子不同源的核苷酸下面劃線并加粗。小寫字母表示2’-O甲基核糖核苷酸)。GFP-1TGCGCG-cacucguuccCGCTCcucgacaaguTT TT T (序列18)TCGCGC GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAT3′5 ′GFP-2TGCGCG-acucguucccGAGCCucgacaagugTT TT T(序列19)TCGCGC TGAGCAAGGGCTCGGAGCTGTTCACT3′5′在MS104選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)G-終止子和G-Δ轉(zhuǎn)基因植物的葉片，按上述方法通過兩次連續(xù)的輸送將G-1或G-1 biolistically導(dǎo)入。在導(dǎo)入MDON之后大約10天，在G-終止子和G-Δ葉片的G-1和G-2處理培養(yǎng)物中觀察到具有GFP-樣熒光的愈傷組織。用解剖刀分解較大的、生長較快的愈傷組織塊，以便獲得富含綠色熒光細(xì)胞的愈傷組織。在為期大約30天的觀察階段，所述熒光表型保持穩(wěn)定。在G-1處理的G-終止子培養(yǎng)物中綠色熒光細(xì)胞的出現(xiàn)表明G-1不會(huì)導(dǎo)致除了錯(cuò)配核苷酸的5’末端的一個(gè)堿基之外的突變。
用IMT-2 Olympus顯微鏡通過標(biāo)準(zhǔn)FITC過濾裝置觀察綠色熒光。
電穿孔工作實(shí)施例在煙草葉肉原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化GFP植物材料1.獲得了GFP的缺失突變型的煙草植物轉(zhuǎn)化體(Δ6)。
2.從5-6周齡體外生長小植株上獲得葉片原生質(zhì)體分離1.基本上按照Gallois等的方法1996，用質(zhì)粒DNA或總基因組DNA進(jìn)行煙草葉片原生質(zhì)體的電穿孔。分子生物學(xué)方法，55卷植物細(xì)胞電穿孔和電融合方法，編輯J.A.Nickolosf，Humana出版公司，Totowa，NJ.89-107頁。
2.酶溶液1.2％纖維素酶R-10“Onozuka”(Karlan，Santa Rosa，CA)，0.8％macerozyme R-10(Karlan，Santa Rosa，CA)，90g/l甘露醇，10mM MES，過濾除菌，以10ml等分試樣形式在-20℃下保存。
3.切割距離中脈1-2mm的葉片。然后使遠(yuǎn)軸側(cè)朝下，讓其與10ml酶溶液在100×20mm的培養(yǎng)皿中接觸。在每一個(gè)培養(yǎng)皿中總共放入1g葉片。
4.在25℃下在黑暗中培養(yǎng)所述培養(yǎng)皿16小時(shí)。
5.對(duì)消化過的葉片材料進(jìn)行移液，并通過100μm的尼龍紗布(Small Parts公司，邁阿密湖，F(xiàn)L)過濾。然后將濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，并以1000rpm的速度離心10分鐘。該方案的所有離心都是在這種條件下進(jìn)行的。
6.原生質(zhì)體集中在上部的一條帶中。然后將該原生質(zhì)體帶轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入10ml洗滌溶液(0.4M蔗糖和80mM氯化鉀)。對(duì)該原生質(zhì)體進(jìn)行溫和地再懸浮，然后離心。
7.重復(fù)步驟6兩次。
8.在經(jīng)過最后一次洗滌之后通過將少量的樣品分配到一個(gè)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上測定原生質(zhì)體的密度。將所述原生質(zhì)體以1×106原生質(zhì)體/ml的密度重新懸浮在電穿孔緩沖液(80mM氯化鉀，4mM氯化鈣，2mM磷酸鉀，pH7.2，8％甘露醇)中，高壓滅菌。在8℃下培養(yǎng)該原生質(zhì)體2小時(shí)。
9.兩小時(shí)之后，將0.3ml(1×105原生質(zhì)體)轉(zhuǎn)移到每一個(gè)0.4cm的樣品池中，然后放置在冰上。將GFP-2(0.6-4μg/ml)加入每一個(gè)樣品池中，不進(jìn)行電穿孔的對(duì)照除外。對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔(250V，電容250μF，時(shí)間常數(shù)10-14ms)。
10.讓原生質(zhì)體在冰上恢復(fù)10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(100×20mm)。35分鐘之后，向每一個(gè)培養(yǎng)皿中加入10ml POM，參見上文。然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到黑暗中，在25℃下培養(yǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到光照條件下。
11.然后按照上述Gallois的方法維持所述原生質(zhì)體培養(yǎng)物。
熒光顯微鏡觀察1.在紫外線下，我們?cè)?×105個(gè)原生質(zhì)體中觀察到8個(gè)GFP轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。
序列表<110>1.Arntzen，Charles2.Kipp，Peter B.
3.Kumar，Ramesh4.May，Gregory D.
