專利名稱：血小板抗低溫激活的穩(wěn)定作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液及血液成份領(lǐng)域，特別涉及血小板的功能和用途。具體說，本發(fā)明涉及血小板在貯存過程中的激活問題，并闡述了對不符合要求的激活作用和細(xì)菌感染必須加以控制。
背景技術(shù)：
血液中的小板或血小板是人血液中的一個成分。它們對止血起著重要的作用。血小板形狀通常為卵圓形至球狀，直徑為2-4μm，且含有大約60％蛋白質(zhì)、15％脂質(zhì)、和8.5％碳水化合物。血小板的化學(xué)組成包括血清素、腎上腺素、和去甲腎上腺素，每一種都在促進(jìn)損傷部位血管的構(gòu)造中起作用。血小板也包含一些血小板因子，包括血小板促凝血酶原激酶(這是一種腦磷脂型磷脂)和二磷酸腺苷，兩者在血凝固作用中都很重要。維持血小板功能對于血庫貯存中保存全血以及對保存濃縮的血小板成分是很重要的。
但是貯存血小板存在著一些問題。雖然用長期冷藏的辦法來保持血液成分是能做到的，但血小板有低溫激活的趨向，因而失去它的用途。為避免激活，可將血小板分成各個濃縮成分，在20℃下貯存。但這樣又帶來其它危險，即細(xì)菌感染以及發(fā)生代謝和酶反應(yīng)，總稱為“血小板貯存損害”。因而，血小板貯存一般僅限于5天。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過用已知為抗凍蛋白和抗凍糖蛋白的蛋白質(zhì)處理血小板，可使血小板在足以控制細(xì)菌感染和血小板貯存損害的低溫下長期貯存而沒有早期激活的危險。目前有多種容易的處理方法，包括將血小板懸浮于所述蛋白質(zhì)可溶解的液體溶液中使血小板可以在該條件下保存直到使用。因此降低了需要周期性更新血小板貯存的供應(yīng)量，而周期性更新是滿足各種要求中的一個難題。
為證明本發(fā)明而進(jìn)行的試驗(yàn)表明，抗凍糖蛋白所達(dá)到的保護(hù)效果隨所使用的抗凍糖蛋白的量而變化。試驗(yàn)也表明具有較高分子量的抗凍糖蛋白與具有相對低分子量的抗凍糖蛋白相比在給定的濃度下具有更大的保護(hù)效果。
根據(jù)下面的說明，本發(fā)明的上述及其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會更清楚。
附圖簡述


圖1是由付立葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)繪制的圖，表明人的血小板從凝膠至液晶相的轉(zhuǎn)變。
圖2表明如
圖1的相同數(shù)據(jù)，加上血小板激活百分率作為溫度的函數(shù)所繪制的圖。
圖3是血小板激活百分率作為溫度函數(shù)的曲線圖，用和不用本發(fā)明處理的兩種情況。
圖4a是血小板激活百分率作為溫度函數(shù)的曲線圖，有和沒有本發(fā)明處理的兩種情況，包括不同程度的處理。
圖4b是在兩種溫度下，根據(jù)本發(fā)明處理的血小板的激活百分率作為處理試劑濃度函數(shù)的曲線圖。
圖5是由付立葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)繪制的圖，表明與
圖1相同的數(shù)據(jù)以及根據(jù)本發(fā)明處理的血小板的數(shù)據(jù)。
圖6是熒光激活細(xì)胞分類數(shù)據(jù)的曲線圖，表明標(biāo)記蛋白從處理的和未處理的血小板中分泌的百分率。
圖7是熒光激活的細(xì)胞分類數(shù)據(jù)的另一種曲線圖，表明標(biāo)記蛋白分泌百分率作為處理試劑濃度的函數(shù)。
