專利名稱：西紅柿斑點枯萎病毒的制作方法
Tospovirus屬內(nèi)的病毒感染許多種植物品種，特別是煙草、花生、蔬菜和觀賞植物。人們對Tospovirus屬內(nèi)的二種病毒，即西紅柿斑點枯萎病毒(TSWV)和無耐性(impatiens)壞死斑點病毒(INSV)已經(jīng)了解。
西紅柿斑點枯萎病毒(TSWV)是一種獨特的植物病毒，其核酸-蛋白質(zhì)復合體是由脂蛋白外殼所包裹，同時也是唯一的thrip傳播病毒。這種病毒最近已被劃分為布尼安病毒科中的Tospovirus屬。TSWV病毒顆粒含有一個29K核蛋白殼蛋白(“NP”或“N”)，二個與膜相連的糖蛋白(58K和78K)和一個推測為病毒轉(zhuǎn)錄酶的200K大蛋白[參見J.Gen.Virol.712207(1991)；Virol.5612(1973)；和J.Gen.Virol.36267(1977)]。該病毒基因組包含三個負鏈(-)RNAs，命名為L RNA(8900個核苷酸)、M RNA(5400個核苷酸)和S RNA(2900個核苷酸)[參見J.Gen.Virol.3681(1977)；J.Gen.Virol.5312(1981)；和J.Gen.Virol.703469(1989)]，其中每個RNA由NP所包裹。通過對三個TSWV分離株所提取的S RNAs進行部分或全長序列分析，表明一個雙義基因排列中存在二個開放閱讀框(ORF)[參見J.Gen.Virol.711(1990)和J.Gen.Virol.72461(1991)]。較大的開放閱讀框位于病毒RNA鏈上，能夠編碼一個52K非結(jié)構(gòu)蛋白，而較小ORF位于病毒互補RNA鏈，通過一個亞基因組RNA翻譯29K NP。
雙義編碼策略也是TSWV M RNA的特征，在其開放閱讀框內(nèi)，編碼58K和78K二個與膜相連的糖蛋白。TSWV L RNA已做測序分析，它能編碼一個推測為病毒轉(zhuǎn)錄酶的200K大蛋白。
以結(jié)構(gòu)蛋白的血清學分析以及對細胞病變結(jié)構(gòu)的形態(tài)學分析為基礎(chǔ)，二個TSWV血清型，“L”和“I”已被鑒定并描述了特征[參見J.Gen.Virol.71933(1990)和Phytopathology 81525(1991)]。它們有血清學上保守的G1和G2糖蛋白，但是“I”血清型的NP在血清學明顯不同于“L”血清型的NP。通過對“L”和“I”血清型的NP進行比較分析，表明在核苷酸和氨基酸水平上分別有62％和67％的一致性[參見J.Gen.Virol.722597(1991)]。
TSWV具有廣泛的寄主范圍，感染50科中的360多種植物，并導致世界范圍內(nèi)蔬菜和觀賞植物的重大經(jīng)濟損失?！癓”血清型已廣泛發(fā)現(xiàn)于大田作物，如蔬菜和雜草，而“I”血清型大多只局限于觀賞作物。最近，一種葫蘆分離株已被鑒定[參見Plant Disease 681006(1984)]為一種獨特的分離株，因為它能系統(tǒng)地感染西瓜和其它葫蘆科植物。其NP與兩種中任一種血清型的NP在血清學上是不相關(guān)的。盡管TSWV病害的傳播有時可以通過選育抗性植物或通過使用非遺傳學方法來減少，但是，要想通過傳統(tǒng)方法來完全控制這種病毒總的來說已被證明是很困難的[參見Plant Disease 73375(1989)]。
自1986年以來，已有大量報道表明，利用病毒外殼蛋白(CP)基因所獲得的轉(zhuǎn)基因植物通常能抗該病毒的感染。這種現(xiàn)象常常被稱之為外殼蛋白介導保護(CPMP)。保護水平從延緩病癥表現(xiàn)至無病癥和病毒累積。最近，二例報道[參見Biol.Technology 91363(1991)和Mol.Plant-Microbe Interact.534(1992)]分別表現(xiàn)能表達TSWV的核蛋白殼蛋白(NP)基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物能抗同源病毒分離株的感染。不過，由于TSWV具有許多生物多樣性分離株，所以，測試轉(zhuǎn)基因植物抗不同的TSWV分離株感染的效果是十分重要的。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物表明能抗“L”血清型的二個異源分離株和“I”血清型的一個分離株，這標志著本發(fā)明的的研究結(jié)果在以前的報道的基礎(chǔ)上有所拓展。我們的結(jié)果也表明，對“L”血清型的兩個異源分離株的抗性，如果有的話，也主要發(fā)現(xiàn)于積累非常低水平NP的植物中，而積累高水平NP的轉(zhuǎn)基因植物能抗“I”血清型的分離株。
不過，盡管積累高水平N蛋白的植物確實表現(xiàn)出延緩病癥表達，但是卻沒有觀察到對一種Brazilian分離株的抗性。這種稱為TSWV-B的Brazilian分離株具有在血清學上與“L”和“I”血清型明顯不同的N蛋白，同時在生物學上又不同于一種葫蘆分離株，也就是說TSWV-B不會系統(tǒng)感染甜瓜類或西葫蘆。因此，本發(fā)明的一方面是通過克隆和測定其S RNA的序列以及與公開的其它TSWV分離株序列進行比較，來描述TSWV-B的特征。
從以下對本發(fā)明的詳細描述，包括下列實施例、附圖和數(shù)據(jù)，本發(fā)明的各種目的將是顯而易見的。
在附圖中


圖1描述了根據(jù)本發(fā)明從病毒RNA克隆NP基因的策略；
