專利名稱：：含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)和在高溫和低溫下雄性不育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植物，它在高溫和低溫下雄性不育，并且顯示良好的雌性可育。
背景技術(shù)：
：和發(fā)明概述在提高植物和食用作物的產(chǎn)量的艱難嘗試中，通常植物育種者開發(fā)含有某種令人滿意的特性例如增加的高度，生長速率，較高的產(chǎn)量等等的栽培品種。已經(jīng)成功的途徑之一是通過將令人滿意的特性注入植株，形成優(yōu)良的植物品系。然后將優(yōu)良的植物品系結(jié)合以形成具有令人滿意的特性的F1雜種。所述優(yōu)良的雜種能夠以許多途徑開發(fā)。產(chǎn)生優(yōu)良雜種的普遍途徑之一是通過利用雄性不育的植株植物進(jìn)行所需的雜交的一種植株。育種者利用雄性不育系，通過控制植物的花進(jìn)行交叉授粉可以更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)雜種種子。通過阻止雌性親本的自花授粉能夠控制交叉授粉。通過使植株雄性不育可以去除自花授粉。如果植株是雄性不育，那么不能產(chǎn)生用于授粉的花粉。一旦呈現(xiàn)雄性不育，就將該植株與具有所需特性的基因供體植株雜交。實(shí)現(xiàn)雄性不育的一條途徑是通過使用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。目前認(rèn)為在細(xì)胞質(zhì)中存在控制細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)的遺傳因子，特別是在線粒體DNA的基因中。在蕓苔品種中最通用的三種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是(1)蘿卜sativus的Ogura雄性不育細(xì)胞質(zhì)；(2)油菜的polima雄性不育細(xì)胞質(zhì)；和(3)油菜的Nap雄性不育細(xì)胞質(zhì)。在蕓苔中，通過雜交能夠遺傳細(xì)胞質(zhì)雄性不育。雌性(蛋形物)親本提供細(xì)胞質(zhì)，因此與CMS雌性的雜交產(chǎn)生CMS子代。但是，核基因是雜合的。因此，“回交”6-8代是必要的，以便產(chǎn)生細(xì)胞核特性的育種純合CMS品系。作為另一種可選的方法，通過原生質(zhì)體融合也能夠產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。在原生質(zhì)體融合中，將具有商業(yè)上所需特性的植株的原生質(zhì)體與CMS品系的原生質(zhì)體結(jié)合。在融合之前，去除或者失活CMS品系的核物質(zhì)，因此它僅提供細(xì)胞質(zhì)。獲得的細(xì)胞質(zhì)雜種(或cybrid)具有CMS細(xì)胞質(zhì)并且是雄性不育。例如，美國專利5,254,802公開了含有OguraCMS細(xì)胞質(zhì)甘藍(lán)植物。這些植物可以通過原生質(zhì)體融合獲得。已經(jīng)將polimaCMS細(xì)胞質(zhì)用于產(chǎn)生CMS品系例如冬季型油菜(Brassicanapus)(參見Barsby等人，植物科學(xué)，53:243-248(1987))。但是，由polimaCMS細(xì)胞質(zhì)表達(dá)細(xì)胞質(zhì)雄性不育的一個顯著的問題是polima細(xì)胞質(zhì)受環(huán)境條件的影響。Fan,Z等人，Can.J.PlantSci.66:221-227(1985)。更具體地說，已知含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的雄性不育植株在高溫的大田中變成可育。Id.也參見Fu,T.D.,EncarpiaCrucifereaNewsletter6:6-7(1981)。本發(fā)明涉及含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的甘藍(lán)植物，它在高溫和低溫下雄性不育，并且顯示良好的雌性可育。采用傳統(tǒng)的育種方法能夠制備本發(fā)明的甘藍(lán)植物。通過進(jìn)一步的雜交或回交或通過原生質(zhì)體融合能夠開發(fā)不同的甘藍(lán)型。為了通過傳統(tǒng)育種技術(shù)獲得本發(fā)明的甘藍(lán)植物，使Brassicacampestris栽培品系87110和甘藍(lán)栽培品系87101進(jìn)行種間雜交。收集雜交產(chǎn)生的種子，種植，和再生。獲得的植物是油菜并且含有單套染色體。通過用秋水仙堿處理該植株使所述油菜的染色體含量加倍。通過將油菜栽培品系87118與甘藍(lán)栽培品系87101雜交進(jìn)行第二次種間雜交。收集雜交產(chǎn)生的種子，種植，和再生。與前面的雜交一樣，獲得的植物是油菜并且含有單套染色體。用秋水仙堿處理該植株使其染色體含量加倍。接著將第二次種間雜交產(chǎn)生的油菜植株與油菜栽培品系87102雜交，后一品系含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)并且雄性不育。收集雜交產(chǎn)生的種子，種植，和再生。再生的植株是油菜并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。隨后將獲得的植株與第一次種間雜交產(chǎn)生的油菜植株雜交。收集雜交產(chǎn)生的種子，種植，和再生。再生的植株是油菜，含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)并且雄性不育。然后將獲得的植株與正常的甘藍(lán)雜交。雜交的結(jié)果是，產(chǎn)生長角果，收集，檢查其種子。