發(fā)明的詳細(xì)說明和優(yōu)選的實(shí)施方案自然界存在的稱之謂“抗凍蛋白”、“熱滯蛋白”、“抗凍糖蛋白”、和“抗凍多肽”的大分子物種是公知的，在文獻(xiàn)中已有廣泛報導(dǎo)。例如抗凍糖蛋白的發(fā)現(xiàn)首先由Devries,A.L.等人報導(dǎo)，“南極魚的抗冷凍作用”(KreezingResistance in Some Antarctic Fishes)，《科學(xué)》(Science)163:1073-1075(1969年3月7日)。Devries等觀察到各種不同種類的魚在全年平均溫度為-1.87℃的水中存活，盡管其血液中沒有足夠量的氯化鈉和其它低分子量物質(zhì)通過常規(guī)冰點(diǎn)降低法來降低其冰點(diǎn)。Devries等人將這些物種的生存歸因于存在某些糖基化蛋白，其分子量范圍大約2500至大約34000，稱為抗凍糖蛋白或“AFGPs”。進(jìn)一步的調(diào)查揭示北溫帶和北極魚的很多物種其血液中攜帶有抗凍物質(zhì)，其中一些化合物是糖蛋白而其它一些則沒有糖基，因而被稱為抗凍多肽或抗凍蛋白(“AFPs”)，分子量范圍大約3300至大約12000。進(jìn)一步說，盡管這些化合物降低了冰點(diǎn)，但熔點(diǎn)不受影響，因此稱為“熱滯蛋白”。
抗凍蛋白和糖蛋白已從很多不同來源中分離得到，而且文獻(xiàn)中已廣泛報導(dǎo)過這些來源和從中得到的各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這些來源包括魚類和非魚類，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ。
表Ⅰ魚類中的熱滯蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)類型，組成和大小 魚類來源 魚種俗名抗凍糖蛋白(AFGPs): 南極魚科含有丙氨酸、蘇氨酸和 Pagothenia borchgrevinkiGal-GalNAC二糖Trematomus borchgrevinki南極鱈魚M.W.:2,600-33,700 Trematomus bernachiiDissostichus mawsoni北方海洋鱈類魚Gadus agac 格陵蘭鱈Gadus morhua 大西洋鱈Microgadus tomcod 大西洋小鱈Boreogadus saida 北極鱈Eligenus gracilis 遠(yuǎn)東寬突鱈抗凍多肽(AFPs),Ⅰ型 右眼鰈富含丙氨酸； Pseudopleuronectus 美洲擬鰈M.W.:3,300-6,000 americanus
Limanda ferrugmea 美洲黃蓋鰈杜父魚科Myoxycephalus scorpius短角鋸鲉Myoxycephalus aenaeus 虻瘡鋸鲉Myoxycephalus scorpiodes 北極鋸鲉抗凍多肽(AFPs),Ⅱ型 杜父魚科富含半胱氨酸 Hemitripterus americanus 美洲絨杜父魚同源于C型血凝素 Osmerus mordex胡瓜魚M.W:14,000-16,000 Clupea harengus harengus 鯡抗凍多肽(AFPs),Ⅲ型 綿鳚沒有半胱氨酸且不富含丙氨酸Macrozoarce americanus海洋條鱈M.W:5,000-6,700 Rhipophila dearborni 南極綿鳚Lycodes polaris 北極綿鳚表Ⅱ熱滯蛋白質(zhì)的非魚類來源A．除甲蟲之外的昆蟲目 種彈尾目 7 sPP.
翅目Arcynopteryx compacta直翅目Parcoblata pennsylvanica(異翅木蠊)半翅目Oncopeltus fasciatus(美洲脊胸長蝽)長翅目Boreus westwoodi鱗翅目Choristoneura fumiferana(樅色卷蛾)B．鞘翅目(甲蟲)科 種擬步甲科 Tenebrio molitor(黃粉蟲)Meracantha contractaUloma impressaPlatydema sp.
叩頭蟲科 Ampedus lineatusAmpedus sp.