<120>用混合雙鏈寡核苷酸在植物中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)遺傳改變的用途<130>7991-023-999<150>60/054，386<151>1997-08-05<160>19<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>2063<212>DNA<213>馬鈴薯<220>
<221>CDS<222>(3)...(1907)<400>1agtaccattc cagttatgac ccggaaaact ccgcctccca ttacacattc ctcccggatc 60aacccgattc cggccaccgg aagtccctta aaatcatctc cggcattttc ctctcctctt 120tccttttgct ttctgtagcc ttctttccga tcctcaacaa ccagtcaccg gacttgcaga 180gtaactcccg ttcgccgccg ccgtcaagag gtgtttctca gggagtctcc gataagactt 240ttcgagatgt cgtcaatgct agtcacattt cttatgcgtg gtccaatgct atgcttagct 300ggcaaagaac tgcttaccat tttcaacctc aaaaaaattg gatgaacgat cctaatggtc 360cattgtacca caagggatgg tatcatcttt tttatcaata caatccagat tcagctattt 420ggggaaatat cacatggggc catgccgtat ccaaggactt gatccactgg ctctacttgc 480cttttgccat ggttcctgat caatggtacg atattaacgg tgtctggact gggtccgcct 540ccatcctacc cgatggtcag atcatgatgc tttataccgg tgtctctgat gattatgtac 600aagtgcaaaa tcttgcgtac cccaccaact tatctgatcc tctccttcta gactgggtca 660agtacaaagg caacccggtt ctggttcctc cacccggcat tggtatcaag gactttagag 720acccgaccac tgcttggacc ggaccccaaa atgggcaatg gcttttaaca atcgggtcta 780agattggtaa aacgggtatt gcacttgttt atgaaacttc caacttcaca agctttaagc 840tattggatga agtgctgcat gcggttccgg gtacgggtat gtgggagtgt gtggactttt 900acccggtatc gactgaaaaa acaaacgggt tggacacatc atataacggc ccgggtgtaa 960agcatgtgtt aaaagcaagt ttagatgaca ataagcaaga tcactatgct attgggacgt 1020atgacttgac aaagaacaaa tggacacccg ataacccgga attggattgt ggaattgggt 1080tgaagctgga ttatgggaaa tattatgcat caaagacatt ttatgacccg aagaaacaac 1140gaagagtact gtggggatgg attggggaaa ctgatagtga atctgctgac ctgcagaagg 1200gatgggcatc tgtacagagt attccaagga cagtgcttta cgacaagaag acagggacac 1260atctacttca gtggccagtt gaagaaattg aaagcttaag agtgggtgat cctattgtta 1320agcaagtcaa tcttcaacca ggttcaattg agctactcca tgttgactca gctgcagagt 1380tggatataga agcctcattt gaagtggaca aagtcgcgct ccagggaata attgaagcag 1440atcatgtagg tttcagctgc tctactagtg gaggtgctgc tagcagaggc attttgggac 1500catttggtgt cgttgtaatt gctgatcaaa agctatctga gctaacgcca gtttacttct 1560acatttctaa aggagctgat ggtcgagctg agactcactt ctgtgctgat caaactagat 1620cctcagaggc tccgggagtt gctaaacaag tttatggtag ttcagtaccc gtgttagacg 1680gtgaaaaaca ttcgatgaga ttattggagg accactcaat tgtggagagc tttgcccaag 1740gaggaagaac agtcataaca tcgcgaattt acccaacaaa ggcagtgaat ggagcagcac 1800gactcttcgt tttcaacaat gccacagggg ctagcgtgac tgcttccgtc aagatttggt 1860cacttgagtc ggctaatatt cgatccttcc ccttgcaaga cttgtaattc atcaagccat 1920atcttcttca ttcttttttt catttgaagg ttatttcacc gatgtcccat caagaaaggg 1980aagagaggga gaatatgtag tgttatactc tacttattcg ccattttagt gatttttcta 2040ctggactttt gctattcgca aaa 2063<210>2<211>1958<212>DNA<213>馬鈴薯<220>
<221>CD8<222>(22)...(1815)<400> 2tcttttgcgt tttgagcaat aatggcaagc ttgtgcaata gtagtagtac atctctcaaa 60actcctttta cttcttcctc cacttcttta tcttccactc ctaagccctc tcaacttttc 120atccatggaa aacgtaacca aatgttcaaa gtttcatgca aggttaccaa taataacggt 180gaccaaaacc aaaacgttga aacaaattct gttgatcgaa gaaatgttct tcttggctta 240ggtggtcttt atggtgttgc taatgctata ccattagctg catccgctgc tccagctcca 300cctcctgatc tctcgtcttg tagtatagcc aggattaacg aaaatcaggt ggtgccgtac 360agttgttgcg cgcctaagcc tgatgatatg gagaaagttc cgtattacaa gttcccttct 420atgactaagc tccgtgttcg tcagcctgct catgaagcta atgaggagta tattgccaag 480tacaatctgg cgattagtcg aatgaaagat cttgataaga cacaaccttt aaaccctatt 540ggttttaagc aacaagctaa tatacattgt gcttattgta acggtgctta tagaattggt 600ggcaaagagt tacaagttca taattcttgg cttttcttcc cgttccatag atggtacttg 660tacttccacg agagaatcgt gggaaaattc attgatgatc caactttcgc tttaccatat 720tggaattggg accatccaaa aggtatgcgt tttcctgcca tgtatgatcg tgaagggact 780tcccttttcg atgtaacacg tgaccaaagt caccgaaatg gagcagtaat cgatcttggt 840tttttcggca atgaagttga aacaactcaa ctccagttga tgagcaataa tttaacacta 900atgtaccgtc aaatggtaac taatgctcca tgtcctcgga tgttctttgg cgggccttat 960gatctcgggg ttaacactga actcccggga actatagaaa acatccctca cggtcctgtc 1020cacatctggt ctggtacagt gagaggttca actttgccca atggtgcaat atcaaacggt 1080gagaatatgg gtcattttta ctcagctggt ttggacccgg ttttcttttg ccatcacagc 1140aatgtggatc ggatgtggag cgaatggaaa gcgacaggag ggaaaagaac ggatatcaca 1200cataaagatt ggttgaactc cgagttcttt ttctatgatg aaaatgaaaa cccttaccgt 1260gtgaaagtca gagactgttt ggacacgaag aagatgggat acgattacaa accaattgcc 1320acaccatggc gtaacttcaa gcccttaaca aaggcttcag ctggaaaagt gaatacagct 1380tcacttccgc cagctagcaa tgtattccca ttggctaaac tcgacaaagc aatttcgttt 1440tccatcaata ggccgacttc gtcaaggact caacaagaga aaaatgcaca agaggagatg 1500ttgacattca gtagcataag atatgataac agagggtaca taaggttcga tgtgttttcg 1560aacgtggaca ataatgtgaa tgcgaatgag cttgacaagg cggagtttgc ggggagttat 1620acaagtttgc cacatgttca tagagctggt gagactaatc atatcgcgac tgttgatttc 1680cagctggcga taacggaact gttggaggat attggtttgg aagatgaaga tactattgcg 1740gtgactctgg tgccaaagag aggtggtgaa ggtatctcca ttgaaggtgc gacgatcagt 1800cttgcagatt gttaattagt ctctattgaa tctgctgaga ttacactttg atggatgatg 1860ctctgttttt gttttcttgt tctgtttttt cctctgttga aatcagcttt gttgcttgat 1920ttcattgaag ttgttattca agaataaatc agttacaa 1958