收集其種子進(jìn)行胚挽救處理，因?yàn)橥ǔ乃龇N間雜交產(chǎn)生的胚在成熟之前發(fā)生流產(chǎn)。但是，通過使用胚挽救技術(shù)，能夠產(chǎn)生種間雜種植株。獲得的F1植株含有來自于雌性油菜的polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，但是核DNA內(nèi)含物是油菜(N=19)和甘藍(lán)(N=9)的結(jié)合。然后將獲得的植株與甘藍(lán)回交。又產(chǎn)生長角果，收集，檢查其種子。收集其種子進(jìn)行胚挽救處理。然后如前面的雜交，再生胚。獲得的植株是染色體數(shù)的中間體并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。該植株的核內(nèi)含物是油菜和甘藍(lán)的結(jié)合。然后將獲得的植株與甘藍(lán)回交。又產(chǎn)生長角果，收集，檢查其種子。將種子播種。獲得的植株是甘藍(lán)，它是雄性不育并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。非強(qiáng)制性地，可以將雄性不育的甘藍(lán)植株進(jìn)一步雜交或回交以產(chǎn)生不同的蕓苔類型。又將產(chǎn)生長角果，收集，檢查其種子。將種子播種。獲得的植株是甘藍(lán)，它是雄性不育并且具有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。通過原生質(zhì)體融合能夠產(chǎn)生不同類型的蕓苔。將具有商業(yè)上所需特性的蕓苔植株的原生質(zhì)體與含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)和失活的核的雄性不育甘藍(lán)的原生質(zhì)體融合。在融合之后，異源細(xì)胞再生為CMS蕓苔植株。獲得的植株是雄性不育并且具有polima細(xì)胞質(zhì)。再生的CMS蕓苔植株含有polima細(xì)胞質(zhì)并且能夠用于與含有商業(yè)上所需的特性的其它蕓苔類型雜交。附圖描述附圖1顯示在含有polimaCMS供體的核DNA的核酸內(nèi)切酶消化液中，BGLⅠ消化的DNA與探針E5的不同的雜交方式。以甘藍(lán)904005-1和甘藍(lán)繁殖系用作為CMS性狀的受體。泳道1顯示噬菌體λHindⅢ消化的DNA片段(分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。泳道2和3顯示polimaCMS甘藍(lán)904005-1DNA。泳道4和5顯示甘藍(lán)受體品系K14。泳道6和7顯示甘藍(lán)受體品系DE70。附圖2顯示在含有polimaCMS植株的線粒體DNA和受體繁殖系植株的線粒體DNA的核酸內(nèi)切酶消化液中BGLⅡ消化的DNA與探針CMSBRAS4的不同的雜交方式。泳道8和18顯示噬菌體λHindⅢ消化的DNA片段。泳道1-7顯示polimaCMS甘藍(lán)904005-1DNA。泳道9-17顯示甘藍(lán)受體品系K14。泳道19-24顯示甘藍(lán)受體品系DE70。發(fā)明描述已知含有polima細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育油菜植株為“滲漏”。滲漏是指這樣的事實(shí)在一定的溫度條件下植株趨向于失去不育性。例如，研究已經(jīng)證明含有polima細(xì)胞質(zhì)的CMS油菜植株在高溫時僅部分不育。參見Fan,Z等人，Can.J.PlantSci.66:221-227(1985)。本發(fā)明涉及含有polima細(xì)胞質(zhì)的CMS甘藍(lán)植物。在高溫和低溫條件下植株是雄性不育并且顯示良好的雌性可育。通過進(jìn)一步的雜交和回交或通過原生質(zhì)體融合能夠開發(fā)不同的甘藍(lán)CMS型。育種程序?qū)鹘y(tǒng)的育種技術(shù)用于開發(fā)本發(fā)明的甘藍(lán)植株。本發(fā)明人描述了用于制備本發(fā)明的甘藍(lán)植株的育種程序。通過使Brassicacampestris(=Brassicarapa)entry87110(N=10)和甘藍(lán)entry87101(N=19)發(fā)生種間雜交可以實(shí)現(xiàn)所述育種程序。entry87110是從植物研究中心(CPRO)，油政信箱16,6700AA,Wageningen，荷蘭獲得的，編號為IVT86007paar3MS并且是遺傳上雄性不育的。已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將87110寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland,20852。87110于1995年8月23日被寄存，ATCC保藏號為97246。entry87101可以從威斯康星，Madison，威斯康星大學(xué)的植物病理系，1630LindenDrive,CruciferGeneticsCooperative(CrGC)獲得，編號為CrGC#3-3(Ccc)并且是快速循環(huán)的甘藍(lán)。在雜交之后，發(fā)育獲得長角果(種子)。收集長角果，檢查其種子并且種植。獲得的植株是單倍體油菜ac(N=19)，用秋水仙堿處理使染色體加倍為雙倍體數(shù)aacc(2n=38)。獲得的植株是具有aacc基因組的“人工”油菜。將它們標(biāo)記為87116。與87110具有相同特性的第二個Brassicacampestris,87118也與87101雜交。87118從CPRO獲得的，編號為IVT86017paar3MS。已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將87118寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland,20852。