Lepidotus discoideusMelanotus sp.(梳爪叩頭蟲)扁甲科Cucujus clavipes(扁甲蟲)赤翅甲科 Dendroides canadensis螢科 Photinus sp.(廣額螳螂)瓢蟲科Coccinella novemnotata(九星瓢蟲)棘脛小蠹科Ips acuminalus(松六齒小蠹)天?？芌hagium inquisitor(松皮天牛)C．非昆蟲 節(jié)肢動物動物 種蜘蛛 Philodromus sp.(逍遙蛛屬)Clubiona sp.(管巢蛛屬)
Bolyphantes index蜈蚣 Lithobius forficatus蜱螨 Alaskozetes antarcticusD．其它無脊椎動物短齒蛤?qū)? Mytilus edulis被最為廣泛研究，且被作為優(yōu)選蛋白用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是那些從魚類分離出來的蛋白質(zhì)。如表Ⅰ所表明的，這些蛋白質(zhì)包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者分為三個一般類型，命名為Ⅰ型，Ⅱ型，和Ⅲ型。
盡管存在著各種變化，一般情況下AFGPs由一系列的三肽重復(fù)單元丙氨酰-蘇氨酰-丙氨酰組成。同時雙糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙?；?D一半乳糖胺與蘇氨酸殘基的羥基連接。例如較小分子量的AFGP含有分別用脯氨酸和精氨酸殘基替代一些丙氨酸和蘇氨酸殘基。對有代表性魚種的AFGPs色譜研究已揭示出八個主要組分(片段)的分子量，如表Ⅲ所示。
表Ⅲ從Pagothenia borchgrevinki得到的AFGPs分子量組成片段編號 分子量133,700228,800321,500417,000510,50067,90073,50082,600與AFGPs相比，AFPs互相之間的差別更大。如表Ⅰ所示，三種類型AFPs其殘基含量相互都不同。Ⅰ型AFPs富含丙氨酸殘基(大約65％)，其余大部分由極性殘基如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸組成，分子量范圍大約3,300至大約6,000。Ⅱ型AFPs被認(rèn)為是富含半胱氨酸(實(shí)際上是半-半胱氨酸)殘基，并且與C型植物凝血素同源。來自美洲絨杜父魚的Ⅱ型AFPs含有7.6％半胱氨酸、14.4％丙氨酸、19％總量的天冬氨酸和谷氨酸、以及8％蘇氨酸，分子量范圍是大約14,000至大約16,000。Ⅲ型AFPs沒有半胱氨酸殘基，并且也不富含丙氨酸殘基。任何特定的氨基酸顯然都不存在明顯的優(yōu)勢，氨基酸含量可在極性和非極性殘基之間均勻分配。其分子量范圍是大約5,000至大約6,700。此段中所有百分比均以摩爾為基礎(chǔ)。
來自昆蟲的抗凍蛋白主要是Ⅱ型AFPs，氨基酸殘基的典型組成是那些來自鱗翅目(云杉芽蟲)和擬步甲科(甲蟲)的氨基酸殘基。這些列于表Ⅳ，且Ⅳ也包括美洲絨杜父魚的氨基酸組成作為比較。
表ⅣⅡ型AFPs氨基酸成分的比較氨基酸殘基 云杉芽蟲組分Ⅱ 甲蟲 美洲絨杜父魚Asx9.5 5.3 10.7Thr6.0 2.3 7.9Ser13.0 11.1 8.2Pro5.0 0.0 6.7Glx11.0 12.4 9.1Gly15.0 11.4 8.1Ala8.0 5.0 14.41/2-Cys6.0 28.0 7.6Val3.0 2.3 1.2Met0.0 0.0 5.4Ile1.2 1.0 1.7Leu6.5 2.2 6.2Tyr1.0 0.0 1.2Phe2.2 0.0 2.0Lys3.1 15.4 2.1His0.0 3.1 2.5Trp0.00.02.8Arg8.00.02.3抗凍蛋白和糖蛋白可以通過常規(guī)方法從魚或昆蟲的血清或其它體液中提取。蛋白質(zhì)的分離和純化容易通過色譜法進(jìn)行，并且通過吸附、沉淀和蒸發(fā)。文獻(xiàn)中所公開的其它很多方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