<210>3<211>1460<212>DNA<213>煙草<220>
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<220>
<221> CDS<222>(88)...(1161)<400> 6attcctcttt cccttgaact gtgttttcgt tttttctgct ctaaaacaat cgtgtgttcc 60ttctagattt taagtttaaa gaacatcatg ggtggcttgg aagttgagaa aacaactatt 120ggttgggctg ctagagaccc ttctggtgta ctttcacctt atacctatac tctcagaaac 180acaggacctg aagatgtgga agtcaaagtt ttgtattgtg ggctctgtca cactgatctt 240caccaagtta aaaatgatct tggcatgtcc aactaccctc tggttcctgg acatgaagtg 300gtgggagaag tggtggaggt aggaccagat gtgtcaaaat tcaaagttgg ggacacagtt 360ggagttggat tactcgttgg aagttgcagg aactgtggcc cttgcaagag agatatagag 420caatattgca acaagaagat ttggaactgc aatgatgtct acactgatgg caaacccacc 480caaggtggtt ttgctaaatc catggttgtt gatcaaaagt ttgtggtgaa aattccagag 540ggtatggcac cagaacaagc agcacctcta ttatgtgctg gtataacagt atacagtcca 600ttgaaccatt ttggtttcaa acagagtgga ttaagaggag gaattttggg attaggagga 660gtgggacaca tgggagtgaa aatagcaaag gcaatgggac atcatgttac tgtcattagt 720tcttcaaata agaagagaca agaggcattg gaacatcttg gtgcagatga ttatcttgtc 780agttcagaca ctgataaaat gcaagaggct tctgattcac ttgactatat tattgatact 840gtccctgttg gccatcctct tgaaccttat ctttctttgc ttaaaattga tggcaaactt 900atcttgatgg gagttatcaa cacccccttg caatttatct cccccatggt tatgctcggg 960agaaagagca tcacaggaag ctttattggt agcatgaagg aaacagagga aatgctagat 1020ttctgcaaag agaaaggtgt gacttcacag attgagatag tgaaaatgga ttatatcaac 1080actgcaatgg agaggttgga gaaaaatgat gtgaggtaca gatttgtggt tgatgttatt 1140ggaagcaagc ttgaccagta attatattac acaagaaaaa caacatggaa tggttcacta 1200ttatacaagg ctgtgagaat actaaacttt gatgtcgtct tttgtatcct tttgttttat 1260ttgccacctg tattttctta tttggtgatc gagagtgacg tttatgtatt attttctttc 1320ttcaaaacaa tttaatgtat gaatttggat gttggtgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1398<210>7<211>1533<212>DNA<213>紅花<220>
<221>CDS<222>(106)…(1296)<400>7gctcacttgt gtggtggagg agaaaaacag aactcacaaa aagctttgcg actgccaaga 60acaacaacaa caacaagatc aagaagaaga agaagaagat caaaaatggc tcttcgaatc 120actccagtga ccttgcaatc ggagagatat cgttcgtttt cgtttcctaa gaaggctaat 180ctcagatctc ccaaattcgc catggcctcc accctcggat catccacacc gaaggttgac 240aatgccaaga agccttttca acctccacga gaggttcatg ttcaggtgac gcactccatg 300ccaccacaga agatagagat tttcaaatcc atcgagggtt gggctgagca gaacatattg 360gttcacctaa agccagtgga gaaatgttgg caagcacagg atttcttgcc ggaccctgca 420tctgaaggat ttgatgaaca agtcaaggaa ctaagggcaa gagcaaagga gattcctgat 480gattactttg ttgttttggt tggagatatg attacagagg aagccctacc tacttaccaa 540acaatgctta ataccctaga tggtgtacgt gatgagactg gggctagcct tacgccttgg 600gctgtctgga ctagggcttg gacagctgaa gagaacaggc atggcgatct tctccacacc 660tatctctacc tttctgggcg ggtagacatg aggcagatac agaagacaat tcagtatccc 720attgggtcag gaatggatcc tcgtaccgaa aacagcccct accttgggtt catctacaca 780tcgtttcaag agcgtgccac atttgtttct cacggaaaca ccgccaggca tgcaaaggat 840catggggacg tgaaactggc gcaaatttgt ggtacaatcg cgtctgacga aaagcgtcac 900gagaccgctt atacaaagat agtcgaaaag ctattcgaga tcgatcctga tggcaccgtt 960cttgcttttg ccgacatgat gaggaaaaag atctcgatgc ccgcacactt gatgtacgat 1020gggcgtgatg acaacctctt cgaacatttc tcggcggttg cccaaagact cggcgtctac 1080accgccaaag actacgccga catactggaa tttctggtcg ggcggtggaa agtggcggat 1140ttgaccggcc tatctggtga agggcgtaaa gcgcaagatt atgtttgcgg gttgccacca 1200agaatcagaa ggctggagga gagagctcaa gggcgagcaa aggaaggacc tgttgttcca 1260ttcagctgga ttttcgatag acaggtgaag ctgtgaagaa aaaaaaaacg agcagtgagt 1320tcggtttctg ttggcttatt gggtagaggt taaaacctat tttagatgtc tgtttcgtgt 1380aatgtggttt tttttcttct aatcttgaat ctggtattgt gtcgttgagt tcgcgtgtgt 1440gtaaacttgt gtggctgtgg acatattata gaactcgtta tgccaatttt gatgacggtg 1500gttatcgtct cccctggtgt ttttttattg ttt 1533<210>8<211>1643<212>DNA<213>蓖麻<220>
<221>CDS<222>(1)...(1239)<400>8ttccggcaaa taacaaaaaa ccaaaagaaa aaggtaagaa aaaaaacaat ggctctcaag 60ctcaatcctt tcctttctca aacccaaaag ttaccttctt tcgctcttcc accaatggcc 120agtaccagat ctcctaagtt ctacatggcc tctaccctca agtctggttc taaggaagtt 180gagaatctca agaagccttt catgcctcct cgggaggtac atgttcaggt tacccattct 240atgccacccc aaaagattga gatctttaaa tccctagaca attgggctga ggagaacatt 300ctggttcatc tgaagccagt tgagaaatgt tggcaaccgc aggatttttt gccagatccc 360gcctctgatg gatttgatga gcaagtcagg gaactcaggg agagagcaaa ggagattcct 420gatgattatt ttgttgtttt ggttggagac atgataacgg aagaagccct tcccacttat 480caaacaatgc tgaatacctt ggatggagtt cgggatgaaa caggtgcaag tcctacttct 540tgggcaattt ggacaagggc atggactgcg gaagagaata gacatggtga cctcctcaat 600aagtatctct acctatctgg acgagtggac atgaggcaaa ttgagaagac aattcaatat 660ttgattggtt caggaatgga tccacggaca gaaaacagtc cataccttgg gttcatctat 720acatcattcc aggaaagggc aaccttcatt tctcatggga acactgcccg acaagccaaa 780gagcatggag acataaagtt ggctcaaata tgtggtacaa ttgctgcaga tgagaagcgc 840catgagacag cctacacaaa gatagtggaa aaactctttg agattgatcc tgatggaact 900gttttggctt ttgctgatat gatgagaaag aaaatttcta tgcctgcaca cttgatgtat 960gatggccgag atgataatct ttttgaccac ttttcagctg ttgcgcagcg tcttggagtc 1020tacacagcaa aggattatgc agatatattg gagttcttgg tgggcagatg gaaggtggat 1080aaactaacgg gcctttcagc tgagggacaa aaggctcagg actatgtttg tcggttacct 1140ccaagaatta gaaggctgga agagagagct caaggaaggg caaaggaagc acccaccatg 1200cctttcagct ggattttcga taggcaagtg aagctgtagg tggctaaagt gcaggacgaa 1260accgaaatgg ttagtttcac tctttttcat gcccatccct gcagaatcag aagtagaggt 1320agaattttgt agttgctttt ttattacaag tccagtttag tttaaggtct gtggaaggga 1380gttagttgag gagtgaattt agtaagttgt tgatactgtt gtgttcttgt gttgtcatga 1440gtctgcttga tagtgagttt cttttgtttc cttttgttgt gttcttttat ctggtctctc 1500tctctctctc tctctctttt tctcttatcc caagtgtctc aagtataata agcaaacgat 1560ccatgtggca attttgatga tggtgatcag tctcacaact tgatcttttg tcttctattg 1620gaaacacagc ctgcttgttt gaa 1643<210>9<211>2569<212>DNA<213>擬南芥