87118于1995年8月23日被寄存，ATCC保藏號為97247。如在前面的雜交中，收集種子并且種植。獲得植株用秋水仙堿處理使染色體加倍。獲得的植株是具有aacc基因組的“人工”油菜。將它們標(biāo)記為87119。然后將87119植株與含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的雄性不育油菜(aacc)(標(biāo)記為87102)雜交。87102是從CruciferGeneticsCooperative(CrGC)獲得，編號為CrGC#5-4(AClaacc)，它是具有“polima”CMS細(xì)胞質(zhì)的快速循環(huán)油菜。產(chǎn)生長角果，收集并且檢查其種子。將種子種植，獲得的植株標(biāo)記為88102。這些植株是油菜，具有aacc基因組，含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。然后將87116和88102雜交，產(chǎn)生長角果，收集并且檢查其種子。將種子種植，獲得的植株是油菜(aacc)，標(biāo)記為88125。油菜(aacc)是甘藍(lán)N=9(cc基因組)和BrassicarapaN=10(aa基因組)之間的雙二倍體。88125是油菜(aacc)，含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)并且是雄性不育。將88125(aacc)和正常的雄性可育花莖甘藍(lán)植株，甘藍(lán)(cc)進(jìn)行種間雜交。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將認(rèn)識到任何雄性可育甘藍(lán)植株能夠用于進(jìn)行這種雜交。發(fā)育獲得長角果。然后收集長角果并且檢查其種子。如果存在種子，然后進(jìn)行胚挽救。因?yàn)橥ǔ乃龇N間雜交產(chǎn)生的胚在成熟之前發(fā)生流產(chǎn)，因此進(jìn)行胚挽救處理。但是，通過使用胚挽救技術(shù)，能夠產(chǎn)生種間雜種植株。胚挽救涉及從長角果取出胚。優(yōu)選的是當(dāng)胚盡可能大時進(jìn)行胚挽救。通常，雜交之后18-19天是進(jìn)行胚挽救的好機(jī)會。但是，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將認(rèn)識到胚挽救可能發(fā)生得更早或者更遲，只要種子被膜沒有變硬。對于胚挽救，首先將長角果在10％次氯酸鹽溶液(例如次氯酸鈉或次氯酸鉀)中消毒約20分鐘，在無菌水中以2.5和10分鐘的時間浸洗三次。接著，以縱向切開長角果。去除年幼的種子，在顯微鏡下將胚與種子分離。然后將胚置于合適的培養(yǎng)基中以促進(jìn)生長，例如描述于實(shí)施例11中的BLKC培養(yǎng)基。但是，可以使用有助于生長的任何培養(yǎng)基。將胚胎在20℃,4500LUX光照條件下至少生長兩星期。在根發(fā)育之后，盡可能快地將幼苗置于土壤中。將獲得的F1植株指定編號為88132-1到88132-84。這些植株含有來自于雌性油菜植株的polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，但是，核DNA內(nèi)含物是油菜(N=19)和甘藍(lán)(N=9)的結(jié)合。從本質(zhì)上說，植株具有混合的基因組。因?yàn)樗鼈兊幕旌咸匦?，植株是雄性不育并且部分是雌性可育。植株是雄性不育，因?yàn)樗鼈兒衼碜杂诖菩?蛋形物)親本，油菜，88125的polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。利用選擇表現(xiàn)型的方法從88132-1到88132-84選擇具有幾乎正常的DNA內(nèi)含物的植株(aacc或cc)。利用選擇表現(xiàn)型的方法使育種者可以選擇最類似于甘藍(lán)(cc基因組)的植株。肉眼觀察到具有異常DNA內(nèi)含物的植株與具有正常DNA內(nèi)含物的植株不同。將所選擇的植株與正常的長角果或者花椰菜，甘藍(lán)(cc)回交(BC1)。但是，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會認(rèn)識到可以使用任何的甘藍(lán)。在雜交之后，又使用胚挽救技術(shù)。將如此發(fā)育獲得的植株指定編號為89015到89040和89046到89056。這些植株的染色體數(shù)目處于中間階段，含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。又，核DNA內(nèi)含物是油菜和甘藍(lán)的結(jié)合。植株是雄性不育(polimaCMS)和部分雌性不育(染色體數(shù)目)。利用選擇表現(xiàn)型的方法從89015到89040和89046到89056選擇具有幾乎正常的DNA內(nèi)含物的植株。將所選擇的植株與正常的長角果或者花椰菜，甘藍(lán)(cc)回交(BC2)。但是，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會認(rèn)識到可以使用任何的甘藍(lán)。又發(fā)育長角果，但是一些種子不需要胚挽救。收集這些種子并且種植。從該雜交獲得的植株指定編號為89070到89141。大多數(shù)的這些植株具有正常的甘藍(lán)的染色體組(2N=18)，含有polima細(xì)胞質(zhì)并且是雄性不育的。這些植株的花已經(jīng)降低了花藥和花瓣。這些植株在高溫個低溫下保持不育并且顯示正常的雌性可育。將這些獲得的植株與其它甘藍(lán)類型例如長角果，花椰菜，甘藍(lán)(紅，白，皺葉甘藍(lán))，包子甘藍(lán)，球莖甘藍(lán)，羽衣甘藍(lán)等等進(jìn)行雜交以產(chǎn)生CMS品系。