熱滯蛋白也可以合成，或者通過常規(guī)化學(xué)合成手段，或者通過重組DNA的方法。形成這些蛋白質(zhì)的基因其DNA編碼序列已被闡明并已有廣泛報導(dǎo)。例如參見Devries,A.L.等人的《生物化學(xué)》(J.Biol.chem.),246:305(1971)；Lin,Y.,等人的《生物化學(xué)與生物物理研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang,D S.C.,等人的《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y.,《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl Acad.Sci.U.SA.)78:2825(1981)；Davies,P.L.,等《生物化學(xué)》79:335(1982)；Goarlie,B.，等《生物化學(xué)》259:14960(1984)；Scott,G.K.,等的《加拿大魚類水生動物科學(xué)雜志》(Can.J.Fish.Aguat.Sci.)43:1028(1986)；Scott,G.K.等《分子學(xué)進(jìn)展》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。將AFP基因成功地微量注射到非本種的其它物種也已有報導(dǎo)。參見，例如Zhu,Z.,等Angew.Ichthyol.1:31(1985)；Chourrout,D.等《水培技術(shù)》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman,R.A.,等的《美國魚類科學(xué)學(xué)報》(Trans.Am.Fish.Soc.)116:87(1987)；Fletcher,G.L.,等的《加拿大魚類水生動物科學(xué)雜志》45:352(1988)；Mac Lean,N.D.,等的《生物技術(shù)》(Bio Technology)5:257(1987)；Stuart,G.W.,等《發(fā)展》(Development)103:403(1988)；Mc Evoy,T.，等《水培技術(shù)》68:27(1988)；Ozato,K,等《細(xì)胞分化》(Cell Differ)19:237(1986)。
血小板可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)分離和濃縮，如那些計數(shù)血小板用的方法用來分離血小板。根據(jù)這種技術(shù)，將血液收集于抗凝劑中，然后在制備富含血小板的上清液所選用的速度下離心。通過回收上清液，接著再進(jìn)一步離心，可進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮。其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本發(fā)明用抗凍蛋白和糖蛋白處理血小板的方法是將血小板作為處理試劑在水溶液中的懸浮液進(jìn)行溫育。血小板成分是懸浮液的大約0.1mg/ml至大約1.0mg/ml，抗凍蛋白或糖蛋白的存在量優(yōu)選為該懸浮液的大約0.1mg/ml至大約30mg/ml，更優(yōu)選從大約0.5mg/ml至大約20mg/ml，最優(yōu)選從大約0.5mg/ml至大約10mg/ml。該溫育是在足夠低的溫度下進(jìn)行以避免血小板被抗凍化合物激活，注意這些化合物在37℃有激活血小板的趨向。因此在這一溫度或更高溫度下生成的血小板在加入抗凍化合物之前要冷卻到室溫。
