專利名稱：西紅柿果實啟動子的制作方法
遺傳工程的最新進展為轉(zhuǎn)化植物使其獲得外源基因提供了必要工具?，F(xiàn)已有可能生產(chǎn)出具有獨特農(nóng)藝和作物加工價值的植物。通過選擇被稱為啟動子的一段開啟基因的調(diào)節(jié)序列，就能選擇表達這類外源基因的組織和植物生長期中外源基因表達的時間?，F(xiàn)已知道許多適于不同植物、植物組織和發(fā)育階段的啟動子。
西紅柿是用于遺傳工程的十分重要的植物。它易于被轉(zhuǎn)化以表達外源基因。它還有許多特點，已知這些特點可以被某些基因所改良。在許多國家，它也是一種有價值的作物。在美國，它是第一種被批準(zhǔn)供應(yīng)上市的轉(zhuǎn)基因食用作物。
可用于在西紅柿和其他果實中表達外源基因的啟動子是已知的。例如，美國專利4,943,674(Houck等，1990年7月24日，在此引入作為參考)公開了2A11啟動子，它可用于在西紅柿果實中表達異源基因。已知E4和E8啟動子(Deikman等(1988)，The EMBO Journal，73315-3320)以及多聚半乳糖醛酸酶的啟動子具有果實特異性。然而人們?nèi)孕枰渌麖姷?，可以引起西紅柿果實中基因表達的啟動子，特別是那些在果實生長和成熟過程中具有不同表達模式的啟動子。
本發(fā)明的一個目的是提供在西紅柿中以果實特異性方式起作用的啟動子。本發(fā)明的進一步的目的是提供含有這些啟動子，編碼所需蛋白的基因，或?qū)铣傻鞍子泄惨种谱饔玫挠糜谪撜{(diào)節(jié)(down-regulating)蛋白或有義序列表達的反義序列的西紅柿植物細胞和植株。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供這樣一種方法，通過應(yīng)用從馬鈴薯中分離到的啟動子得到在西紅柿中以果實增強方式進行的蛋白表達。這些啟動子在西紅柿中的功能已被意外地發(fā)現(xiàn)是使所需蛋白及反義mRNA得到高水平表達。
本發(fā)明還提供經(jīng)過轉(zhuǎn)化的西紅柿植物細胞，細胞中含有重組子雙鏈DNA分子，其包含下述序列(a)選自馬鈴薯糖蛋白(patatm)啟動子、馬鈴薯ADPGPP啟動子和馬鈴薯顆粒束縛淀粉合成酶啟動子的啟動子；(b)能導(dǎo)致RNA序列產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)DNA序列；
(c)一個3′非翻譯區(qū)，它在植物細胞中的功能是使轉(zhuǎn)錄終止并將多聚腺苷酸加到RNA序列的3′端。
其中所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)DNA是異源的。本發(fā)明還提供含有這種DNA構(gòu)建體的完整西紅柿植株。
本文使用的術(shù)語“果實增強的”是指在果實組織或細胞中最強地或最專一地發(fā)揮作用。
本文使用的術(shù)語“馬鈴薯糖蛋白啟動子”是指一種從馬鈴薯基因組中分離到的啟動子，它與編碼馬鈴薯糖蛋白的DNA相連。
本文使用的術(shù)語“馬鈴薯ADPGPP啟動子”是指一種從馬鈴薯基因組分離到的啟動子，它與編碼葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶復(fù)合物大亞基或小亞基的DNA相連。
本文使用的術(shù)語“馬鈴薯顆粒束縛淀粉合成酶啟動子”是指一種從馬鈴薯基因組中分離到的啟動子，它與編碼顆粒束縛淀粉合成酶的DNA相連，發(fā)明詳述以雙鏈DNA形式存在的植物基因的表達包括在RNA聚合酶的作用下由DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)，并在細胞核內(nèi)對mRNA初級轉(zhuǎn)錄物作進一步加工。加工過程包括一個3′非翻譯區(qū)，它將多聚腺苷酸加到RNA的3′端。
將DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA受到DNA一個區(qū)域的調(diào)控，這個區(qū)域通常被稱為啟動子。啟動子區(qū)含有一段堿基序列，它指示RNA酶與DNA結(jié)合，并啟動mRNA轉(zhuǎn)錄。這個轉(zhuǎn)錄過程是以DNA鏈中的一條為模板合成互補的RNA鏈。
人們意外地發(fā)現(xiàn)有些馬鈴薯的啟動子能引發(fā)西紅柿果實中的DNA轉(zhuǎn)錄。特別令人感興趣的是那些通常在塊莖中優(yōu)先表達的啟動子。它們包括馬鈴薯糖蛋白啟動子、ADPGPP啟動子和顆粒束縛淀粉合成酶啟動子。
通過將這些啟動子與β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因融合并跟蹤GUS酶在轉(zhuǎn)基因果實發(fā)育期的表達就可以確定這些啟動子在西紅柿果實中的表達模式。結(jié)果在下面實施例1中給出。
這些啟動子還與WO 91/19806(Kishore等，U.S.S.N.08/120,703，在此引入作為參考)描述的CTP-glgC16構(gòu)建體相融合，后者增加了葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶的活性。這些構(gòu)建體中的三個轉(zhuǎn)化西紅柿的結(jié)果由實施例2給出。另外，為了提高果實中蔗糖的含量，人們可能會想到將與天然ADPGPP的一個或兩個亞單位相對應(yīng)的反義序列(或有共抑制作用的有義序列)摻入本發(fā)明的啟動子之后，由此抑制天然植物的ADPGPP基因活動。
其他可用來與本發(fā)明的啟動子融合的基因還有蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因，據(jù)認為它控制整個植物細胞中蔗糖合成的速率并控制蔗糖合成酶。在本發(fā)明的啟動子控制下的SPS或蔗糖合成酶基因的表達會使果實在發(fā)育中有較高的沉降(sink)活性。