圖2描述了根據(jù)本發(fā)明西紅柿斑點枯萎病毒的核蛋白殼蛋白(NP)基因在煙草原生質(zhì)體中的體內(nèi)瞬間表達；圖3描述了根據(jù)本發(fā)明已測序的cDNA克隆在TSWV-B S RNA上的位置；圖4描述了根據(jù)本發(fā)明表明TSWV分離株親緣關(guān)系的枝形圖(dendogram)；圖5描述了本文描述過的TSWV分離株的血清學上的親緣關(guān)系；圖6描述了轉(zhuǎn)基因植物中核蛋白殼蛋白(NP)積累水平與TSWV分離株的抗性水平的相關(guān)性；圖7描述了根據(jù)本發(fā)明的一方面目的導入轉(zhuǎn)基因植物中的TSWV-BL N編碼序列；和圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的一方面目的，導入植物中的TSWV-BL半N基因片段。
更具體地講，圖2描述了NP基因的瞬間表達，其中利用聚乙二醇(PEG)將構(gòu)建體導入煙草子葉原生質(zhì)體中。隨后將轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體培養(yǎng)兩天以表達NP基因。然后，從原生質(zhì)體中提取蛋白質(zhì)，并利用抗TSWV NP的抗體通過雙抗多層酶聯(lián)免疫吸附分析法(DAS-ELISA)測定NP。NP-和NP+分別代表用質(zhì)粒pBI525-NP-和pBI525-NP+轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。包裹抗體的濃度是5μg/ml，酶連接物稀釋為1∶250。加底物后30、60和90分鐘記錄數(shù)據(jù)。
在圖3中，TSWV-B的一個S RNA圖譜下邊繪出了5個重疊cDNA克隆。用從被TSWV-B感染過的N.benthamiana植物中分離的雙鏈RNA的隨機引物合成這些克隆。
在圖4中，利用GCG序列分析軟件包裝中的聚類(pileup)程序比較序列。水平線與遺傳距離成比例，而垂直線是任一長度，并不重要。
更特別的是在圖5中，N.benthamiana Domin被TSWV分離株感染[TSWV-BL(一種萵苣分離株)，Arkansas，10W pakchoy(TSWV-10W)，Begonia和Brazil(TSWV-B)]。一感染的葉盤(0.05g)于12ml的酶連緩沖液中磨碎，然后利用TSWV-BL病毒粒子(BL病毒粒子)或TSWV-BL的NP(BL-NP)或TSWV-I(I-NP)的抗體，通過DAS-ELISA分析之。包裹抗體的濃度為1μg/ml；連接物的稀釋對于BL病毒粒子為1∶2000，對于BL-NP為1∶250，而對于I-NP為1∶1000。這些結(jié)果是在加底物以后10分鐘(BL)，50分鐘(BL-NP)，或30分鐘所記錄的。
關(guān)于圖6，利用產(chǎn)生的抗TSWV-BL NP的抗體，通過DAS-ELISA分析了轉(zhuǎn)基因植物的NP累積。加底物后150分鐘標明植物，并將轉(zhuǎn)基因植物劃分成四類OD405nm不到0.050，OD405nm介于0.050和0.200之間，OD405nm介于0.200和0.400之間以及OD405nm大于0.400。對照NP(-)植物的OD405nm值從0至0.05。用Arkansas(Ark)和10W pakchoy(10W)分離株或Begonia的分離株浸染同種植物，然后于接種后約12天記錄每種植物的敏感性。用Arkansas和10W pakchoy的分離株接種51個R1NP(+)植物，以及用Begonia分離株接種139個R1NP(+)植物，然后從中收集結(jié)果。線條以上數(shù)據(jù)代表被測試的R1NP(+)植物的總數(shù)。
實施例ITSWV-BL RNAs的分離從Datura stramonium L.中按如下方法純化TSWV-BL分離株在一個Waring攪拌器中，將感染組織用3體積的緩沖液(0.033MKH2PO4，0.067M K2HPO4，0.01M Na2SO4)磨碎45秒鐘。勻漿通過4層被上述緩沖液浸濕的奶酪布過濾，然后于7000rpm離心15分鐘。用與原組織等重的0.01M Na2SO3重懸沉淀顆粒，然后再于8000rpm離心15分鐘。用原組織重量十分之一的0.01M Na2SO3重懸上清液，然后病毒提取物于9000rpm離心15分鐘，再將上清液小心裝入10％到40％的蔗糖梯度(用0.01M Na2SO3制作)中。于23000rpm離心35分鐘，收集病毒帶(彎液面下約3cm處)并用2體積的0.01M Na2SO3稀釋，再于27000rpm離心55分鐘，收集半純化的病毒。
實施例IITSWV和病毒RNAs的純化按照實施例I所描述的方法，從Datura stramonium L.純化TSWV-BL分離株[參見Plant Disease 74154(1990)]。將純化的病毒重懸于0.04％皂土、10μg/ml蛋白酶K、0.1M碳酸銨、0.1％(W/V)二乙基二硫代氨基甲酸鈉、1mM EDTA和1％(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)的溶液中，于65℃培養(yǎng)5分鐘，然后立即用水飽和的苯酚抽提，再用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提。最后用2.5體積的乙醇沉淀病毒RNAs并將其溶于重蒸水中。