例如通過與CMS“polima”植株回交或通過原生質(zhì)體融合能夠產(chǎn)生不同的蕓苔類型。對于雄性不育，雌性可育和花形體的隨后的雜交和選擇方法隨后將從89015到89040和89046到89056和89070到89141的植株與正常的長角果和/或花椰菜進(jìn)行回交并且種植于大田。收集發(fā)育好的長角果，檢查其種子。收集種子，隨后播種。polima不育系的植株排與長角果保持系植株排交替種植。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員明白保持系是指用于雜交以產(chǎn)生子代的品系，所述子代保持了雄性不育親本材料的不育性。保持系植株是可育的，但是遺傳上是與生長產(chǎn)生其的CMS植株具有相同的復(fù)本。通常在交替的條中，產(chǎn)生雄性不育系種子。在生長期間之后，使用天然選擇方法(由蜜蜂和飛蠅等等)選擇具有雄性不育，良好的雌性可育和最好的花形態(tài)即良好的花瓣大小的植株。所選定的植株指定編號為CPO-1,-2等等。這些植株是甘藍(lán)，含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，是雄性不育并且具有良好的雌性可育性。在生長階段之后，顯示雄性不育，良好的雌性可育的CPO編號的植株克隆，置于具有典型的保持系的隔離罩。隔離罩的制備包括安裝一個網(wǎng)帳篷(昆蟲篩選)或包圍植株的一個隔離罩。這是為了阻止在大田中由昆蟲導(dǎo)致的與其它植株的交叉授粉。通常將蜂巢或其它昆蟲集落置于植株內(nèi)。收集由此發(fā)育的長角果，將種子播種。獲得的植株是含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的甘藍(lán)，是雄性不育，并且顯示良好的雌性可育。原生質(zhì)體融合通過原生質(zhì)體融合也能夠制備不同的CMS蕓苔類型。從含有CMSpolima細(xì)胞質(zhì)并且是雄性不育的甘藍(lán)能夠獲得原生質(zhì)體。例如，能夠使用由前面描述的育種程序獲得的甘藍(lán)植株，例如89070植株到89111植株和CPO系列的植株。原生質(zhì)體融合可以通過在融合緩沖液存在下即高pH溶液存在下使用導(dǎo)致凝集的聚乙二醇(PEG)以便使膜融合完成。在由Sundberg等人(植物科學(xué)43(1986)155)(引入本文作為參考)公開的條件下實(shí)現(xiàn)所述體細(xì)胞雜交，以產(chǎn)生種間雜種或其修飾形式。但是，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會認(rèn)識到可以使用除聚乙二醇(PEG)以外的方式完成原生質(zhì)體融合。例如，通過使用電場誘導(dǎo)的融合技術(shù)能夠?qū)⒃|(zhì)體融合，如Koop等人描述的“電場誘導(dǎo)的融合和用預(yù)選定的單個原生質(zhì)體重新構(gòu)建細(xì)胞和高等植物的亞原生質(zhì)體”，發(fā)表于細(xì)胞生物學(xué)的電穿孔和電融合，Neuman等人，editors，第355-365(1989)，引入本文作為參考。另外，用葡聚糖和聚乙烯醇可以完成原生質(zhì)體融合，如Hauptmann等人，“由氨基酸類似物抗性補(bǔ)充選擇胡蘿卜×煙草體細(xì)胞雜種”，第六屆國際原生質(zhì)體年會，Basel,1983年8月12-16，引入本文作為參考。如果用聚乙二醇完成原生質(zhì)體融合，能夠使用下面描述的程序。在下文中描述的洗滌溶液(W5’)中，便于實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的融合，所述洗滌溶液含有滲透劑例如碳水化合物例如甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖和鉀和鈣鹽。pH可以是5.2-10的范圍內(nèi)，優(yōu)選的是約5.7。將不同來源的原生質(zhì)體混合，方便地濃縮至最終密度為105和108原生質(zhì)體/毫升。然后應(yīng)該將原生質(zhì)體混合物置于靜止至少10分鐘以便使原生質(zhì)體沉淀于培養(yǎng)皿的底部。然后用聚乙二醇，優(yōu)選的是具有分子量為1500-6000的聚乙二醇(PEG)處理該混合物。通常，當(dāng)使用含有18.8％重量的PEG的水溶液(PFS)時可以獲得良好的結(jié)果，所述W5’與PFS的體積比是10∶1至1∶1。PFS通常包括滲透劑和鈣鹽。根據(jù)細(xì)胞的脆性，原生質(zhì)體存在于PFS中的時間為15-20分鐘。通過用含有滲透劑(例如葡萄糖)和鉀，鈉和鈣鹽的洗滌溶液(W5’)洗滌原生質(zhì)體例如三次完成融合，所述滲透劑的濃度為獲得比PFS更低的滲透壓。在16-20℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選的是18℃進(jìn)行融合程序。融合混合物中PEG的濃度隨各個連續(xù)的洗滌步驟(參見實(shí)施例6)而降低。各個洗滌步驟應(yīng)該至少進(jìn)行15分鐘以便使原生質(zhì)體緩慢適應(yīng)培養(yǎng)基的降低的滲透壓，以避免細(xì)胞的爆裂。在洗滌步驟已經(jīng)完成之后，融合的原生質(zhì)體應(yīng)該在105-106原生質(zhì)體/毫升的范圍內(nèi)。在非融合的親本原生質(zhì)體存在下或在從培養(yǎng)物中非強(qiáng)制性地選擇之后，使獲得的融合的產(chǎn)物再生。通過細(xì)胞的微操作例如根據(jù)由Patnaik等人，PlantscienceLetter24(1982)105，引入本文作為參考，進(jìn)行所述非強(qiáng)制性選擇，以便手工分離和鑒別植物的異核體。當(dāng)使用選擇方案時，親本原生質(zhì)體例如用熒光例如熒光素二乙酸鹽染色。當(dāng)將熒光素二乙酸鹽與下胚軸源點(diǎn)一起使用時，它在UV光下顯示黃色。