這類啟動子還可與蔗糖酶基因一起應(yīng)用。在沉降細胞，比如果實細胞中，蔗糖酶的表達是另外一種提高細胞沉降能力的途徑。這是通過將蔗糖降解成可用于碳代謝途徑即淀粉合成的代謝產(chǎn)物來實現(xiàn)的。其結(jié)果會有更多的蔗糖進入沉降組織。
另外，這類啟動子可用于控制那些改變果實成熟特性的基因，如ACC合成酶和ACC脫氨酶基因?？赡苓€有許多其他基因需要不同強度和生長期特征的果實特異性啟動子，對這類情況，本發(fā)明的啟動子是十分有用的。
據(jù)推測，塊莖中發(fā)現(xiàn)的其他控制蛋白表達的基因也可以在西紅柿果實中優(yōu)先表達。已知許多此類基因呈現(xiàn)出塊莖特異性或塊莖增強表達，從這些基因中可以獲得啟動子。它們包括蔗糖合成酶基因(Salanoubat和Belliard，1987，1989)和主要塊莖蛋白，其中包括22千道爾頓蛋白復(fù)合物和蛋白酶抑制因子(Hannapel，1990)。其他可用于西紅柿果實的基因表達的啟動子包括在馬鈴薯塊莖中呈現(xiàn)增強和特異性表達的啟動子，它們是正常情況下與淀粉合成和修飾酶基因相連的啟動子或在馬鈴薯塊莖中呈現(xiàn)不同表達模式的啟動子。這些啟動子的例子包括如下基因的啟動子可溶性淀粉合成酶基因、分支酶基因、歧化酶基因、脫支酶基因、淀粉酶基因、淀粉磷酸化酶基因、果膠酯酶基因、40千道爾頓糖蛋白基因、泛素、天冬氨酸蛋白酶抑制因子、羧肽酶抑制因子、塊莖多酚氧化酶、推測的胰蛋白酶抑制因子和其他塊莖cDNA。
植物轉(zhuǎn)化與再生含有本發(fā)明中一種啟動子的雙鏈DNA分子可通過適當(dāng)方法插入到植物基因組中。適合的植物轉(zhuǎn)化載體包括從根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒得到的載體和由Herrera-Estrella等在Nature(1983)303209；Klee，H.J等在Bio/Technology(1985)3637-42以及EPO publication 120，516(Schilperoort等)中公開的載體。除了從土壤桿菌的Ti質(zhì)粒或根誘導(dǎo)質(zhì)粒(Ri)得到的植物轉(zhuǎn)化載體之外，還可選用其他方法將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體插入植物細胞。這些方法包括例如使用脂質(zhì)體、電穿孔、促進游離DNA攝入的化學(xué)物質(zhì)以及微彈轟擊法輸送游離DNA，以及用病毒和花粉進行轉(zhuǎn)化。
在基于土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化載體中，對轉(zhuǎn)化雙子葉植物特別有用的是質(zhì)粒載體pMON505(Rogers，S.G.等(1987)，“改進的植物轉(zhuǎn)化載體表達盒載體與新的可篩選標(biāo)記”，Methods in Enzymology，Wu和Grossman編，pp253-277，San DiegoAcademic Press)。雙元載體pMON505是pMON200的一個衍生物，pMON200中，Ti質(zhì)粒的同源區(qū)LIH被小RK2質(zhì)粒pTJS75上的HindIII到SmaI之間的3.8Kb片段取代(Schmidhauser，T.J和D.R.Helinski(1985)J.Bacteriol.164-155)。這個片段含有RK2復(fù)制起始區(qū)oriV和轉(zhuǎn)移(transfer)起始區(qū)oriT，以便用三親株交配法連接入土壤桿菌(Horsch，R.B.和H.Klee(1986)PNAS U.S.A.834428-32)。質(zhì)粒pMON505保留了pMON200的全部重要特性，其中包括用于插入所需DNA片段的合成的多接頭，用于植物細胞卡那霉素抗性標(biāo)記的NOS/NPTII′/NOS嵌合基因，用于大腸桿菌和根癌土壤桿菌篩選的壯觀霉素/鏈霉素抗性決定因子，便于記錄轉(zhuǎn)化子及后代遺傳的完整藍曙紅合成酶基因以及用于大量制備大腸桿菌中的載體的pBR322復(fù)制起始區(qū)。質(zhì)粒pMON505含有T-DNA的一邊，它來自pTiT37藍曙紅型TDNA的右端。Southern印跡分析表明，質(zhì)粒pMON505及其攜帶的DNA已整合到植物基因組中，就是說，整個質(zhì)粒是一個插入到植物基因組中的T-DNA。整合的DNA的一端位于上述邊界序列和藍曙紅合成酶基因之間而另一端位于右邊界序列與pBR322序列之間。
另一種特別有用的Ti質(zhì)粒盒載體是pMON17227。這個載體由Barry等人在WO92/04449中描述(參閱U.S.S.N.07/749,611，在此引入作為參考)，它含有編碼一種能提供草甘膦抗性的酶的基因，該基因?qū)Πㄎ骷t柿在內(nèi)的許多植物都是一個極好的篩選標(biāo)記基因。這個基因與擬南芥EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運肽基因(CTP2)融合并通過FWV啟動子表達。
在得到含有足夠的由本發(fā)明的啟動子控制的目的基因的細胞(或原生質(zhì)體)時，這些細胞(或原生質(zhì)體)就可以再生成完整植株。對再生步驟的方法上的選擇不是關(guān)鍵，因為有許多方案可供不同品種的西紅柿再生之用。
下面幾個實施例被用來更好地闡明本發(fā)明的實際應(yīng)用，不應(yīng)被理解為對本發(fā)明作任何限制。本領(lǐng)域的專業(yè)人員可能發(fā)現(xiàn)對本文所描述的方法和啟動子可以作各種改動、刪略等，但不會背離本發(fā)明的宗旨和范圍。