<221>外顯子<222>(236)...(729)<223>外顯子1<221>外顯子<222>(1030)...(1119)<223>外顯子2<221>外顯子<222>(1201)...(1267)<223>3<221>
<222>(1358)...(1450)<223>外顯子4<221>外顯子<222>(1530)...(1715)<223>外顯子5<221>外顯子<222>(1809)...(1889)<223>外顯子6<221>外顯子<222>(1993)...(2130)<223>外顯子7<221>外顯子<222>(2212)...(2403)<223>外顯子8<400>9cacaccatca ctaataaatt tccttctcct ttcaagttgt agctaactta tataagacat 60aagcgtgcga accagagaca gagatagaaa ttgagagacg ataagcaaag tagaaaacac 120aagtttctct cacacacatt atctctttct ctattaccac cactcattca taacagaaac 180ccaccaaaaa ataaaaagag agacttttca ctctggggag agagctcaag ttctaatggc 240gaacttggtc ttatcagaat gtggtatacg acctctcccc agaatctaca caacacccag 300atccaatttc ctctccaaca acaacaaatt cagaccatca ctttcttctt cttcttacaa 360aacatcatca tctcctctgt cttttggtct gaattcacga gatgggttca cgaggaattg 420ggcgttgaat gtgagcacac cattaacgac accaatattt gaggagtctc cattggagga 480agataataaa cagagattcg atccaggtgc gcctcctccg ttcaatttag ctgatattag 540agcagctata cctaagcatt gttgggttaa gaatccatgg aagtctttga gttatgtcgt 600cagagacgtc gctatcgtct ttgcattggc tgctggagct gcttacctca acaattggat 660tgtttggcct ctctattggc tcgctcaagg aaccatgttt tgggctctct ttgttcttgg 720tcatgactgg taaacttaaa aaccctaact tttttcttgt tttctcctct gctttagtct 780cctttagcct ttgatttggt caactttgga tgattccaaa gaaccaatcg aacaaattgg 840tctttatcca tatctcttca aatagcttta ggacataatt ggtctctcag gtaacaagct 900gtcattatca tcatactcat catgttgcta gtagaccaac ccaattggca actgtttgtt 960ggttttgcaa ctgtgtaatc tgctttgaat tgtgaacaaa attattgatt tatgttgatt 1020acattgcagt ggacatggta gtttcttaaa tgatccgaag ttgaacagtg tggtcggtca 1080tcttcttcat tcctcaattc tggtcccata ccatggctgg tgagttttgc tttcagacca 1140ttcttctcta aaaccacttg cagaatctca tcttcttcat gtaaaaatat gactttgcag 1200gagaattagt cacagaactc accaccagaa ccatggacat gttgagaatg acgaatcttg 1260gcatcctgta agtcaaaaac gtattttttt ggttatcttg ttttagtcct gtggtgtttc1320ttagatgcag ttttattaac tgtttctgta actgcagatg tctgagaaaa tctacaatac1380tttggacaag ccgactagat tctttagatt tacactgcct ctcgtgatgc ttgcataccc1440tttctacttg gtaagaactc ctctatttgt tatggtaact taagctgcca caccaagtaa1500aaaagctcat gtctattctt ctgtttcagt gggctcgaag tccggggaaa aagggttctc1560attaccatcc agacagtgac ttgttcctcc ctaaagagag aaaggatgtc ctcacttcta1620ctgcttgttg gactgcaatg gctgctctgc ttgtttgtct caacttcaca atcggtccaa1680ttcaaatgct caaactttat ggaattcctt actgggtaat gcgccgctgt tactcccctg1740tttcagcctg agcaatttgt gtattatttc ctctgcctta ctcaaaaagg tttttatgtc1800aaatacagat aaatgtaatg tggttggact ttgtgactta cctgcatcac catggtcatg1860aagataagct tccttggtac cgtggcaagg taaaatacat attctctgct tccactgttc1920tttgactaca tcgctctttc ttttaaggtt aaagccaact ggtgtgtaaa tctcatgatt1980ctcccaaaac aggagtggag ttacctgaga ggaggactta caacattgga tcgtgactac2040ggattgatca ataacatcca tcatgatatt ggaactcatg tgatacatca tcttttcccg2100cagatcccac attatcatct agtagaagca gtaagtaaat tgaaagtaaa gactgtttgt2160gtttttggtg ttcatgctag tttccctgac tcttgctcca ctgttatgca gacagaagca2220gctaaaccag tattagggaa gtattacagg gagcctgata agtctggacc gttgccatta2280catttactgg aaattctagc gaaaagtata aaagaagatc attacgtgag cgacgaagga2340gaagttgtat actataaagc agatccaaat ctctatggag aggtcaaagt aagagcagat2400tgaaatgaag caggcttgag attgaagttt tttctatttc agaccagctg attttttgct2460tactgtatca atttattgtg tcacccacca gagagttagt atctctgaat acgatcgatc2520agatggaaac aacaaatttg tttgcgatac tgaagctata tataccata2569<210>10<211>3879<212>DNA<213>擬南芥<220>
<221>外顯子<222>(780)...(1685)<223>外顯子1<221>外顯子<222>(1761)...(2129)<223>外顯子2<221>外顯子<222>(2207)...(2461)<223>外顯子3<221>外顯子<222>(2544)...(2671)<223>外顯子4<221>外顯子<222>(2762)...(2959)<223>外顯子5<221>外顯子<222>(3088)...