葉的原生質(zhì)體含有在UV光下變成紅色自體熒光的葉綠體。將獲得的融合產(chǎn)物栽培于合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有平衡良好的營養(yǎng)液以供應(yīng)原生質(zhì)體生長。培養(yǎng)基含有微量和大量元素，維生素，氨基酸和小量的碳水化合物，例如各種糖例如葡萄糖。葡萄糖具有作為碳源和滲透劑的作用。培養(yǎng)基也包括植物激素(植物生長激素和細(xì)胞因子)，該培養(yǎng)基能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和幼芽再生。合適的植物生長激素的例子包括萘乙酸(NAA),2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和吲哚乙酸(IAA)。合適的細(xì)胞分裂素的例子包括苯甲基氨基比林(BAP)，玉米素(Zea)和赤霉酸(GA3)。通常NAA和2,4-D與BAP一起使用以啟動細(xì)胞分裂。植物生長激素與細(xì)胞分裂素的比例必需是高的，例如高于1。融合處理之后2-3天，所述培養(yǎng)基幾乎完全被培育培養(yǎng)基(BP)取代，所述培育培養(yǎng)基含有瓊脂糖，它包埋融合產(chǎn)物和親本原生質(zhì)體。14天之后，通過加入其它不含有或基本上不含有植物生長激素的培養(yǎng)液而稀釋植物生長激素的濃度。通常在3-4星期之后發(fā)育出星型的微小愈傷組織。然后將微小的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基以便啟動幼芽的形成，優(yōu)選的是在中間再生培養(yǎng)基中適應(yīng)之后，以便適應(yīng)培育培養(yǎng)基與再生培養(yǎng)基的組成和物理特性的不同。對于幼芽形成，再生培養(yǎng)基中植物生長激素/細(xì)胞分裂素的比例應(yīng)該是低的，例如低于1∶10。通常優(yōu)選的是將細(xì)胞分裂素Zea和BAP和植物生長激素NAA結(jié)合用于幼芽再生。再生培養(yǎng)基，BR和K3與培育培養(yǎng)基相比是相對貧乏的培養(yǎng)基。它們含有較少的維生素，碳源的含量是降低的，它們僅包括蔗糖和木糖作為碳源，不含有氨基酸。再生培養(yǎng)基也含有高于培育培養(yǎng)基的粘度。再生培養(yǎng)基Br是固體培養(yǎng)基并且含有生長調(diào)節(jié)劑2,4-D,NAA和BAP，植物生長激素/細(xì)胞分裂素的比例低于1。培養(yǎng)基K3含有Zea和GA3，也含有硝酸銀以促進(jìn)幼芽發(fā)育。在Br培養(yǎng)基上再生兩個星期之后，將直徑約3毫米的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有低濃度蔗糖的K3再生培養(yǎng)基。在該階段，幼芽在2-3星期內(nèi)發(fā)育。然后所獲得的幼芽在沒有加入其它激素的基本培養(yǎng)基例如B5上生根。然后以本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方式鑒別所獲得的植物苗的核DNA和線粒體DNA，例如使用合適的限制性核酸內(nèi)切酶并且將獲得的融合產(chǎn)物的DNA消化方式與親本細(xì)胞系進(jìn)行比較。以本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方式從相應(yīng)的植物細(xì)胞獲得在本文中用作為起始材料的甘藍(lán)原生質(zhì)體和polimaCMS甘藍(lán)植株的失活的原生質(zhì)體。根據(jù)由Glimelius,PhysiologiaPlantarum61(1984)38(引入本文作為參考)描述的方法，從綠色植株材料例如葉材料和從白色植株材料例如衰弱的幼苗獲得沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞例如原生質(zhì)體，用于再生下胚軸原生質(zhì)體。當(dāng)計劃進(jìn)行融合產(chǎn)物的非強(qiáng)制性選擇時，便于從綠色植株或從白色植株材料選擇起始材料，優(yōu)選的是將它們?nèi)旧员阌兄谶x擇。以本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方式，通過例如輻射獲得相應(yīng)于polimaCMS甘藍(lán)植株細(xì)胞或原生質(zhì)體的polimaCMS甘藍(lán)植株的失活的原生質(zhì)體。借助于γ,UV或X-射線能夠?qū)崿F(xiàn)由輻射導(dǎo)致核失活。當(dāng)用X-射線源進(jìn)行輻射時，通常核失活可以通過使用例如10krad.分鐘的劑量輻射3-20分鐘獲得。例如通過測定使原生質(zhì)體群100％致死的X-射線輻射的基本水平建立合適的X-射線劑量通過計算10-20天之后培養(yǎng)物中形成的菌落的數(shù)目評估死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。如上所述，在融合之后，異源細(xì)胞再生形成含有CMS細(xì)胞質(zhì)的甘藍(lán)植株。隨后可以將這些植株與其它的甘藍(lán)植株雜交。將會認(rèn)識到本發(fā)明的甘藍(lán)植株可以用作為起始材料，通過體外和/或雜交技術(shù)用于制備具有polimaCMS的其它甘藍(lán)品種。所述體外和雜交技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)育種者已知的。所使用的溶液包括E．融合液(PFS)18.8％PEG(MW4000)0.06MCaCl2·2H2O0.1M甘露糖醇0.025M甜素10％(v/v)DMSO</table>**參見實(shí)施例為了舉例，而不是為了任何限制，現(xiàn)在提供本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例1種子滅菌和繁殖將具有polimaCMS的甘藍(lán)長角果種子(本文命名為甘藍(lán)904005-1)浸于70％乙醇中約10秒，并且在20℃，于1.5％次氯酸鈉溶液中滅菌兩次，每次10分鐘。