實施例1這些啟動子中的兩個已融合到GUS基因上并轉(zhuǎn)化進入西紅柿。本實驗使用的質(zhì)粒pMON17279(實施例2中有描述)含有馬鈴薯小亞單位ADPGPP啟動子，質(zhì)粒pMON17327含有馬鈴薯糖蛋白1.0(或pat1.0)啟動子。含有馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子-GUS表達盒的植物轉(zhuǎn)化載體pMON17327通過下述方法構(gòu)建馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子(與下面介紹的pMON20113中的一樣)作為HindIII-BglII片段被克隆到pMON10098中去，如在美國專利5,254,801中公開的，(取代了增強的CAMV35S啟動子)以形成pMON16952。再將大腸桿菌uidA(GUS)基因的BglII-EcoRI片段克隆到pMON16952的馬鈴薯糖蛋白10啟動子的下游而形成pMON17266。用于在pMON17227的CMoVb-CTP2/CP4 EPSPS+E9 3′草甘膦篩選盒被克隆到NotI-XhoI位點(取代NptII可篩選標(biāo)記盒)形成pMON17327。
用土壤桿菌菌株轉(zhuǎn)化西紅柿植物細胞是通過McCormick等人在PlantCell Reports 580-84(1986)介紹的方法完成的。具體地說，子葉是從7-8天的幼苗得到的。種子表面用下述方法滅菌1)將種子浸入水中15分鐘；2)浸入70％乙醇1分鐘后用無菌水沖洗；3)浸入1N NaOH 20分鐘；4)用無菌水沖洗2次；5)浸入含吐溫20的25％Chlorox 25分鐘；6)用無菌的去離子水沖洗3次。在添加有25mg/L的維生素C的Davis發(fā)芽培養(yǎng)基中發(fā)芽，培養(yǎng)皿用Sigma生產(chǎn)的植物培養(yǎng)皿(phyta trays)。種子在28℃黑暗中培養(yǎng)2-3天，然后在80量子摩爾m-2s-1光強的冷白光和25℃溫度，40％濕度的生長室中生長。光周期為16小時光照，8小時黑暗。
種子萌發(fā)7-8天后，按上述方法移植子葉。子葉在含有Calgene培養(yǎng)基的“加料平板”中預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮和1mM的半乳糖醛酸，不加抗生素，條件如上述。
然后用含有上述質(zhì)粒的對數(shù)生長期的土壤桿菌溶液接種子葉。土壤桿菌的濃度約為5×108細胞/毫升。子葉浸入細菌溶液8分鐘后，在無菌Whatman過濾平皿上吸去多余溶液，再放回原先的加料平板中一起培養(yǎng)2-3天。
將子葉轉(zhuǎn)移到含有Davis再生培養(yǎng)基的選擇平板中，培養(yǎng)基中含有2ml/l的玉米素核苷，500μg/ml的羧芐青霉素和100μg/ml的卡那霉素。2-3周后，將有愈傷組織和/或幼芽形成的子葉轉(zhuǎn)移到新配制的Davis再生平板中，培養(yǎng)基中含有相同濃度的羧芐青霉素和卡那霉素。此時進行轉(zhuǎn)化計數(shù)。愈傷組織每三周進行一次傳代培養(yǎng)，并清理異常部分以使發(fā)育的幼苗不斷再生。幼苗在3-4個月內(nèi)發(fā)育。
幼苗一旦發(fā)育，就將它們從愈傷組織上完全切下并種植到生根選擇平板上。平板中含有0.5×MSO，其中含有50μg/ml卡那霉素和500μg/ml的羧芐青霉素。這些幼苗在選擇培養(yǎng)基中在2周內(nèi)長出根系。若2周不見幼苗長出，則要修整幼苗，重新種植到選擇培養(yǎng)基上。幼苗在22℃下在persivals中培養(yǎng)，在其根長到2厘米時移載到花盆中。轉(zhuǎn)移到溫室之前，植株要在18小時光照，6小時黑暗的光周期條件下在21℃的生長室進行2-3周的耐寒處理。在溫室中，植株在白天26℃，夜間21℃的溫度條件下生長。光周期是13小時光照，11小時黑暗，直到成熟。
若采用草甘膦抗性基因而不是NPTII(提供卡那霉素抗性)基因，則方法有如下不同將子葉轉(zhuǎn)移到含有2mg/l玉米素核苷，500μg/ml羧芐青霉素和100μg/ml頭孢噻肟的Davis再生選擇培養(yǎng)基平板上。8天后，將組織轉(zhuǎn)移到含有0.03mM草甘膦，500μg/ml羧芐青霉素和100μg/ml頭孢噻肟的新配制再生培養(yǎng)基上。經(jīng)過2-3周，帶有愈傷組織和/或幼苗的子葉被移植到含有草甘膦(0.05mM)、羧芐青霉素和頭孢噻肟的新配制的Davis再生培養(yǎng)基中。此時做轉(zhuǎn)化子計數(shù)。愈傷組織培養(yǎng)一般三周傳一代并修整異常形態(tài)以使發(fā)育中的幼苗持續(xù)再生。幼苗在3-4個月內(nèi)發(fā)育。
幼苗一旦發(fā)育，就將它們從愈傷組織上完全切下并種植在含有同濃度的草甘膦、羧芐青霉素和頭孢噻肟的生根選擇平板上，但是玉米素濃度要低些(1mg/L)。此外還要加入苯菌靈。這些幼苗在3周內(nèi)在選擇培養(yǎng)基中長出根系。然后按前述方法培養(yǎng)出完整植株。
為了證實GUS在植株整個生活周期中都有表達，我們對再生的西紅柿植株作了觀察。結(jié)果表明在整個發(fā)育過程中兩種啟動子都在西紅柿果實中引起表達。從果實開始發(fā)育到成熟都檢測到表達。在整個果實中的表達情況差不多是一樣的，即在各種類型的細胞包括種子中都能測到高表達。綠色果實中呈現(xiàn)的表達稍強些。兩種啟動子還可引起轉(zhuǎn)基因西紅柿的莖和葉中某些程度的表達。Pat1.0啟動子的表達則限于葉子維管區(qū)附近的細胞而且沒有果實中表達的高。小亞基ADPGPP啟動子在葉和莖中引起的表達發(fā)生在皮層細胞維管周圍區(qū)域。在這些細胞中的表達水平與在果實中測到的相當(dāng)。