溫育后，血小板可以保持在懸浮液中并冷卻到低于20℃的溫度直到使用前，或者在進(jìn)一步濃縮或從懸浮液中回收后冷卻。如果需要，可以將血小板冷卻到或低于血小板經(jīng)歷自液晶相至凝膠相轉(zhuǎn)變的熱致相變溫度。對于人血小板，該溫度是大約17℃。為貯存目的優(yōu)選的溫度范圍是大約1℃至大約10℃，最典型的貯存條件是大約1℃至大約6℃。當(dāng)血小板需在臨床使用時，最為優(yōu)選的是在使用前立即用緩沖液在37℃將冷的樣品稀釋大約10倍而快速溫?zé)帷Ｓ每箖龅鞍谆蛱堑鞍滋幚硌“暹_(dá)到同等結(jié)果的其它方法對于血小板處理領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
下面的實(shí)施例是為了詳細(xì)說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例通過不用真空的靜脈抽取方法將人血采集到檸檬酸葡萄糖緩沖液(55mM檸檬酸、110mM檸檬酸鈉、170mM葡萄糖)中。通過細(xì)心的離心，將富血小板血漿從緩沖液稀釋的血液中提取出來。并用下面的溶液將血小板沖洗兩次100mMNaCl10mM KCl10mM EGTA(乙二醇雙(β-氨基乙醚)N,N,N′,N′-四乙酸)10mM咪唑pH=6.8通過付立葉變換紅外光譜，用對稱的CH2伸張頻率對溫度作圖，測定血小板膜的相轉(zhuǎn)變。制出的圖見
圖1。在17℃出現(xiàn)頻率位移的中間點(diǎn)，是該膜由凝膠至液晶相的轉(zhuǎn)變溫度。因?yàn)樵摐囟日脤?yīng)于人血小板去穩(wěn)定化的溫度，這證明去穩(wěn)定化作用是因?yàn)榻?jīng)過了相轉(zhuǎn)變而引起的。
最初用形態(tài)學(xué)檢定來測定血小板激活作為溫度的函數(shù)。沖洗過的血小板在各種溫度下溫育1小時。然后用Karnovsky′s固定劑固定過夜并用Zeiss光學(xué)顯微鏡計數(shù)，使用100x物鏡的Nomarski光學(xué)儀器。每一溫育溫度計數(shù)的血小板共計250個。如果血小板是球狀的，或者有兩個或多個假足，則它們被認(rèn)為是“激活的”。如果血小板是盤狀的并且有零至一個假足，則它們被認(rèn)為是“靜止”的。激活百分率對溫度的制圖見圖2，其中圓點(diǎn)(●)代表激活百分率，而倒三角()是重復(fù)
圖1的數(shù)據(jù)。激活作用曲線證明激活百分率隨溫育溫度的降低而增加。該圖也表明激活作用增加最為陡峭處的溫度是血小板膜相轉(zhuǎn)變發(fā)生時的同一溫度。
為了試驗(yàn)抗凍蛋白和糖蛋白對血小板激活的影響，用來自Trematomusbernachii的組分2-6和5-7混合的AFGP和來自Pseuclopleur Dnectusamericanus的AFPⅠ型進(jìn)行試驗(yàn)。血小板以5×107個血小板/ml懸浮液的密度懸浮于抗凍化合物溶液中，在0℃至40℃的溫度范圍下，在抗凍化合物存在的濃度為每ml懸浮液有1至4mg化合物的條件下溫育1小時，同時進(jìn)行沒有抗凍化合物的平行試驗(yàn)。
混合組分AFGP2-6的結(jié)果見圖3，其中倒三角()代表用抗凍化合物進(jìn)行的試驗(yàn)，圓點(diǎn)(●)代表沒有用任何抗凍化合物進(jìn)行的試驗(yàn)。該圖表明在5℃的溫育溫度下，AFGP 2-6的激活程度降低43％。
在5℃下不同抗凍化合物之間的比較見下面的表Ⅰ。