隨后需要用無菌蒸餾水充分浸洗。將種子置于具有3％蔗糖，沒有激素的MS培養(yǎng)基(參見表1)。為了獲得綠色無菌植株，在白天25℃和黑夜20℃的溫度下將種子在光照(8000lux)的玻璃瓶中生長，光照期為16小時。在相同的條件下在塑料容器中傳代培養(yǎng)無菌的幼芽。為了獲得用于原生質(zhì)體分離的白色組織例如下胚軸，在25℃黑暗條件下將種子生長于培養(yǎng)皿中。實(shí)施例1a導(dǎo)致產(chǎn)生904005-1的雜交904005-1是從entry編號904005中1號植株收集的種子。904005是CMSpolima892731-2和正常的可育的長角果的回交。892731-2是從entry892731的植株選擇2收集的種子。這是CMSpolima89094-2和正常的可育的長角果的回交。89094-2是從entry89094的植株選擇2收集的種子。這是CMSpolima89022和正常的可育的長角果的回交。89022-4是從entry89022的植株4收集的種子。實(shí)施例2類似于實(shí)施例1的程序，將甘藍(lán)，栽培品系DE70的種子滅菌并且繁殖。栽培品系DE70是完全可育的自交系花椰菜品系，將它用作為親本品系。但是可以使用典型的甘藍(lán)植株用于原生質(zhì)體融合。實(shí)施例3原生質(zhì)體的分離將實(shí)施例1的植物材料的四個星期大的幼芽的葉片切成小片，在25℃,gyratory搖床上，以40rpm于酶溶液中培養(yǎng)16小時。用尼龍網(wǎng)(40微米)將懸浮液過濾，用2/3體積的CPW16S溶液，通過以817rpm離心5分鐘進(jìn)行浸洗二次。這可以浮選出完整的原生質(zhì)體。收集原生質(zhì)體，用W5溶液，通過以708rpm離心5分鐘進(jìn)行浸洗。在用于融合試驗(yàn)之前將原生質(zhì)體稀釋到密度為1×105原生質(zhì)體/毫升W5溶液。實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例3的方法，分離6-8天的植物材料的下胚軸，所不同的是在酶處理期間，加入3微克/毫升的熒光素二乙酸鹽。獲得用于手選擇和用于融合頻率測定的染色的原生質(zhì)體。實(shí)施例5原生質(zhì)體的輻射將實(shí)施例3獲得的新鮮分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)于含有W5溶液(2-3毫升)的6厘米的培養(yǎng)皿中。利用X-射線(BaltographCE100)，以3500Gy的劑量輻射原生質(zhì)體20分鐘。在輻射之后，用W5溶液，通過以817rpm離心5分鐘洗滌原生質(zhì)體。在用于融合試驗(yàn)之前將原生質(zhì)體稀釋到1×105原生質(zhì)體/毫升W5溶液的密度。實(shí)施例6融合程序根據(jù)實(shí)施例4和5的原生質(zhì)體以1∶3的比例混合至總濃度為1×105原生質(zhì)體/毫升W5溶液。將三小滴100微升的混合物置于未包被的6厘米培養(yǎng)皿中，使原生質(zhì)體沉淀5-10分鐘。在三小滴的中央加入300微升的PFS溶液以誘導(dǎo)凝集15分鐘。之后，加入300微升的W5溶液到該混合物，在10分鐘之后再次加入，5分鐘之后再次加入。用兩倍的濃縮的8P溶液替代W5培養(yǎng)基，在25℃，黑暗中栽培原生質(zhì)體1-3天。實(shí)施例7在25℃，黑暗中栽培實(shí)施例6的整個融合混合物1-3天。通過以548離心5分鐘收集細(xì)胞，稀釋到濃度為每毫升兩倍濃縮的8P培養(yǎng)基為1×105原生質(zhì)體。加入等體積的用手溫?zé)岬腟PA培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于包被的培養(yǎng)皿的5小滴100微升中。加入具有喂養(yǎng)細(xì)胞的5滴100微升。2星期之后，去除具有喂養(yǎng)細(xì)胞的小滴，每個培養(yǎng)皿加入2毫升MAC培養(yǎng)基。在2星期之后，將小滴分散于固體Br培養(yǎng)基中。在2-3星期之后，將單個的菌落轉(zhuǎn)移到含有固體K3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在25℃，于低光照強(qiáng)度(2500lux)，光照18小時，培養(yǎng)微小愈傷組織。實(shí)施例18融合產(chǎn)物的選擇和生長采用顯微操作器挑起在雙倍熒光素的存在下能夠肉眼識別到的融合的細(xì)胞。以2000-5000原生質(zhì)體/微升的密度將雜種細(xì)胞培養(yǎng)于100微升的瓊脂糖小滴(1％SeaPlaque)。將小滴置于含有喂養(yǎng)細(xì)胞的液體培育培養(yǎng)系統(tǒng)(Costar-Transwellcol)中，在25℃，黑暗培養(yǎng)。在2星期之后，將小滴分散于固體Br培養(yǎng)基中。將微小愈傷組織轉(zhuǎn)移到固體K3培養(yǎng)基。在25℃，于低光照強(qiáng)度(2500lux)培養(yǎng)，光照時間為16小時。實(shí)施例9植株再生將直徑為2-5毫米大小的實(shí)施例7和8的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的K3的培養(yǎng)基，條件是正常光強(qiáng)度(8000lux),25℃，光照時間為16小時。將小幼芽轉(zhuǎn)移到具有1％蔗糖，沒有激素的B5培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)基上生根。