實施例2本發(fā)明的啟動子與WO91/19806發(fā)表的嵌合基因CTP-GlgC16(及適當(dāng)?shù)?′序列)融合。將這個表達盒按下述方法插入到植物轉(zhuǎn)化載體中。
從質(zhì)粒pBI240.7得到馬鈴薯糖蛋白3.5啟動子(Bevan等，NucleicAcid Res.14(11)4625-4638，1986)。3.5啟動子的主要部分即HindIII(-3500)與XbaI(-337)位點間的序列從pBI240.7剪切得來。它與啟動子的其余部分即XbaI位點到+22的BglII位點(以前是DraI位點)之間的序列相結(jié)合，以三重連結(jié)的形式插入到載體的BglII位點，構(gòu)成pMON17280。后者再作為完整3.5啟動子三重連結(jié)的載體以及質(zhì)粒目標(biāo)肽-glgC16融合序列的載體，構(gòu)成塊莖表達盒(在pMON17282中)，其中質(zhì)粒目標(biāo)肽-glgC16融合序列來自WO91/19806描述的pMON20102。將由馬鈴薯糖蛋白3.5啟動子、質(zhì)粒目標(biāo)肽-GlgC16融合序列和NOS 3′序列組成的表達盒插入Barry等人在WO 92/04449中描述的植物轉(zhuǎn)化載體pMON17227(一種Ti質(zhì)粒載體)的NotI片段，構(gòu)成質(zhì)粒pMON17316。
馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子是從pBI241.3質(zhì)粒剪切來的HindIII-BamHI片段序列(pBI241.3質(zhì)粒含有馬鈴薯糖蛋白-1啟動子片段，這個片段由位于1323處的AccI位點到2289處的DraI位點之間的片段組成(其位置參考Bevan等1986年發(fā)表的序列)其中HindIII接頭加在1323處，BamHI接頭加在2289處；Bevan等，1986)，將這段啟動子與CTP1-glgC16融合序列(從pMON20102切下的BglII-SacI片段)和用HindIII、SacI切開的pUC型質(zhì)粒載體連接(載體中的這些克隆位點旁邊都有NotI識別位點)。將這個表達盒插入pMON886質(zhì)粒的NotI位點。如美國專利5,254,801所公開的，該專利在此引入作為參考，結(jié)果使glgC16基因的表達與NPTII(卡那霉素)基因的表達方向一致。所形成的質(zhì)粒被稱為pMON20113。
另一含有馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子的載體是從pMON10098制備來的，也公開于美國專利5,254,801中。將pMON10098用HindIII和SacI切開。然后將上述HindIII-BamHI啟動子片段和CTPl-glgC16融合序列插入其中(融合序列的BglII-SacI片段來自pMON20102)。結(jié)果形成載體pMON16951。它包含馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子-CTP-glgC16盒，這個表達盒中存在于含有NPTII基因的雙邊界雙元載體中。為了構(gòu)建這種草甘膦選擇載體，用NotI和XhoI切去NPTII基因并將上述pMON17227中的CP4表達盒插入其中。結(jié)果得到載體pMON17320，作為篩選標(biāo)記的FWV-CP4盒和馬鈴薯糖蛋白1.0-CTP-glgC16盒，它們?nèi)堪谝粋€雙邊界質(zhì)粒之中。
馬鈴薯塊莖ADPGPP小亞基基因的啟動子SEQ ID NOl(Nakata等，(1992)J.Cell Biochem.Suppl.16F，Abstract Y311，P266)來自基因組克隆1-2中的XbaI-BglII片段，并將這個片段插入到Bluescript II KS-的XbaI和BamHI位點。這個啟動子片段包括距推測的起始甲硫氨酸2.0kb的ClaI位點到距ATG上游12bp的HindIII位點之間的部分。BglII位點通過用另一個pUC載體亞克隆而與HindIII位點連接在一起，并通過HindIII接到CTP靶向序列與glgC16編碼序列的融合序列上。再將這帶有NOS 3′序列的盒導(dǎo)入2個載體以提供不同的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。pMON17279含有GUS和NPTII(卡那霉素)篩選盒，pMON17354含有草甘膦篩選盒，這和上述pMON17227中的是一樣的。
馬鈴薯顆粒束縛淀粉合成酶(GBSS)基因啟動子(SEQ ID NO2)是用PCR方法從Russet Burbank DNA中分離到的。這個PCR方法基于Rohde等人在1990年的J.Genet & Breed.44311-315中發(fā)表的序列。PCR引物的設(shè)計是為了在啟動子的5′端引入HindIII克隆位點和在轉(zhuǎn)錄起始位點的下游引入BglII位點。所得產(chǎn)物1.2Kb啟動子片段連接到pMON10098上，這個質(zhì)粒描述于美國專利5,254,801中，在此引入作為參考。并取代E35S啟動子與BglII-SacI片段融合，后者含有上述pMON20102的CTPl-glgC16嵌合基因。將E35S-NPTII-Nos盒從這個質(zhì)粒中除去，代之以上述FMV-CP4表達盒，從而構(gòu)成質(zhì)粒pMON16996。