表Ⅰ在5℃溫育1小時后抗凍化合物對血小板激活百分率的影響血小板激活百分率試驗(yàn)化合物 濃度(mg/ml) 用試驗(yàn)化合物處理 未處理 保護(hù)百分率AFGP 2-6 1 37 80 43AFGP 5-7 1 48 65 17AFGP 5-7 4 34 65 31AFP Ⅰ1 44 69 25圖4a和4b說明保護(hù)作用隨著抗凍化合物濃度增加的變化。在圖4a中，在不同濃度下使用合并的成分AFGP 5-7，在5℃至37℃的溫度范圍溫育1小時。圖中的實(shí)心圓圈(●)代表在沒有抗凍化合物情況下進(jìn)行的對照試驗(yàn)，空方框(□)代表在0.2mg/ml濃度下進(jìn)行的試驗(yàn)，實(shí)方框(■)代表在0.5mg/ml濃度下進(jìn)行的試驗(yàn)，空心圓圈(○)代表在1mg/ml下進(jìn)行的試驗(yàn)，空三角(△)代表在2mg/ml下進(jìn)行的試驗(yàn)，實(shí)三角()代表在4mg/ml進(jìn)行的試驗(yàn)。圖4a中的數(shù)據(jù)表明，低于20℃時，隨著AFGP濃度的增加，血小板激活百分率降低。圖4b給出在5℃和15℃溫育下劑量應(yīng)答曲線表示的相類似數(shù)據(jù)。這些曲線表明，在這兩種溫度下，抗凍化合物濃度的增加導(dǎo)致激活百分率的降低，這意味著血小板保護(hù)百分率的增加。
為檢測在正常激活條件下抗凍化合物實(shí)際上是否干擾血小板激活作用，將血小板在5℃下溫育1小時后再升至37℃，在此溫度測試到它們對凝血酶的激活反應(yīng)。已經(jīng)在1mg/ml AFGP5-7存在下溫育過的血小板具有96％激活作用，而在相同溫度下沒有AFGPs條件下溫育的血小板具有97％激活，差異不明顯。結(jié)論是根據(jù)生態(tài)學(xué)試驗(yàn)的測定，AFPGs不干擾生理激活的級聯(lián)系統(tǒng)。
為了證明抗凍蛋白對降低膜的相轉(zhuǎn)變溫度不起作用，用付立葉變換紅外光譜測定存在AFGPs(2mg/ml AFGP5-7)和其不存在時的相轉(zhuǎn)變溫度。對稱CH2伸張頻率對溫度的關(guān)系(即和
圖1所獲數(shù)據(jù)的相同方式)見圖5。這兩條曲線表明它們沒有明顯區(qū)別，證明AFGPs不改變相轉(zhuǎn)變溫度。
上面的實(shí)驗(yàn)詳細(xì)地說明了在冷凍過程中AFGPs對形態(tài)變化的急性影響。為研究在低于脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變溫度下血小板貯存過程中更細(xì)微的變化，使用了伴隨激活作用的分泌標(biāo)記。選擇的標(biāo)記是α-顆粒蛋白質(zhì)，gp53。該蛋白質(zhì)通常是在血小板胞質(zhì)中膜結(jié)合的小泡中，但在激活過程中分泌到細(xì)胞表面。在一系列實(shí)驗(yàn)中，用Immunotech,Inc.(Westbrook,Maine USA)出售的對gp 53的熒光抗體檢測到細(xì)胞表面存在該蛋白。通過熒光激活細(xì)胞分類檢測熒光抗體與分泌的gp 53之間的相互作用。
圖6給出分泌的標(biāo)記物的百分?jǐn)?shù)對形成血小板之后在5℃下溫育天數(shù)的函數(shù)。在該圖中，用來自Trematomus bernachii的AFGP混合成分5-7處理血小板，用空心方框(□)代表，其與用實(shí)心圓圈(●)所代表的沒有用抗凍化合物處理的對照血小板相比較。這些數(shù)據(jù)表明兩個體系中大約15％的血小板顯示冷卻后立即有g(shù)p53的分泌，其值只稍高于冷卻前血小板所見到的值。在5℃保持7天后，將近50％的對照血小板顯示出激活作用，而處理過的血小板保持在最初值15％。為實(shí)現(xiàn)該穩(wěn)定化作用，將冷卻的血小板很快進(jìn)行回溫。該回溫是將冷卻的血小板稀釋到37℃的比較大體積(是貯存體積的10倍)的緩沖液中。這使血小板通過脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變而快速溫?zé)幔⑶乙蚕♂屃薃FGPs。
AFGPs的保護(hù)作用隨著AFGP濃度而變化，這一點(diǎn)可從圖7表明。圖7是上面所使用的AFGP5-7相同組分在5℃貯存4天接著快速升溫至37℃而得的。在1.5mg/ml的AFGP濃度時，分泌減少到大約5％。AFPGs對gp53分泌的影響在各個供體之間有明顯的不同，但在所研究的每一種情況下，定性結(jié)果是相同的。