實施例IIIcDNA和PCR基礎(chǔ)上的NP基因克隆依照Gubler和Hoffman[參見Gene 25263(1983)]描述的方法，用隨機引物，從純化的TSWV-BL RNAs中合成第一鏈cDNA。利用RNase H/DNA聚合酶處理樣品生產(chǎn)出第二鏈cDNA。然后，對所形成的雙鏈cDNA樣品利用蔗糖梯度離心進行大小分級、用EcoRI甲基化酶進行甲基化處理、并加上EcoRI接頭。cDNA樣品經(jīng)EcoRI酶切消化后，與載體pUC 18的EcoRI位點連接，其5′端磷酸基團經(jīng)小牛腸堿性磷酸化酶切除。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞(Bethesda Research Laboratories提供)，然后從含有50μg/ml氨芐青霉素、IPTG和X-gal的瓊脂平板培養(yǎng)基上首先挑選出含有TSWV cDNA插入片段的克隆。利用堿裂解法[參見BRL Focus 117(1989)]，從所挑選克隆中分離質(zhì)粒DNAs，再用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化提取的質(zhì)粒DNA并將DNA轉(zhuǎn)移至Gene Screen Plus尼龍濾器(DuPont)上，以確定插入片段的大小。利用與TSWV CPNH1 S RNA[參見J.Gen.Virol.71001(1990)]的核苷酸序列(GCAAGTTCTGCGAGTTTTGCCTGCT)互補的寡聚核苷酸(AGCAGGCAAAACTCGCAGAACTTGC)的32P標記物，與含有TSWV-BL S RNA cDNA插入片段的質(zhì)粒克隆雜交，以鑒定該質(zhì)?？寺　Ｔ诃傊悄z上鑒定并分析了數(shù)個克隆以確定插入片段的大小。發(fā)現(xiàn)pTSWVS-23克隆含有最大的cDNA插入片段，長度大約為1.7kb。
利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)獲得了全長的NP基因。第一鏈cDNA的合成是在37℃下進行30分鐘完成的，其中反應(yīng)混合液體積為20μl，并利用與TSWV NP基因5′端的S RNA互補(TSWV-CPNH1的核苷酸位置為2751至2773)的寡聚核苷酸引物JLS 90-46(5′-＞3′)AGCTAACCATGGTTAAGCTCACTAAGGAAAGC(也用于TSWV-10W核蛋白殼基因的合成)。反應(yīng)混合液含有1.5μg的病毒RNAs、1μg寡聚核苷酸引物、每種dNTP 0.2mM、1×PCR緩沖液(GeneAmp試劑盒，Perkin-Elmer-Cetus)、20U溶于核酸酶抑制劑(Promega)中的RNAs、2.5mM MgCl2和25U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)。在95℃加熱5分鐘并冰浴冷卻以終止反應(yīng)。然后按制造商的說明(Perkin-Elmer-Cetus)用10μl cDNA/RNA雜交反應(yīng)液經(jīng)PCR擴增NP基因，其中引物為1μg的寡聚核苷酸引物JLS 90-46和1μg寡聚核苷酸引物JLS 90-47(5′-＞3′)，AGCATTCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC(也用于TSWV-10W核蛋白殼基因的合成)，后者寡聚核苷酸引物與基因3′端非編碼區(qū)的S RNA相同(即TSWV-CPNH1的核苷酸位置1919至1938)。一圈典型的PCR反應(yīng)是92℃1分鐘(變性)、50℃1分鐘(退火)和72℃2分鐘(聚合)。反應(yīng)后的樣品直接上樣于1.2％的瓊脂糖凝膠上進行分離。然后從瓊脂糖凝膠中提取分離開的NP基因片段，并經(jīng)乙醇沉淀后溶于20μl的重蒸水中。
實施例IV植物表達與轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建經(jīng)實施例III凝膠分離到的NP基因片段用限制性內(nèi)切酶NcoI酶切消化，酶切是在50μl的反應(yīng)緩沖液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、0.1M NaCl]中于37℃進行反應(yīng)3小時，然后直接克隆到經(jīng)NcoI消化過的植物表達載體pB1525中。所構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)鑒定后標定為pB1525-NP+[在與花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子相關(guān)的有意義方向上]和pB1525-NP-[在反方向上]。經(jīng)上述插入NP基因片段的表達盒能否產(chǎn)生NP 是通過NP基因在煙草原生質(zhì)體中的瞬間表達來確定[按Pang等描述的方法參見Gene 112229(1992)]。由于NP基因含有內(nèi)源HindIII和EcoRI酶切位點，所以利用HindIII/EcoRI進行部分酶切，將含有NP基因的表達盒從pB1525-NP+上切割下來，然后連接到同樣酶切割過的植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.)上。形成的載體pBIN19-NP+和對照質(zhì)粒pBIN19依照Holsters等人描述的方法[參見Mol.Gen.Genet.163181(1978)]轉(zhuǎn)入到根瘤土壤桿菌LBA 4404中去。