(3448)<223>外顯子6<400>10aaagatagta tttgttgata aatatgggga tatttatcct atattatctg tatttttctt60accattttta ctctattcct ttatctacat tacgtcatta cactatcata agatatttga 120atgaacaaat tcatgcaccc accagctata ttaccctttt ttattaaaaa aaaacatctg 180ataataataa caaaaaaatt agagaaatga cgtcgaaaaa aaaagtaaga acgaagaaga 240agtgttaaac ccaaccaatt ttgacttgaa aaaaagcttc aacgctcccc ttttctcctt 300ctccgtcgct ctccgccgcg tcccaaatcc ccaattcctc ctcttctccg atcaattctt 360cccaagtaag cttcttcttc ctcgattctc tcctcagatt gtttcgtgac ttctttatat 420atattcttca cttccacagt tttcttctgt tgttgtcgtc gatctcaaat catagagatt 480gattaaccta attggtcttt atctagtgta atgcatcgtt attaggaact ttaaattaag 540atttaatcgt taatttcatg attcggattc gaattttact gttctcgaga ctgaaatatg 600caacctattt tttcgtaatc gttgtgatcg aattcgattc ttcagaattt atagcaattt 660tgatgctcat gatctgtcta cgctacgttc tcgtcgtaaa tcgaagttga taatgctatg 720tgtttgttac acaggtgtgt gtatgtgtga gagaggaact atagtgtaaa aaattcataa 780tggaagtctg caattgtatt gaaccgcaat ggccagcgga tgaattgtta atgaaatacc 840aatacatctc cgatttcttc attgcgattg cgtatttttc gattcctctt gagttgattt 900actttgtgaa gaaatcagcc gtgtttccgt atagatgggt acttgttcag tttggtgctt 960ttatcgttct ttgtggagca actcatctta ttaacttatg gactttcact acgcattcga 1020gaaccgtggc gcttgtgatg actaccgcga aggtgttaac cgctgttgtc tcgtgtgcta 1080ctgcgttgat gcttgttcat attattcctg atcttttgag tgttaagact cgggagcttt 1140tcttgaaaaa taaagctgct gagctcgata gagaaatggg attgattcga actcaggaag 1200aaaccggaag gcatgtgaga atgttgactc atgagattag aagcacttta gatagacata 1260ctattttaaa gactacactt gttgagcttg gtaggacatt agctttggag gagtgtgcat 1320tgtggatgcc tactagaact gggttagagc tacagctttc ttatacactt cgtcatcaac 1380atcccgtgga gtatacggtt cctattcaat taccggtgat taaccaagtg tttggtacta 1440gtagggctgt aaaaatatct cctaattctc ctgtggctag gttgagacct gtttctggga 1500aatatatgct aggggaggtg gtcgctgtga gggttccgct tctccacctt tctaattttc 1560agattaatga ctggcctgag ctttcaacaa agagatatgc tttgatggtt ttgatgcttc 1620cttcagatag tgcaaggcaa tggcatgtcc atgagttgga actcgttgaa gtcgtcgctg 1680atcaggtttt acattgctga gaatttctct tctttgctat gttcatgatc ttgtctataa 1740cttttcttct cttattatag gtggctgtag ctctctcaca tgctgcgatc ctagaagagt 1800cgatgcgagc tagggacctt ctcatggagc agaatgttgc tcttgatcta gctagacgag 1860aagcagaaac agcaatccgt gcccgcaatg atttcctagc ggttatgaac catgaaatgc 1920gaacaccgat gcatgcgatt attgcactct cttccttact ccaagaaacg gaactaaccc 1980ctgaacaaag actgatggtg gaaacaatac ttaaaagtag taaccttttg gcaactttga 2040tgaatgatgt cttagatctt tcaaggttag aagatggaag tcttcaactt gaacttggga 2100cattcaatct tcatacatta tttagagagg taacttttga acagctctat gtttcataag 2160tttatactat ttgtgtactt gattgtcata ttgaatcttg ttgcaggtcc tcaatctgat 2220aaagcctata gcggttgtta agaaattacc catcacacta aatcttgcac cagatttgcc 2280agaatttgtt gttggggatg agaaacggct aatgcagata atattaaata tagttggtaa 2340tgctgtgaaa ttctccaaac aaggtagtat ctccgtaacc gctcttgtca ccaagtcaga 2400cacacgagct gctgactttt ttgtcgtgcc aactgggagt catttctact tgagagtgaa 2460ggttattatc ttgtatcttg ggatcttata ccatagctga aagtatttct taggtcttaa 2520ttttgatgat tattcaaata taggtaaaag actctggagc aggaataaat cctcaagaca 2580ttccaaagat tttcactaaa tttgctcaaa cacaatcttt agcgacgaga agctcgggtg 2640gtagtgggct tggcctcgcc atctccaaga ggtttgagcc ttattaaaag acgttttttt 2700ccaacttttt cttgtcttct gtgttgttaa aagtttactc ataagcgttt aatatgacaa 2760ggtttgtgaa tctgatggag ggtaacattt ggattgagag cgatggtctt ggaaaaggat 2820gcacggctat ctttgatgtt aaacttggga tctcagaacg ttcaaacgaa tctaaacagt 2880cgggcatacc gaaagttcca gccattcccc gacattcaaa tttcactgga cttaaggttc 2940ttgtcatgga tgagaacggg ttagtataag cttctcacct ttctctttgc aaaatctctc 3000gccttacttc ttgcaaatgc agatattggc gtttagaaaa aacgcaaatt taatcttatg 3060agaaaccgat gattattttg gttgcagggt aagtagaatg gtgacgaagg gacttcttgt 3120acaccttggg tgcgaagtga ccacggtgag ttcaaacgag gagtgtctcc gagttgtgtc 3180ccatgagcac aaagtggtct tcatggacgt gtgcatgccc ggggtcgaaa actaccaaat 3240cgctctccgt attcacgaga aattcacaaa acaacgccac caacggccac tacttgtggc 3300actcagtggt aacactgaca aatccacaaa agagaaatgc atgagctttg gtctagacgg 3360tgtgttgctc aaacccgtat cactagacaa cataagagat gttctgtctg atcttctcga 3420gccccgggta ctgtacgagg gcatgtaaag gcgatggatg ccccatgccc cagaggagta 3480attccgctcc cgccttcttc tcccgtaaaa catcggaagc tgatgttctc tggtttaatt 3540gtgtacatat cagagattgt cggagcgttt tggatgatat cttaaaacag aaagggaata 3600acaaaataga aactctaaac cggtatgtgt ccgtggcgat ttcggttata gaggaacaag 3660atggtggtgg tataatcata ccatttcaga ttacatgttt gactaatgtt gtatccttat 3720atatgtagtt acattcttat aagaatttgg atcgagttat ggatgcttgt tgcgtgcatg 3780tatgacattg atgcagtatt atggcgtcag ctttgcgccg cttagtagaa caacaacaat 3840ggcgttactt agtttctcaa tcaacccgat ctccaaaac3879<210>11<211>1200<212>DNA<213>擬南芥<220>
<221>CDS<222>(53)...(1024)<400>11cgttgctgtc gaagttaggc caagaaaccc atttaaaaaa aaagagagag agatggagag 60tttcccgatc atcaatctcg agaagcttaa tggagaagag agagcaatca ctatggagaa 120gatcaaagac gcttgtgaaa actggggctt ctttgagtgt gtgaaccatg ggatttcact 180cgagcttttg gacaaagtgg agaagatgac caaggaacat tacaagaagt gcatggaaga 240gagattcaag gaatcgatta agaacagagg tcttgactct cttcgctctg aagtcaacga 300cgttgactgg gaatccactt tctacctcaa gcaccttccc gtctctaata tctccgatgt 360ccctgatctc gacgacgatt acagaacgtt aatgaaagac ttcgccggaa agatagagaa 420gttgtcggag gagctactgg atctgctgtg cgagaatctc ggtttagaga agggttattt 480aaaaaaggtg ttttacgggt cgaaaagacc gacttttgga accaaagtca gcaattatcc 540accttgtcct aatccggacc tagtcaaggg tctccgagcc cacaccgacg ccggcggcat 600catcctcctc ttccaagacg acaaagtcag tggacttcag cttcttaaag acggcgagtg 660ggtcgatgtt cctccggtta agcattcaat cgtcgttaat ctcggcgatc aacttgaggt 720gataaccaat gggaagtaca agagtgtgga acatagagtg ctatctcaga cagacggaga 780aggaagaatg tcgatcgcat cattctataa tccgggaagc gactctgtta tttttccggt 840gccggagctg atcggaaaag aagcagagaa ggagaagaaa gagaactatc cgagatttgt 900gtttgaagat tacatgaaac tctactctgc tgtcaagttt caggccaagg aaccaaggtt 960tgaagccatg aaagctatgg agacaactgt ggccaacaat gttggaccat tggccactgc 1020gtgaatgata tgtaactggt taataaatat atatatatat atatatatag tctttatata 1080atgtcttaga aacttgatta ttcactatac gaataatttt gttcatgttg ttgtatgttt 1140aagtggtgaa tgtgttatat atgggaatta atgttttctg ttcgaaaaaa aaaaaaaaaa 1200<210>12<211>3438<212>DNA<213>擬南芥<220>