以上的闡述主要為詳細(xì)說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，這里所述的蛋白質(zhì)、配比、處理方法以及本發(fā)明的其它參數(shù)的選擇是可以作多種方式的改變或替代的，而并不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。
權(quán)利要求
1．一種處理血小板使其在低于20℃的溫度下自發(fā)激活發(fā)生率減少的方法，所述方法包括使所述血小板與能使其激活量減少的一種或幾種熱滯蛋白相接觸而將所述熱滯蛋白合并到所述的生物物質(zhì)中。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或幾種熱滯蛋白是具有熱滯蛋白分子結(jié)構(gòu)的從極地魚類中分離并純化出的蛋白質(zhì)。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述極地魚種選自南極的類南極魚科、北方海洋鱈類魚、右眼鰈、杜父魚科、和綿鳚。
4．權(quán)利要求1的方法，其中一種或幾種熱滯蛋白選自(a)抗凍糖蛋白，從以下這些魚類分離和純化，該魚選自Pagotheniaborchgrevinki、Trematomus borchgrevinki、Trematomus bernachii、和Dissostichus mawsoni；(b)Ⅰ型抗凍多肽，從選自Pseu dopleuronectus americanus和Limandaferrugmea魚中分離并純化；(c)Ⅱ型抗凍多肽，從Hemitripterus americanus魚中分離和純化；和(d)Ⅲ型抗凍多肽，從選自Macrozoarces americanus、Rbigophiladearborni和Lycodes polaris魚中分離和純化。
5．權(quán)利要求1的方法，其中一種或幾種熱滯蛋白選自(a)抗凍糖蛋白，從選自Dissostichus mawsoni和Trematomus bernachii魚中分離和純化；(b)Ⅰ型抗凍多肽，從Pseadopleuronectus americanus魚中分離和純化；(c)Ⅱ型抗凍多肽，從Hemitripterus americanus魚中分離和純化；和(d)Ⅲ型抗凍多肽，從Macrozoarces americanus魚中分離和純化；
6．權(quán)利要求1的方法，其中一種或幾種熱滯蛋白是抗凍糖蛋白。
7．權(quán)利要求1的方法，其中一種或幾種熱滯蛋白是抗凍糖蛋白組分2至6。
8．權(quán)利要求1的方法，其中包括將所述血小板與所述熱滯蛋白水溶液一起溫育，生成所述血小板的水混懸液。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述熱滯蛋白包括大約0.1mg/ml至大約30mg/ml的所述混懸液。
10．權(quán)利要求8的方法，其中所述熱滯蛋白包括大約0.5mg/ml至大約20mg/ml的所述混懸液。
全文摘要
通過用熱滯蛋白處理血小板使其在通常用于血液貯存的低溫下發(fā)生的自發(fā)激活作用減少或排除。優(yōu)選的熱滯蛋白是來自極地魚種的抗凍蛋白和抗凍糖蛋白,而且已發(fā)現(xiàn)抗凍糖蛋白色譜組分No.2—6特別有效。
文檔編號A01N1/02GK1220696SQ95197246
公開日1999年6月23日 申請日期1995年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月5日
發(fā)明者弗恩·泰伯林, 約翰·H·克羅, 安·E·奧利弗, 莉薩·M·海斯, 洛伊絲·M·克羅, 羅伯特·E·菲尼 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會