用于馬鈴薯塊莖ADPGPP大亞基的啟動子從馬鈴薯的兩個變種分離得到。它們是Russet Burbank(SEQ ID NO3)和Desiree(SEQ ID NO4)。這些克隆用空斑雜交方法識別挑選，探針是葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶大亞基的cDNA 5′端?？寺〉姆g起始點(ATG)用植物一致序列識別(Lutcke等(1987)，EMBO J.6(1)43-48)。用PCR引物在ATG下游3′端引入BamHI位點和在兩個啟動子的5′端引入HindIII位點。生成的600bp Russet Burbank啟動子和1600bp Desiree啟動子各自連接到pMON10098質(zhì)粒以取代E35S啟動子，并與含有嵌合基因CTP-glgC16的pMON20102中BglII-SacI片段融合。將E35S-NPTII-Nos盒從質(zhì)粒中除去，換上pMON17227的NotI-SalI片段從而生成pMON21522(Russet Burbank)和pMON21523(Desiree)。
制備好西紅柿組織并用質(zhì)粒pMON17279，pMON17320和pMON17316轉(zhuǎn)化，用實施例1的方法再生西紅柿植株。每種載體轉(zhuǎn)化一個或多個的株系，在加利弗尼亞種植園的商業(yè)條件下，每塊地種植20株轉(zhuǎn)化的植株。這樣，每塊地可以收獲5磅西紅柿果實并進行加工。對濃縮果汁的分析包括可溶性固形物(白利糖度)，糊狀物粘度(Bostwick)，固形物總量，漿液粘度。這些數(shù)據(jù)在表2中列出。對照組植株(US204C)為非轉(zhuǎn)基因植株。
結(jié)果表明小亞基ADPGPP啟動子(來自pMON17279)在綠色果實中使glgC16高效表達，而在紅色果實中表達要降低2-10倍。這樣可使成熟果實中生成相當(dāng)量的淀粉(每株的淀粉含量占鮮重的0.3-0.4％)并使從果實中提取的粘果汁中可測固形物同時增加。馬鈴薯糖蛋白1.0啟動子和3.5啟動子作用較弱，但在西紅柿中肯定是起作用的。
表2品系白利糖度Bostwick％固形物總重漿液濃度17320-86744.0 14.554.786.42117316-93024.3 16.854.985.89317279-10120 4.6 15.405.367.95117279-10245 4.5 14.005.306.45517279-10246 4.7 13.005.536.79617279-10272 4.6 15.155.327.99817279-10309 4.3 14.705.146.07917279-98584.3 10.905.336.52117279-10076 4.6 12.405.496.43517279-10205 4.2 13.055.044.55817279-10279 4.2 13.554.984.09617279-10307 4.0 11.304.984.06117279-10356 4.4 12.755.224.848UC204C對照4.1 15.804.856.518UC204C對照4.115.804.675.561UC204C對照4.014.654.765.967UC204C對照4.014.654.785.652UC204C對照4.114.604 785.564UC204C對照4.214.454.875.463和引入個別出版物或?qū)＠鳛閰⒖紩r所聲明的一樣，本說明書中涉及的全部出版物和專利都在此引入作為參考。
從上述結(jié)果可見，本發(fā)明完全達到了前面所述的目的，并且本發(fā)明有顯而易見的優(yōu)點，這些優(yōu)點是本發(fā)明所固有的。
應(yīng)能理解，某些特性和亞組合具有實用意義并可以在不涉及其他特性和亞組合的情況下使用。這由權(quán)利要求闡明并屬于權(quán)利要求的范圍。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Monsanto Company(B)街道800 North Lindbergh Boulevard(C)城市St.Louis(D)州Missouri(E)國家美國(F)郵編(ZIP)63167(G)電話(3134)694-3131(H)電傳(314)694-5435(ii)發(fā)明名稱西紅柿果實啟動子(iii)序列數(shù)4(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤
(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/334,639(B)提交日期04-NOV-1994(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度2196個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCGATTATT GGTTTATCGG GTTTTGATCG TTATCGGTTC GGTTTAACCG TTAAAATTTG 60ACACAAAAAT AAAAATTGAA AAGCACTTAG AAACAAGGTG ACAAACCTAA TAAACCATGC120ACATGAGTTC ACAAGTTACA TCTTGCTAAA AAACAAACAC TTTTACATTG TAGAATAACC180AAGTGTCTGG GACAACCAAA AATGAAAGTA GGAAACCAAA CTCTAAGTCA AGGACTTTAT240ATACAAAATG GTATAACTAT AATTATTTAA TTTACTATTG GGTTATCGGT TAACCCGTTA300AGAACCGATA ACCCGATAAC AAAAACAATC AAAATCGTTA TCAAAACCGC TAAACTAATA360ACCCAATACT GATAAACCAA TAACTTTTTT TTTATTCGGG TTATCGGTTT