<221>外顯子<222>(1212)...(1358)<223>Exon 1<221>exon<222>(1461)...(1592)<223>Exon 2
<221>外顯子<222>(1660)...(1820)<223>外顯子3<221>外顯子<222>(1909)...(2893)<223>外顯子4<400> 12gttacttttc aaatcttccc tcatattata tagccattga tatcatagag gatgtgagtt 60ttaacttaat atttacccgt ttgaaactag ctatttactt aaatatgaat tataatctag 120tttaactacc aaaaacatca tatggggaca agaaaaagta ataaaacgta tggaaaattt 180tgtagatgtt ataaatggat aattattcaa gtgataatct atcactttga tcttatctct 240ttatccaatt taattacttt gtctctaagt gatttgcttc caaaatctaa gtgtagtcta 300tcctatttct atcttatcct atcatataat cttctatata tatgtgagtc cgatgttgta 360aagcgtacga gagagagtaa tgaagagtga agtgttatat tgttctctcg tccacttcca 420ctctctcttt tatctcttac ttacttcttc gtaagatcat tacatataat aaataatatt 480atttatgttt gtgttatatt taataacagt aaaaagtttt aaaacgttga aaaaattagc 540cgacatagaa tacaaaagag ggttagcatc gggggagaaa cgtggaccaa catgatacac 600cctccaaaat agtccccaag ttgaaacatt gacatgtttc gctttttctt ttctgtgtat 660actttttttt tctgtgggtc acattattta atatttgtat acaagcagct attttacatg 720gagatttcct gtcggtatag cgtcctcatt tctccatcgc ttccactttt ttcctatact 780aatttgatct aattaattca tatgtcaaaa cattaagaaa atgaaactcg taattcatac 840ttgaatttaa tagattaatt aaaatgctat ttattggcaa aataaactcg gtttatatct 900aaattttaga atcactaaaa ctttttgccc aaaaaaaaat aaaaataaat cactaaaaca 960aaaaacaatc aaaagaaaac ccatgttggt aaatcggata atgaaaataa ttagaatccc 1020cgtcctttgt gtattttggc gtagcatgaa actatataat aaacatgcat tcattcttag 1080acttctcgta gcttatcaac aacaacgcgc tcgatctctc tcagcctgtc tgacaactct 1140ttctctagtt ctagagtttt caatttattg ttgagccttt tattaaaaaa aaaaaaacaa 1200gaacaaaaga aatggttcaa ttgtcaagaa aagctacatg caacagccat ggccaagtct 1260cttcgtattt ccttggttgg gaagagtacg agaagaatcc ttacgacgtt accaagaacc 1320ctcaaggcat tatccagatg ggtcttgcgg aaaatcaggt aaacaaatat tattcaacag 1380catgtgatat atatatactt atgtatatca tgacagagag actaatttaa agtatgttta 1440attttattgg atttctgtag ctatgctttg atctactaga gtcatggctt gcacaaaaca 1500cagacgcagc ctgtttcaag agagatggcc agtctgtttt ccgggaactc gctctctttc 1560aagactacca tggcctctct tccttcaaaa atgtaagatt attaattgta tttatcaaat 1620ttatttgtag gttgctgatc ttgctcgaat gattttcagg cctttgctga tttcatgtca 1680gaaaatagag gaaatcgagt ttcttttgat tcaaacaacc ttgtgctcac tgctggagcc 1740acttccgcaa acgagactct aatgttttgt cttgcagatc ccggtgacgc tttcttgctt 1800cccacgccat attatccagg gttagtccac tgtttgctta cacgtaaaat ttccatcatt 1860cctacgaact tgacttaact aaaactcatg tttatttttg tacttcaggt ttgataggga 1920tctaaaatgg cgaaccgggg ttgagattgt accaatccaa agctcaagta ctaacgggtt 1980tcgcataacg aaacttgcac tcgaagaagc ctacgagcaa gccaagaagc ttgacctaaa 2040cgtcaaagga atactcatca ccaacccatc taaccctttg ggtacgacaa caacccaaac 2100cgaactcaac attctatttg atttcatcac caagaataag aatatacatt tagtaagtga 2160cgagatatat tcgggcacag tattcaactc ttcagaattc atcagcgtca tggagattct 2220aaaaaataat caactcgaaa acaccgatgt tttgaaccga gtccacattg tttgtagctt 2280atctaaagat ctaggcctcc ctggttttag agttggagcc atttactcca atgacaaaga 2340tgtcatctct gccgctacaa aaatgtcaag tttcggcctt gtctcctccc agacacaata 2400cctactatcc tcattattat ctgacaagaa gttcactaag aactacctta gagagaacca 2460aaaacggctc aagaacagac agagaaagct cgtgttgggt ctagaggcca tcgggatcaa 2520atgtctgaag agtaatgcgg gactcttttg ttgggtcgac atgagacctc tccttagatc 2580taaaacgttc gaagcggaaa tggatctttg gaagaagatt gtttacgaag tgaagctcaa 2640catctctcct ggttcgtcgt gccattgtga agaaccgggt tggtttagag tttgtttcgc 2700gaacatgatt gatgagacat taaagcttgc tttaaagaga ttgaagatgt tggttgatga 2760tgaaaactca agtagaagat gccaaaagag taaaagcgaa agactaaacg gttcgaggaa 2820gaagacgatg tcaaatgtct ctaactgggt tttccgacta tcgtttcacg accgtgaggc 2880tgaggaacga tagtccggtt tttgttttga agttcttttt ttttgtttcc cacacattgc 2940aagtgattct gtaatttttt ttatcacgag agagagtgta aaaaaatgga aatgcaacgt 3000gcttactctg atcctagatt ttagaaaacc gttgaagact tcttagagca agtccatcgg 3060cagtttttaa tgggtttcta atgggtttct agctaattaa aagtccaaaa ttaaatgaaa 3120acccaactaa ataattagga tccatcccaa tattaggttt tttggatggg tttttagacg 3180gcgacgtggt cgactgtgag tcgtcggaaa acaaaaaaaa tcacaacact catgttttcc 3240tttttcctct cgtttttcac ttttttgttt tgtccgacgg ccggcgattc gaatcgattt 3300gatctccggt gtatcgaaca tgaaatcggg agagaagagc caaatcatcg acgacttggt 3360tcaccaattc cattcttcga accatactca tataagagtt tcttggcttc tctctaaaac 3420tcttctaatt ttctgata 3438<210>13<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸<400>13caggtcaagt gcaacgtagg atgattttta ucaaccuacg ttgcacuuga ccuggcgcgt 60tttcgcgc 68<210>14<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸<400>14caggtcaagtgctacgtagg atgattttta ucaaccuacg tagcacuuga ccuggcgcgt 60tttcgcgc 68<210>15<211>24<212>DNA<213>水母<400>15atggtgagca agggcgagga gctg24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變