按照Siemieniak等人[參見Analyt.Biochem.192441(1991)]描述的雙鏈測序法，利用雙脫氧核糖核苷酸法和T7聚合酶(美國生化試劑，SequenaseTM)，分析了pTSWV-23和Pb1525-NP+二個克隆中插入片段的核苷酸序列。核苷酸序列是通過分析二條DNA鏈來確定的，并利用遺傳計算機集團(GCG，Madison，W1)的計算機程序?qū)⑺_定的核苷酸序列與已公開的TSWV分離株CPNH1的序列進行比較分析。
也得到了NP基因在煙草原生質(zhì)體中的瞬間表達。利用大規(guī)模堿法，從克隆pTSWVS-23和pUC18cpphas TSWV-NP(含有PCR加工過的NP基因插入片段)分離質(zhì)粒DNA。利用NcoI酶消化從克隆pBIS25-NP+上切下PCR加工過的NP基因插入片段以利用可得的側(cè)寡聚核苷酸引物進行測序。表達盒pUC18cpphas與pUC18cpexp相似，只不過前者利用了來自Phaseolus Vulgaris種子貯藏菜豆蛋白基因的ploy(A)加尾信號。這些質(zhì)粒DNA經(jīng)Beckman Ti70.1固定角轉(zhuǎn)子超速離心后形成二個CsCl-溴化乙錠梯度條帶。利用雙脫氧核糖核苷酸和上述描述的雙鏈質(zhì)粒DNA測序法得到了DNA序列。將核苷酸序列反應(yīng)液于1米長的恒溫(55℃)測序膠上電泳，獲得了平均長約750bp的核苷酸序列讀數(shù)。為確保準確，核苷酸序列是由二個克隆插入片段的二條DNA鏈來確定的。利用計算機程序(GCG，Madison，WI)，將由TSWV-BL S RNA分離株所獲得的核苷酸序列信息，按以下提及的辦法與TSWV分離株CPNH 1和L3進行了比較分析。
如下所示為克隆cDNA的核苷酸與推導的氨基酸序列和TSWV-BLS RNA的PCR加工的插入片段以及這些序列與TSWV-CPHN1 S RNA的核苷酸序列的比較。利用Siemieniak的雙鏈雙脫氧核苷酸測序法測出了TSWV-BL S RNA克隆pTSWVS-23(TSWV-23)和pBI 525-NP+(TSWV-PCR)的核苷酸序列，并將它們的序列與GeneBankAccession No.D 00645中報道的TSWV-CPNH 1 S RNA的核苷酸序列的相關(guān)區(qū)域進行了比較。TSWV-CPNH 1 S RNA的核苷酸序列已由De Haan(1990)作了報道，并以下序列表示CAAGTTGAAA GCAACAACAG AACTGTAAAT TCTCTTGCAG TGAAATCTCT,50GCTCATGTCA GCAGAAAACA ACATCATGCC TAACTCTCAA GCTTCCACTG100ATTCTCATTT CAAGCTGAGC CTCTGGCTAA GGGTTCCAAA GGTTTTGAAG150CAGGTTTCCA TTCAGAAATT GTTCAAGGTT GCAGGAGATG AAACAAACAA200AACATTTTAT TTATCTATTG CCTGCATTCC AAACCATAAC AGTGTTGAGA250CAGCTTTAAA CATTACTGTT ATTTGCAAGC ATCAGCTCCC AATTCGCAAA300TGCAAAGCTC CTTTTGAATT ATCAATGATG TTTTCTGATT TAAAGGAGCC350TTAACAACTT GTTCATGACC CTTCATACCC CAAAGGATCG GTTCCAATGC400TCTGGCTCGA AACTCACACA TCTTTGCACA AGTTCTTTGC AACTAACTTG450CAAGAAGATG TAATCATCTA CACTTTGAAC AACCTTGAGC TAACTCCTGG500AAAGTTAGAT TTAGGTGAAA GAACCTTGAA TTACAGTGAA GATGCCTACA550AAAGGAAATA TTTCCTTTCA AAAACACTTG AATGTCTTCC ATCTAACACA600CAAACTATGT 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Ala Val Lys5 10 15Ser Leu Leu Met Ser Ala Glu Asn Asn Ile Met Pro Asn Ser Gln20 25 30Ala Ser Thr Asp Ser His Phe Lys Leu Ser Leu Trp Leu Arg Val35 40 45Pro Lys Val Leu Lys Gln Val Ser Ile Gln Lys Leu Phe Lys Val50 55 60Ala Gly Asp Glu Thr Asn Lys Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys65 70 75Ile Pro Asn His Asn Ser Val Glu Thr Ala Leu Asn Ile Thr Val80 85 90Ile Cys Lys His Gln Leu Pro Ile Arg Lys Cys Lys Ala Pro Phe95 100 105Glu Leu Ser Met Met Phe Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Ile110 115 120Val His Asp Pro Ser Tyr Pro Lys Gly Ser Val Pro Met Leu Trp125 130 135Leu Glu Thr His Thr Ser Leu His Lys Phe Phe Ala Thr Asn Leu140 145 150Gln Glu Asp Val Ile Ile Tyr Thr Leu Asn Asn Leu Glu Leu Thr155 