CAGTTCGGTT420TTGAACAATC CTAGTGTCCT AATTATTGTT TTGAGAACCA AGAAAACAAA AACTGACGTC480GCAAATATTT CAGTAAATAC TTGTATATCT CAGTGATAAT TGATTTCCAA GATGTATAAT540TATCATTTAC GTAATAATAG ATGGTTTCCG AAACTTACGC TTCCCTTTTT TCTTTTGCAG600TCGTATGGAA TAAAGTTGGA TATGGAGGCA TTCCCGGGCC TTCAGGTGGA AGAGACGGAG660CTGCTTCACA AGGAGGGGGT TGTTGTACTT GAAAATAGGC ATTTATTCCG TTCGCAAACC720TATCATGTTC CTATGGTTGT TTATTTGTAG TTTGGTGTTC TTAATATCGA GTGTTCTTTA780GTTTGTTCCT TTTAATGAAA GGATAATATC TCGTGCCAAA AATAAGCAAA TTCGGTACAT840AAAGACATTT TTTTTCTTTC GTGGATTTTC TGTTTATGGA GTTGTCAAAT GTGGAATTTA 900TTTCATAGCA TGTGGAGTTT CCTCCTCTCC TTTTTCATGT GCCCTTGGGC CTTGCCTGTT 960TCTTGCACCG CAGTGTGCCA GGGCAGTCGG CAGATGGACA TAAATGGCAC ACCGCTCGGC1020TCGTGGAAAG AGTATGGTCA GTTTCATTGA TAAGTATTTA CTCGTATTCG GCGTATACAT1080CAAGTTAATA GAAAGTAAAC ACATATGATA TCATACATCC ATTAGTTAAG TATAAATGCC1140AACTTTTTAC TTGAATCGCT GAATAAATTT ACTTACGATT AATATTTAGT TGTGTGTTCA1200AACATATCAT GCATTATTTG ATTAAGAATA AATAAACGAT GTGTAATTTG AAAACCAATT1260AGAAAAGAAG TATGACGGGA TTGATGTTCT GTGAAATCAC TGGCAAATTG AACGGACGAT1320GAAATTTGAT CGTCATTTAA ACATATCAAC ATGGCTTTAG TCATCATCAT TATGTTATAA1380TTATTTTCTT GAAACTTGAT ACACCAACTC TCATTGGGAA AGTGACAGCA TAATATAAAC1440TATAATATCA ATCTGGCAAT TTCGAATTAT TCCAAATCTC TTTTGTCATT TCATTTCATC1500CCCTATGTCT GCCTGCAAGT ACCAATTATT TAAATACAAA AATCTTGATT AAACAATTCA1560TTTTCTCACT AATAATCACA TTTAATAATA AACGGTTCAT ACACGTGCGT CACCTTTTTT1620TCGATTTTCT CTCAAGCGCA TGTGATCATA TCTAACTCTT GTGCAAACAA GTGAAATGAC1680GTCCATTAAT AAATAATCTT TTGAATACCT GTTCATTTTA ATTTATTTGG ATTTGCTAAG1740GATTTTTTTT AGTTTTTGAG ATTTTTTATA ATTTTAAATT AAAAAAAATA AGTTAAATAT1800ATCGAAAATG TCTTTTAATC TTATTTTTGA AAAAGATAAT TAGCTCAAAC AAATTAAAAT1860TGGTAACTAT TTTTCGGAAA AATAATGATT CTTATTGTAC ATTCTTTTTC ATCGATTAGA1920TATTTTTTTT AAGCTCAAGT ACAAAAGTCA TATTTCAATC CCCAAAATAG CCTCAATCAC1980AAGAAATGCT TAAATCCCCA AAATACCCTC AATCACAAAA AGTGTACCAA TCATAACTAT2040GGTCCTCTGT AAATTCCAAC AAAATCAAGT CTATAAAGTT ACCCTTGATA TCAGTACTAT2100AAAACCAAAA ATCTCAGCTG TAATTCAAGT GCAATCACAC TCTACCACAC ACTCTCTAGT2160AGAGAAATCA GTTGATAACA AGCTTTGTTA ACAATG 2196(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度1226個堿基對(B類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGCTTAAGC GGTAACGAGA TAGAAAATTA TATTACTCCG TTTTGTTCAT TACTTAACAA 60ATGCAACAGT ATCTTGTACC AAATCCTTTC TCTCTTTTCA AACTTTTCTA TTTGGCTGTT120GACAGAGTAA TCAGGATACA AACCACAAGT ATTTAATTGA CTCCTCCGCC AGATATTATG180ATTTATGAAT CCTCGAAAAG CCTATCCATT AAGTCCTCAT CTATGGATAT ACTTGACAGT240TTCTTCCTAT TTGGGTGTTT TTTTCCTGTT AAGTGGAACG GAGACATGTT ATGATGTATA300CGGGAAGCTC GTTAAAAAAA AAAAAACAAT AGGAAGAAAT