<400>16atggtgagca agggctagga gctg24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變<400>17atggtgagca agggcaggag ctgt 24<210>18<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸<400>18gtgagcaagg gcgaggagct gttcattttu gaacagcucc tcgcccuugc ucacgcgcgt 60tttcgcgc 68<210>19<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有DNA和RNA的有益寡核酸<400>19tgagcaaggg ctcggagctg ttcacttttg ugaacagcuc cgagcccuug cucagcgcgt 60tttcgcgc 68
權(quán)利要求
1.一種在植物細(xì)胞靶基因上產(chǎn)生定點(diǎn)突變的方法，包括以下步驟a.將一種重組誘發(fā)性寡核堿基附著在一種顆粒上，該寡核堿基包括一個(gè)第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有一個(gè)與靶基因的第一個(gè)片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入?yún)^(qū)，該區(qū)至少含有一個(gè)與所述靶基因不同源的核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)；b.將所述顆粒導(dǎo)入一群植物細(xì)胞的細(xì)胞中；c.從所述細(xì)胞群中鑒定在所述靶基因的第一和第二片段之間具有一個(gè)突變的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1的方法，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是MDON，而每一個(gè)同源區(qū)含有至少6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述插入?yún)^(qū)的長度至少為3個(gè)核苷酸。
4.如權(quán)利要求2的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞以便產(chǎn)生植物的步驟。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述第一RNA片段含有至少8個(gè)連續(xù)的2’-取代核糖核苷酸。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述第二RNA片段含有至少8個(gè)連續(xù)的2’-取代核糖核苷酸。
7.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述突變靶基因的序列與MDON的序列同源。
8.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述附著步驟是在含有1.1-1.4M氯化鈉和18-22μM亞精胺和至少14μg/ml MDON的溶液中進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，蘇氨酸脫水酶基因，二氫2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述植物細(xì)胞是玉米、小麥、稻或萵苣細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述植物細(xì)胞是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述靶基因選自編碼以下酶的基因酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶。
13.如權(quán)利要求12的方法，所述植物細(xì)胞源于玉米、小麥、稻或萵苣植物。
14.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述植物細(xì)胞源于馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物。
15.如權(quán)利要求2的方法，還包括由所述植物或所述植物的后代生產(chǎn)種子。
16.一種在具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞靶基因上產(chǎn)生定點(diǎn)突變的方法包括以下步驟a.在一群植物細(xì)胞的細(xì)胞壁上開孔；b.導(dǎo)入一種重組誘發(fā)性寡核堿基，該寡核堿基包括一個(gè)第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有一個(gè)與靶基因的第一個(gè)片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和一個(gè)第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入序列，該序列具有與所述靶基因不同源的至少一個(gè)核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)；c.從所述細(xì)胞群中鑒定在所述靶基因的第一和第二片段之間具有一個(gè)突變的細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是MDON，而每一個(gè)同源區(qū)含有一個(gè)至少有6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
18.如權(quán)利要求17的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞以便產(chǎn)生植物的步驟。
19.如權(quán)利要求17的方法，其中，位于所述第一和第二片段之間的靶基因的序列與MDON的插入?yún)^(qū)的序列在一個(gè)錯(cuò)配核苷酸上不同，而所述靶基因的突變位于靠近所述錯(cuò)配核苷酸處。
20.如權(quán)利要求17的方法，其中，位于所述第一和第二片段之間的靶基因的序列與MDON的突變片段的序列在一個(gè)錯(cuò)配核苷酸處不同，而所述靶基因的突變位于所述錯(cuò)配核苷酸處。
21.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，蘇氨酸脫水酶基因，二氫2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述植物細(xì)胞是玉米、小麥、稻或萵苣細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述植物細(xì)胞是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述靶基因選自編碼以下酶的基因酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶的基因。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述靶基因是源于玉米、小麥、稻或萵苣植物的基因。
26.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述靶基因是源于馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物的基因。
27.如權(quán)利要求17的方法，還包括由所述植物或所述植物的后代生產(chǎn)種子。
28.一種在植物細(xì)胞質(zhì)體的靶基因上產(chǎn)生定點(diǎn)突變的方法，包括以下步驟a.導(dǎo)入一種重組誘發(fā)性寡核堿基，該寡核堿基包括一個(gè)第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有一個(gè)與靶基因的第一個(gè)片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和一個(gè)第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入?yún)^(qū)，該區(qū)具有與所述靶基因不同源的至少一個(gè)核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)；b.從所述細(xì)胞群中鑒定在所述靶基因的第一和第二片段之間具有一個(gè)突變的細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是MDON，而每一個(gè)同源區(qū)含有一個(gè)至少有6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
30.如權(quán)利要求29的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞以便產(chǎn)生植物的步驟。
31.一種在植物細(xì)胞靶基因上產(chǎn)生定點(diǎn)的非選擇性突變的方法，包括以下步驟a.將第一重組誘發(fā)性寡核堿基和第二重組誘發(fā)性寡核堿基的混合物導(dǎo)入一群細(xì)胞的細(xì)胞中，其中i.所述第一重組誘發(fā)性寡核堿基包括第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有與第一靶基因的第一片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述第一靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入?yún)^(qū)，該區(qū)至少含有一個(gè)與所述靶基因不同源的核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)，和ii.所述第二重組誘發(fā)性寡核堿基包括第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有與第二靶基因的第一片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述第二靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入?yún)^(qū)，該區(qū)至少含有一個(gè)與所述靶基因不同源的核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)；b.從所述細(xì)胞群中篩選在所述第一靶基因的第一和第二片段之間具有一個(gè)選擇性突變的細(xì)胞；和c.鑒定在所述第二靶細(xì)胞的第一和第二片段之間具有一個(gè)非選擇性突變的選定細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是MDON，而每一個(gè)同源區(qū)含有一個(gè)至少有6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，蘇氨酸脫水酶基因，二氫2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。