160 165Pro Gly Lys Leu Asp Leu Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu170 175 180Asp Ala Tyr Lys Arg Asp Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys185 190 195Leu Pro Ser Asn Thr Gln Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln200 205 210Ile Pro Ser Trp Lys Ile Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Lys Ile215 220 225Ser Pro Gln Ser Ile Ser Val Ala Lys Ser Leu Leu Lys Leu Asp230 235 240Leu Ser Gly Ile Lys Lys Lys Glu Ser Lys Val Lys Glu Ala Tyr245 250 255Ala Ser Gly Ser Lys260將以下列出的TSWV-23核苷酸序列與上述給出的TWSV序列進行細致比較后發(fā)現(xiàn)，它含有半數(shù)的非結(jié)構(gòu)基因和-半的核蛋白殼蛋白基因。AAATTCTCTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA 50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT200CTATTGCCTG CATTCCAAAC CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC350ATGATCCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG 500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT 550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACTA TGTCTTATTT 600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA 650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT 700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC 750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT 800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT 850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA 900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA 950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGCA AACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCACA AACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGC TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTGCAAACTT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGAATCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT 1700CAGAATTCC 1709以下列出的本發(fā)明TSWV-PCR的核酸序列也與上述TSWV序列進行了細致比較，發(fā)現(xiàn)該序列含蓋了整個核蛋白殼蛋白基因。TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA GATAAAGAAA GCTTTATATA 50TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT 100GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC ATTTCATAGA ACTTGTTAAG 150GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT TCCTTTAGCA TTAGGATTGC 200TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC CCTTCTTCAC CTGATCTTCA 250TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA GTGCAAACTT TTCCTAAGGC 300TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT CCCGAGATCC TTGTATTTTG 350CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA TCATCTCAAA GCTATCAACT 400GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC ATTATGGCAA GCCTCACAGA 450CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC TTGACTCAAA GGGTGGGAAG 500CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT CAGAATTCCC AGTTTCCTCA 550ACAAGCCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC CTTCTGAAGG TCATGTCAGT 600GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT GGTAATTTTA CCAAAAGTAA 650AATCGCTTTG CTTAATAACC TTCATTATGC TCTGACGATT CTTCAGGAAT 700GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG ATCTGGTCAA GGTTTTCCAG 750ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG ATTCTGATCT TCCTCAAACT 800CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA CAATGCTTTC CTTAGTGAGC 850TTAACCAT 858綜合分析發(fā)現(xiàn)，克隆TSWV-23插入片段重疊了TSWV-PCR插入片段，它們兩者代表了本發(fā)明TSWV-BL S RNA的2028個核苷酸。本發(fā)明的這2028個核苷酸序列含有部分的非結(jié)構(gòu)基因和整個核蛋白殼蛋白基因。兩者結(jié)合后的序列如下AAATTCACTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG 100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA 150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT 200CTATTGCCTG CATTCCAAAC CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT 250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT 300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC 350ATGATCCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC 400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT 450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG 500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT 550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACTA TGTCTTATTT 600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA 650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT 700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC 750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGC AAACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGC TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTTGCAAACT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGACTCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT 1700CAGAATTCCC AGTTTCCTCA ACAAAGCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC 1750CTTCTGAAGG TCATGTCAGT GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT 1800GGTAATTTTA CCAAAAGTAA AATCGCTTTG CTTAATAACC TTCATTATGC 1850TCTGACGATT CTTCAGGAAT GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG 1900ATCTGGTCAA GGTTTTCCAG ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG 1950ATTCTGATCT TCCTCAAACT CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA 2000CAATGCTTTC CTTAGTGAGC TTAACCAT 2028通過比較表明，克隆pTSWVS-23的cDNA插入片段包括約760bp的52K蛋白病毒組成基因、完整的基因間區(qū)(4926bp)以及450bp的NP基因(約半個NP基因長度)。