GTAACAAACA TTGAATGTTG360TTTTTAACCA TCCTTCCTTT TAGCAGTGTA TCAATTTTGT AATAGAACCA TGCATCTCAA420TCTTAATACT AAAAAATGCA ACTTAAGATA GGCTAAACCA AGTAAAGTAA TGTATTCAAC480CTTTAGAATT GTGCATTCAT AATTTGATCT TGTTTGTCGT AAAACATTAG AAAATATATT540TACAGTAATT TGGAATACAA AGCTAAGGGG GAAGTAACTA CTAATATTCT AGTGGAGGGA600GGGACCAGTA CCAGTACCTA GATATTATTT TTAATTACTA TAATAATAAT TTAATTAACA660CGAGACATAG GAACGTCAAG TGGTAGCGGT AGGAGGGAGT TGGTTTAGTT TTTTAGATAC720TAGGAGACAG AACCGGACGG GCCCATTGCA AGGCCCAAGT TGAAGTCCAG CCGTGAATCA780ACAAAGAGAG GGCCCATAAT ACTGTCGATG AGCATTTCCC TATAATACAG TTGCCTTCCA840CTAAGGGATA GTTACCCGCA ATTCTCTTGA CACGTGTCAC TGAAACCTGC TACAAATAAG900GCAGGCACCT CCTCATTGAC ACTCACTCAC TCACTCACTC ACACAGCTCA ACAAGTGGTA960ACTTTTACTC ATCTCCTCCA ATTATTTATG ATTTCATGCA TGTTTCCCTA CATTCTATTA 1020TGAATCGTGT TATGGTGTAT AAACGTTGTT TCATATCTCA TCTCATCTAT TCTGATTTTG 1080ATTCTCTTGC CTACTGTAAT CGGTAATAAA TGTGAATGCT TCCTCTTCTT CTTCTTCTCA 1140GAAATCAATT TCTGTTTTGT TTTTGTTCAT CTGTAGCTTA TTCTCTGGTA GATTCCCCTT 1200TTTGTAGACC ACACATCACA AGATCT1226(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度519個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3AAGCTTGATA TCGAATTCCT GCAGCCCGGG GGATCTCCTT AAAACTTTTT CTGAATTACT 60TTTCAAGATT CTTGATTCTG CACCACTAGC AATTTCCATT TTTCTTTCAG TGATTTTGGT120TACTTATTTG ACATTCTTGT TTTCAAGATC CAACATCATC ACTTTCCAGG TTCAAAATCT180TGTTTTTTTT CTTTTTTCTT TTAATGCTCT ATATTGTGGA AGTCCACAGG TGAATTTTTA240CGATATGGGT TTACCACTTA GCTTTCTTGT AATATTTTAT CAATTTTAGA AAATATATGT300GTGAAATACC TAATTTTACG TAGAGATCAT GGGTTCATAT GCGTAAAGAT TCATGTTTTT360GTGGTAATGC TATGAGGTAT TAGTACTGAG CATATAGCTA GCTTGGGTTT TGGGTTTACC420GACCAAAAAA AAAAATTAGT GATATTTTCT TTATGTAAAT TATACTTTTC TTGGTTGCTA480AAAGATAACA TATACTTTAT TGAGATTTGA ATAAATCTAT TTGATTTAGA TCCATTGATA540AATCTTAATC TTATGGGATT ACTGATTTGT TGATTGGCTG CAGAAGGATC C 591(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度1705個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGCTTGGGT ACCGGGCCCC CCCTGGAGGT CGAGTGCCAT CACATCCAGG GTGTAGGCTC 60GGGGCGTGAC AAACTTGGTA TCTGAGCTCA GAGTTCAAGA GTCTAAGGTG TCTATAAAGT120CTGTGCCTTT AGAGTCCTAG TTATCGGTGT GAAGCGCGCC ACATCTATAA CCAGGAGGCT180GCGACATTTA AGAATTATCA TACTTCTTTC ATACTCTTTT CGTGCAATAG AGTTCAACTC240CATAAAGTCT CTTTATAATT CATGTTTACG CATATCTTTG AGATCATGCC TCCATGTAGA300GTTGTCTGAG GTCGTCCTGC TAGAAGAAAT ATTGATCCTC AGGATCAAGG GGTACCCAAT360GCACCAGAAG TGCGACCCCA AGGAAAGGTC ACTAATGTTG AGTTCCAGGA TGTTATACGG420ATATTGAGTG AAGTTGTGAC CAACCAAGCT GGACAACAAA GAGGGAATCA ACAAGATGTG480GTTGATACAT CCAGAATCCG TGAGTTCTTA AGGATGAATC CTTCAGACTT CACCAATTCA540AGAGTCACTG