實(shí)施例10融合產(chǎn)物的分子分析a)核DNA組成使用特定的DNA探針對融合產(chǎn)物的核DNA組成進(jìn)行定性。將含有花椰菜核DNA的820千堿基對Bgl1片段的克隆，探針ES與polimaCMS供體，甘藍(lán)繁殖系的核DNA的核酸內(nèi)切酶消化方式的各個譜帶進(jìn)行雜交，所述甘藍(lán)繁殖系用作為CMS性狀的受體(參見附圖1)。b)線粒體DNA的組成用CMSBras4的DNA，含有花椰菜線粒體DNA的1950堿基對BglⅡ片段的克隆，進(jìn)行定性。該克隆產(chǎn)生具有CMSpolima線粒體DNA的4千堿基對的譜帶和具有來自于受體繁殖系例如DE70的線粒體DNA的6千堿基對的譜帶(參見附圖2)。通過利用引物94RSO1和94RSO2，將500堿基對的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增也可以實(shí)現(xiàn)定性。向前引物94RSO1的序列是5’-GAACCAACTGCTTTCACACCG-3’和反向引物94RSO2的序列是5’-CTTGGCTCTCTGCGAATGTC-3’。該500堿基對的片段是從CMSpolima線粒體DNA擴(kuò)增的，而不是從受體品系例如DE70的線粒體DNA擴(kuò)增的。實(shí)施例11胚挽救通常在進(jìn)行雜交之后18-19天進(jìn)行胚挽救。為了實(shí)現(xiàn)胚挽救，需要長角果。所需要的長角果是那些具有盡可能大的具有尚未變硬的種子被膜的胚的長角果。在取出胚之前，首先長角果必需是沒有污染的。通過將其置于10％氯化物溶液例如氯化鈉或氯化鉀中20分鐘對長角果進(jìn)行消毒。以2，5和10分鐘將長角果在無菌水中浸洗三次。通過將長角果縱向切開，取出正在發(fā)育的種子，然后在顯微鏡下制備脫離種子的胚而挽救胚。在從種子中取出胚之后，將其置于合適的生長培養(yǎng)基中。能夠使用任何促進(jìn)胚生長的培養(yǎng)基。例如能夠使用具有3&amp;蔗糖和0.4毫克/升硫胺素和0.2毫克/升的IDA的MS培養(yǎng)基。實(shí)施例12在高溫和低溫時保持CMS甘藍(lán)植株的不育為了測定含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株在高溫和低溫時是否保持不育，將長角果栽培品系915095,915107,915100和915144與紅甘藍(lán)雜交檢查其是否獲得100％的雜交。栽培品系915095-915144與紅甘藍(lán)進(jìn)行雜交。當(dāng)這些栽培品系的種子與正常的長角果保持系授粉，并且將其播種時，幼苗的下胚軸顏色和葉的顏色正常是綠色。如果這些栽培品系與紅甘藍(lán)雜交，那么雜種種子是中間體，并且幼苗顯示強(qiáng)authocyan(紫色)表達(dá)，而自交系保持綠色。將915095,915107,915100和915144的種子播種，將各個栽培品系的20個植株與紅甘藍(lán)植株一起置于塑料覆蓋的隔離罩中。在夏天，隔離罩的溫度在一天中從15-40℃之間變化。隔離罩的溫度每周記錄一次。將從915095,915107,915100和915144收集的種子的樣品播種，所有獲得的植株是雜種，表明沒有存在自交和沒有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)滲漏。任何時候任何植株不會產(chǎn)生部分雄性不育。導(dǎo)致產(chǎn)生915095,915107,915100和915144的雜交顯示如下。當(dāng)一個雜交(即88132×bc)產(chǎn)生2或3個箭頭時，那么每個箭頭代表與不同的長角果基因型的一次雜交。實(shí)施例13雌性可育下面列出的是在CMS“polima”類型與長角果用手雜交之后獲得的種子產(chǎn)量的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示CMS“polima”的種子產(chǎn)量高于長角果自交系。這是因?yàn)橹貜?fù)自交影響了可育性。在長角果F1’s和CMSOgura之間的雜交可以進(jìn)行更好的比較。結(jié)果顯示CMSpolima的種子產(chǎn)量是在相同于其它兩種類型的雜交的范圍內(nèi)。長角果種子產(chǎn)量1991-1994(用手授粉)年雜交類型每次雜交的種子數(shù)1991(CMSpolima×長角果)F1114(n=4)(長角果自交系×長角果)F164(n=23)(長角果F1×長角果)F1116(n=45)1992(CMSpolima×長角果)F1146(n=66)(長角果自交系×長角果)F1100(n=76)(長角果F1×長角果)F1135(n=28)(CMSOguar×長角果)F1140(n=32)1993(CMSpolima×長角果)F179(n=41)(長角果自交系×長角果)F153(n=70)(長角果F1×長角果)F180(n=35)(CMSOguar×長角果)F1144(n=5)1994(CMSpolima×長角果)F193(n=9)(長角果自交系×長角果)F147(n=50)(長角果F1×長角果)F184(n=35)(CMSOguar×長角果)F174(n=9)重量平均值(CMSpolima×長角果)F1115(n=120)(長角果自交系×長角果)F160(n=227)(長角果F1×長角果)F1103(n=143)(CMSOguar×長角果)F1(127)(n=40)雖然已經(jīng)結(jié)合特定的和優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是將會明白對其進(jìn)行修飾不會脫離本發(fā)明的范圍。下面的權(quán)利要求是為了覆蓋通常遵守其原則的所有的變異，發(fā)明的應(yīng)用或變化，并且包括在大田中進(jìn)行有關(guān)本發(fā)明的已知的或慣常的實(shí)踐產(chǎn)生的背離所公開的內(nèi)容的情況，或?qū)Ρ绢I(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯而易見的情況。