這個克隆插入片段含有3′端，并恰好位于EcoRI識別位點，這意味著在cDNA克隆過程中會形成不完整的EcoRI甲基化。盡管該克隆不合有完整的TSWV-BL NP基因，但其序列具有相當重要的意義，這是因為它與PCR加工的NP基因序列有450bp的重疊(全長為2028bp的TSWV-BL S RNA位于TSWV的核苷酸序列中)。該TSWV-BL PCR加工的和TSWV-CPNH 1 NP基因之間的序列比較，表明總共有21個核苷酸不同(2.7％)，其中8個編碼氨基酸替換(3.1％)。由于這個PCR加工的NP基因是通過Taq聚合酶所獲得的，而這是公認會形成突變的，所以，可能有些差異是在PCR擴增過程中形成的。不過，這些核苷酸差異中的15個被定位于TSWV-BL cDNA與PCR克隆之間的重疊區(qū)內(nèi)，而且，除一個以外，全部這些核苷酸差異(TSWV的位置1702；TSWV-PCR的位置485)由這兩個TSWV-BL S RNA衍生克隆所共享。這一比較清楚地表明，這二個克隆的NP基因區(qū)域核苷酸序列的差異性，如果有的話，也不完全是由PCR擴增所形成的。位置1702的核苷酸差異導致了氨基酸由絲氨酸替換亮氨酸，并且甚至這種差異可能是TSWV-BL分離株內(nèi)缺乏均一性所形成的。
實施例V土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化用含有載體pBIN 19-NP+或?qū)φ召|(zhì)粒pBIN 19的土壤桿菌LBA4404(ClonTech)接種煙草var Havana cv 423的葉盤，即浸于含該土壤桿菌的液體培養(yǎng)基中過夜，然后將培養(yǎng)過的葉盤轉(zhuǎn)入不含選擇劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天[參見Science 2271229(1985)]。將轉(zhuǎn)化的細胞團挑選出來，轉(zhuǎn)入含300μg/ml卡那霉素和500μg/ml羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中，以使莖再生。將長出的小植株轉(zhuǎn)入不含激素的培養(yǎng)基中以誘導根的生長。再將生根的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)入土壤中并于溫室條件下生長。MS培養(yǎng)基含有完全的MS鹽(Sigma)、30g/L蔗糖、1mg/L BA和1ml B5維生素[1mg/ml煙酸、10mg/ml硫胺素(HCl)、1mg/ml維生素B6(HCl)及100mg/ml肌醇]。轉(zhuǎn)基因植株進行自花受精，并將所獲得的種子在加有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇性地萌發(fā)。
實施例VI蛋白質(zhì)的血清學測定利用雙抗夾層酶鏈免疫吸附分析(DAS-ELISA)技術(shù)檢測了含有TSWV-BL NP多克隆抗體的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)NP基因的表達。每個樣品都是取植株頂部第二葉的葉盤(約0.05克)，于3ml酶連接反應(yīng)緩沖液[磷酸鹽緩沖鹽水、0.05％吐溫20、2％聚乙烯吡咯烷酮40和0.2％卵清蛋白]中磨碎。對于煙草原生質(zhì)體，離心后的細胞提取物直接用于分析。在做DAS-ELISA前不久，將轉(zhuǎn)基因植株和煙草原生質(zhì)體的樣品稀釋10倍和3倍。
為做Western雜交，取葉盤(約0.05克)于0.25毫升2×SDS/樣品緩沖液
，并在濃度為2μg/ml用于Western雜交。
利用TSWV-BL病毒粒子或TSWV-BL的NP或TSWV-1所獲得的抗體并根據(jù)DAS-ELISA技術(shù)，對TSWV分離株(TSWV-BL，Arkansas，10W pakchoy，Begonia或Brazil)進行了血清反應(yīng)分析。
實施例VII用TSWV分離株接種轉(zhuǎn)基因植株用不同的TSWV分離株感染Nicotiana benthamiana Domin制備接種物(Inocula)，并將感染的N.benthamiana的植株(接種后1～2周的)的葉片(0.5g)于15ml緩沖液
。Begonia分離株對TSWV-I(“I”血清型)的NP抗體有強烈的反應(yīng)，但對TSWV-BL NP的抗體無反應(yīng)，因此它屬于“I”血清型。Brazil分離株對TSWV-BL或TSWV-I的NP血清型的抗體無可檢測反應(yīng)，它對TSWV-BL的全病毒粒子抗體反應(yīng)微弱。而且，這個分離株能在感染的煙草和N.benthamiana葉片上引發(fā)整株斑駁病和皺葉病，但不會感染西葫蘆或黃瓜，這表明該分離株與葫蘆分離親緣關(guān)系遠。這些結(jié)果表明這個分離株可被看成一個第三血清型。