AGGATCTGGA AAACTTTGTG GAAGAGTTGT AGAAGGTTTT TGAGGTTATG600CATGTTGTTG ATGCTGAGCG AGTGGAACTA ACTGCATACC AACTGAATGG TGTTGCTAGA660GTATGGTACG ACCAATAGAA AAAGAGTAGA GTTGAGGGTG CACAAATTGT GAGTTGGGCA720GTGTTTGAAG AGGCCTTCAT GGGGCATTTC TTTTCCCATG AACTATATGG CAAAGGTAAG780AGAATTTCCT CACTCTTAAG CAGGAATCCA TGAGTGTGCA TAAGTATAGC CTCAAGTTCA840CTCAACTGTC GCCTATGCTC CAGAGATGGC TGTTGATATG AGGAGCAGGA TGGGCTTGTT900TGTGTTTGGG TTGTCTCATC TGTCAATCAA AGAAGGTAAG GTTGTGATGT GGATAAAGGA960CATGGACATC GAAAGGGTAA TGATCCTTGT GCAACAGGTT GAGGAAGATA AGTTGAGGGA 1020TAGAGAAGAG TTCTGAAACA AGAGGGCTAA GAACACATGA AATGAGTACG TAAGCAGAAG 1080AGTAATGCAA ATCGGTTATC TTTTCAATGA AAGCCAAATA AACCTGCTTG ATTGTTTGCA 1140AGTGCAACCT GTACCAACGA ACAAAGGTGA GTTCAAGAAT CAGAATTCTT AGAAATTCAG 1200AGCTAGACCT GCACAATCTC AAGGTAGTGT GGCACAAGGA TGTAATGGGA CTCCTGCATG 1260TGTTAAGTAC GGTAGGAACC ACCCAGGAGC GTGTCATGAT GGCTCTGCTG GTTGCTTCAA 1320GTGTGGTCAG AATGGTCACT TCATGAGAGA GTGCCTAAAG AANAGGCAAG GTAATAGCAA 1380TGGGGGCAAT ATATCACAAT CTTCTTCAGT GGCTCCACNA GATAGAGCTG CACCTTGAGG 1440ATCATGGGTT CATATGCGTA AAGATTCATG TTTTGTGGTA ATGCTATGAG GTATTAGTAC 1500TGAGCATATA GCTAGCTTGG GTTTTGGGTT TACCGACCAT TTTTTTTAAT TAGTGATATT 1560TTCTTTATGT ATTTTATACT TTTCTTGGTT GCTTAAAGAT TACATATACT TTATTGAGAT 1620TTGAATAAAT CTATTTGATT TAGATCCATT GATAAATCTT AATCTTATGG GATTACTGAT 1680TTGTTGATTG GCTGCAGAAG GATCC 170權(quán)利要求
1.一種能引起西紅柿植株果實中的蛋白或反義mRNA表達的方法，其包括(1)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化西紅柿植株細胞，該構(gòu)建體按操作順序包含(a)選自馬鈴薯糖蛋白啟動子、馬鈴薯ADPGPP啟動子和馬鈴薯顆粒束縛淀粉合成酶啟動子的啟動子；(b)能引起RNA序列生成的結(jié)構(gòu)DNA序列；(c)3′非翻譯區(qū)，它在植株細胞中的功能是使轉(zhuǎn)錄終止并在RNA序列的3′端加入多聚腺苷酸；(2)再生含有所述DNA構(gòu)建體的西紅柿植株。
2.權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)DNA序列處于反義方向。
3.權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)DNA編碼葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶是glgC16。
5.權(quán)利要求4的方法，其中啟動子是小亞基ADPGPP啟動子。
6.一種西紅柿植株細胞，其包含重組的雙鏈DNA分子，該分子依次包含(a)選自馬鈴薯糖蛋白啟動子、馬鈴薯ADPGPP啟動子和馬鈴薯顆粒束縛淀粉合成酶啟動子的啟動子；(b)能引起RNA序列生成的結(jié)構(gòu)DNA序列；(c)3′非翻譯區(qū)，它在植株細胞中的功能是使轉(zhuǎn)錄終止并在RNA序列的3′端加入多聚腺苷酸。
7.權(quán)利要求6的西紅柿植株細胞，其中結(jié)構(gòu)DNA序列處于反義方向。
8.權(quán)利要求6的西紅柿植株細胞，其中結(jié)構(gòu)DNA序列編碼葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶。
9.權(quán)利要求8的西紅柿植株細胞，其中葡萄糖腺苷二磷酸焦磷酸化酶是glgC16。
10.權(quán)利要求9的西紅柿植株細胞，其中啟動子是小亞基ADPGPP啟動子。
11.一種西紅柿，其包含權(quán)利要求6的細胞。
12.一種西紅柿，其包含權(quán)利要求10的細胞。
全文摘要
從馬鈴薯中分離的啟動子,它可以引起含有這類啟動子的西紅柿果實、西紅柿植株細胞和西紅柿植株中選定基因的表達。
文檔編號A01H5/00GK1171820SQ95197229
公開日1998年1月28日 申請日期1995年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月4日
發(fā)明者G·F·巴里, J·W·愛德華茲, G·M·基肖, D·M·斯達克 申請人:孟山都公司