權(quán)利要求1．用于生產(chǎn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植物的方法，所述植物在高溫和低溫下不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，該方法包括下列步驟a)將Brassicacampestris栽培品系87110和甘藍(lán)栽培品系87101進(jìn)行雜交，和收集所述雜交產(chǎn)生的種子；b)將所述種子再生為油菜植株，它含有單套染色體；c)使步驟b)植株的染色體加倍，以提供含有雙套染色體的油菜；d)將Brassicacampestris栽培品系87118和甘藍(lán)栽培品系87101進(jìn)行雜交，和收集所述作物產(chǎn)生的種子；e)將所述種子再生為油菜植株，它含有單套染色體；f)使步驟e)植株的染色體加倍，以提供含有雙套染色體的油菜；g)將步驟f)植株和油菜栽培品系87102進(jìn)行雜交，和收集所述雜交產(chǎn)生的種子，所述油菜是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)；h)將所述植株再生為油菜植株，它含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)；i)使步驟c)植株與步驟h)植株進(jìn)行雜交，和收集所述雜交產(chǎn)生的種子；j)將所述植株再生為油菜植株，它是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)；k)將步驟j)植株和甘藍(lán)栽培品系進(jìn)行雜交，和收集所述雜交產(chǎn)生的種子；1)從種子取出胚，使所述胚再生為植株，該植株是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)；m)將步驟1)的植株與甘藍(lán)栽培品系回交，收集從所述回交產(chǎn)生的種子；n)從種子取出胚，使所述胚再生為F1植株，該植株是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)；p)將步驟n)的植株與甘藍(lán)栽培品系回交，收集從所述回交產(chǎn)生的種子；以及q)使所述種子再生為甘藍(lán)植株，該植株是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將步驟q)的植株與甘藍(lán)雜交；收集所述雜交產(chǎn)生的種子；以及使所述種子再生為甘藍(lán)植株，該植株是雄性不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中植株選自于下列組花椰菜，包子甘藍(lán)，甘藍(lán)，羽衣甘藍(lán)，球莖甘藍(lán)和長角果。4．用于生產(chǎn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植株的方法，所述植物在高溫和低溫下不育，并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，該方法包括下列步驟a)將權(quán)利要求1所述的方法制備的雄性不育甘藍(lán)的原生質(zhì)體融合，所述甘藍(lán)含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)，在高溫和低溫下保持不育；和b)將獲得的異源細(xì)胞再生為含有polima細(xì)胞質(zhì)的CMS甘藍(lán)植株。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中甘藍(lán)選自于下列組花椰菜，包子甘藍(lán)，甘藍(lán)，羽衣甘藍(lán)，球莖甘藍(lán)和長角果。6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，進(jìn)一步包括將含有polima細(xì)胞質(zhì)的再生的CMS甘藍(lán)與含有商業(yè)上所需的特性的甘藍(lán)植株雜交的步驟。7．由權(quán)利要求1的方法獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植株，它在高溫和低溫下保持不育并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。8．由權(quán)利要求4的方法獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育甘藍(lán)植株，它在高溫和低溫下保持不育并且含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)。9．根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的植株，其中植株選自于下列組花椰菜，包子甘藍(lán)，甘藍(lán)，羽衣甘藍(lán)，球莖甘藍(lán)和長角果。全文摘要本發(fā)明涉及含有polimaCMS細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的甘藍(lán)植物。采用傳統(tǒng)的育種技術(shù)能夠制備本發(fā)明的甘藍(lán)植物。然后利用這些植物,通過使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)或通過原生質(zhì)體融合能夠生產(chǎn)不同的甘藍(lán)類型。文檔編號A01H1/04GK1209724SQ95197954公開日1999年3月3日申請日期1995年9月11日優(yōu)先權(quán)日1995年9月11日發(fā)明者安妮瑪麗·埃爾森格-布爾斯馬,弗朗西斯卡斯·赫拉德斯·雅各布斯·瑪麗亞·范登博施申請人:佩托希德公司