34.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述植物細(xì)胞是玉米、小麥、稻或萵苣細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述植物細(xì)胞是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述第二靶基因選自編碼以下酶的基因酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶。
37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述植物細(xì)胞是玉米、小麥、稻或萵苣細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述植物細(xì)胞是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求32的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞以便產(chǎn)生植物的步驟。
40.如權(quán)利要求39的方法，還包括由所述植物或所述植物的后代生產(chǎn)種子。
41.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述第二重組誘發(fā)性寡核堿基是異源雙鏈重組誘發(fā)性寡核堿基，并且所述第二重組誘發(fā)性寡核堿基的每一個(gè)同源區(qū)包括一個(gè)有至少6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
42.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述靶基因是第一ALS基因，第二ALS基因，psbA基因，蘇氨酸脫水酶基因，二氫2，6-吡啶二羧酸合酶基因，或S14/rp59基因。
43.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述植物細(xì)胞是玉米、小麥、稻或萵苣細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述植物細(xì)胞是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花細(xì)胞。
45.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述靶基因選自編碼以下酶的基因酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、etr-1或其同系物、ACC合酶和ACC氧化酶。
46.如權(quán)利要求36、45的方法，其中，所述第二靶基因源于玉米、小麥、稻或萵苣植物。
47.如權(quán)利要求36、45的方法，其中，所述第二靶基因源于馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物。
48.如權(quán)利要求41的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞以便產(chǎn)生植物的步驟。
49.如權(quán)利要求48的方法，還包括由所述植物或所述植物的后代生產(chǎn)種子。
50.一種在植物細(xì)胞靶基因上產(chǎn)生定點(diǎn)突變的方法，包括以下步驟a.用纖維素酶消化植物部分，以便形成植物細(xì)胞原生質(zhì)體；b.將所述原生質(zhì)體懸浮在含有重組誘發(fā)性寡核堿基的溶液中，該寡核堿基含有第一同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述靶基因的第一片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，和第二同源區(qū)，該同源區(qū)具有與所述靶基因的第二片段的至少6個(gè)堿基對(duì)的序列相同的序列，以及一個(gè)插入?yún)^(qū)，該區(qū)包括至少一個(gè)與所述靶基因不同源的核堿基，該插入?yún)^(qū)連接所述第一同源區(qū)和第二同源區(qū)；c.對(duì)所述懸浮液進(jìn)行電穿孔，以便所述重組誘發(fā)性寡核堿基進(jìn)入該懸浮液的原生質(zhì)體中；d.培養(yǎng)所述原生質(zhì)體；和e.鑒定所述在所述靶基因的第一和第二片段之間具有一個(gè)突變的原生質(zhì)體的后代。
51.如權(quán)利要求50的方法，還包括培養(yǎng)鑒定的后代以便產(chǎn)生植物的步驟。
52.如權(quán)利要求50的方法，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是MDON，而每一個(gè)同源區(qū)含有至少6個(gè)RNA-型核苷酸的RNA片段。
53.如權(quán)利要求50的方法，其中，所述重組誘發(fā)性寡核堿基是異源雙鏈重組誘發(fā)性寡核堿基。
54.一種在一個(gè)基因上具有點(diǎn)突變的植物或種子，該突變?cè)谄湟吧瓦z傳位點(diǎn)上，所述基因選自編碼以下酶的基因酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、ACC合酶和ACC氧化酶或etr-1或其同系物的基因，而所述突變23KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列，該點(diǎn)突變產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子或者是一種移碼突變。
55.如權(quán)利要求54的植物或種子，其中，所述點(diǎn)突變產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子。
56.如權(quán)利要求55的植物或種子，其中，所述選擇性突變40KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
57.如權(quán)利要求55的植物或種子，其中，所述選擇性突變100KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
58.如權(quán)利要求55的植物或種子，其中，所述點(diǎn)突變是單堿基對(duì)突變。
59.如權(quán)利要求55的植物或種子，它是玉米、小麥、稻或萵苣植物或種子。
60.如權(quán)利要求55的植物或種子，它是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物或種子。
61.如權(quán)利要求55的植物或種子，在第二個(gè)基因上還具有一個(gè)選擇性點(diǎn)突變，選擇性點(diǎn)突變23KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
62.如權(quán)利要求61的植物或種子，其中，所述選擇性突變40KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
63.如權(quán)利要求61的植物或種子，其中，所述選擇性突變100KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
64.如權(quán)利要求54的植物或種子，其中，所述點(diǎn)突變是移碼突變。
65.如權(quán)利要求64的植物或種子，其中，所述選擇性突變40KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
66.如權(quán)利要求64的植物或種子，其中，所述選擇性突變100KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
67.如權(quán)利要求64的植物或種子，其中，所述點(diǎn)突變是單堿基對(duì)突變。
68.如權(quán)利要求64的植物或種子，它是玉米、小麥、稻或萵苣植物或種子。
69.如權(quán)利要求64的植物或種子，它是馬鈴薯、番茄、油菜、大豆或棉花植物或種子。
70.如權(quán)利要求64的植物或種子，在第二個(gè)基因上還具有一個(gè)選擇性點(diǎn)突變，選擇性點(diǎn)突變23KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
71.如權(quán)利要求70的植物或種子，其中，所述選擇性突變40KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
72.如權(quán)利要求70的植物或種子，其中，所述選擇性突變100KB以內(nèi)的基因組DNA序列是野生型DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用大約25—30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸在植物細(xì)胞中導(dǎo)入位點(diǎn)專一性遺傳改變的用途。所述寡核苷酸可以通過機(jī)械(biolistic)系統(tǒng)輸送或通過對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔輸送。然后,可以從所述改變過的細(xì)胞產(chǎn)生具有所述遺傳改變的植物。在具體實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及編碼酸性轉(zhuǎn)化酶、UDP－葡萄糖焦磷酸化酶、多酚氧化酶、O－甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、ACC合酶和ACC氧化酶或etr－1或etr－1的同系物的基因的改變,以及在所述基因上具有分離的點(diǎn)突變的植物。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1273606SQ98809867
公開日2000年11月15日 申請(qǐng)日期1998年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月5日
發(fā)明者C·J·阿恩岑, P·B·基普, R·庫馬, G·D·梅 申請(qǐng)人:金默拉根有限公司