在含卡那霉素培養(yǎng)基上萌發(fā)來自7個R0代株系的小苗，再用上述的TSWV分離株感染接種。從接種后第七天開始每日記錄感染的數(shù)據(jù)。如果病毒癥狀在未接種感染的葉片上能觀察到，則估計用TSWV-BL，Arkansas，10W pakchoy或Brazil分離株接種的植株是易感染的。因為這個分離株不會導致煙草的整株感染，如果在接種感染的葉片上觀察到局部損傷，則認為用Begonia分離株接種的植株是易感染的。所有接種過的對照NP(-)R1代植株對這5個分離株感染都表現(xiàn)出敏感性。除接種Begonia的轉(zhuǎn)基因R1代植株在接種葉片上僅產(chǎn)生局部損傷外，它們都是在接種感染12天后表現(xiàn)出整株感染。然而，幾乎所有NP(+)R1代植株都是高抗同源分離株TSWV-BL，而很小百分比的NP(+)R1代植株抗異源分離株Arkansas、10W pakchoy和Begonia。另一方面，來自7個轉(zhuǎn)基因植株系的所有NP(+)R1代植株都對Brazil分離株敏感，盡管在一些來自品系NP(+)4的高NP表達NP(+)R1代植株中觀察到植株的癥狀表現(xiàn)有輕微延遲(1～2天)。
抗性R1代植株在其整個生長周期內(nèi)都未表現(xiàn)出病癥。通過對Chenopodium quinoa植株葉片重復接種，檢測在17個癥狀較輕的NP(+)植株的接種過的葉片上病毒的存在。從無癥狀的NP(+)植株的接種過的葉片上未發(fā)現(xiàn)病毒，這意味著病毒在這些NP(+)植株上不能復制或傳播。
對轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)NP累積水平與抗異源TSWV分離株的抗性水平之間的關(guān)系也做了研究。對上述數(shù)據(jù)的分析表明，具有低水平NP的R0代植株系所衍生的R1代植株對“L”血清型的異源分離株(Arkansas和10W pakchoy)具有最佳抗性，而具有高水平NP的R0代植株系所衍生的R1代植株抗Begonia分離株，這個分離株屬于“I”血清型。例如，平均76％的來自低NP表達水平株系NP(+)2、14和21的接種過的R1代植株抗Arkansas和10W pakchoy分離株的感染，而來自高NP表達水平株系NP(+)4、9和23的類似接種植株，其中只有11％觀察到對這些分離株有抗性。另一方面，Begonia分離株感染79％的來自低NP表達水平株系NP(+)2、14和21的R1代植株，但只感染19％來自高NP表達水平株系NP(+)4的R1代植株。
因此，可以得出如下結(jié)論表達低水平NP基因的轉(zhuǎn)基因R1代植株對分離株10W pakchoy(“L”血清型)的感染有高度的抗性，但對Begonia分離株(“I”血清型)則沒有抗性。相反，NP高表達的R1代植株對Begonia分離株的感染有高度抗性，但不抗10Wpakchoy分離株的感染。
這樣，準確定量抗異源分離株的單個植株NP表達水平的關(guān)系是相當重要的。本文報導的許多接種實驗中，轉(zhuǎn)基團植株的葉片試樣是在Arkansas和10W pakchoy分離株接種前取樣的。在觀察到NP表達水平與抗性水平之間明顯相關(guān)后，也從Begonia分離株接種的植株的非接種葉片上取樣。后一種取樣方法可以在沒有Begonia分離株感染干擾的情況下進行，這是因為這個分離株在煙草上既不會引發(fā)整株感染，也不對TSWV-BL NP抗體有反應(yīng)。利用分離的TSWV-BL的NP產(chǎn)生的抗體，通過DAS-ELISA技術(shù)，分析所有樣品有關(guān)的NP水平。圖5和圖6表明在轉(zhuǎn)基因R1代植株(不考慮產(chǎn)生它們的R0代植株系)的NP水平與它們抗Arkansas和10W pakchoy分離株或Begonia分離株之間的關(guān)系。幾乎所有具有很低或難以檢測的ELISA反應(yīng)(0-0.05 OD405nm)的轉(zhuǎn)基因R1代植株均抗Arkansas和10W pakchoy分離株(“L”血清型)的感染，但對Begonia分離株(“I”血清型)敏感。相反，幾乎所有產(chǎn)生高ELISA反應(yīng)(0.4-1.0 OD405nm)的R1代植株抗Begonia分離株，但對Arkansas和10W pakchoy分離株敏感。
利用一種混合方法，從用TSWV-B感染的N.benthamiana植株中分離雙鏈(ds)RNA，該方法已成功地用于從葡萄卷葉病毒感染的組織中提取dsRNA[參見Acta Horticulturae 18651(1986)，和Can.Plant Dis Surv 6893(1988)]。選擇dsRNA用于cDNA合成，是因為從這種分離株中分離病毒顆粒還不可能[參見PlantDisease 74154(1990)]。為了構(gòu)建TSWV-B的S RNA的cDNA文庫，從凝膠中分離純化雙鏈S RNA，然后通過甲基-汞處理變性純化雙鏈S RNA，再利用隨機引物并按Promega提供的cDNA合成程序合成cDNA。所合成的cDNA片段通過一個EcoRI銜接頭被克隆到EcoRI消化過的λZAPII(Strategene)，然后利用由凝膠純化的S RNA的反轉(zhuǎn)錄所制備的cDNA探針，通過克隆雜交鑒定陽性克隆。在瓊脂糖凝膠上分析了許多陽性克隆，其中只有3個含有最大插入片段(L1，L22和L30)的重疊克隆被挑選出來(參見圖3)，它們覆蓋幾乎完整的TSWV-B S RNA。
先是通過通用和反向引物，然后是通過內(nèi)部引物[用于TSWV-B的S RNA的測序]，從兩條DNA鏈測定克隆L1、L22和L30的插入片段的核苷酸序列。測序采用Sanger的雙脫氧核糖核苷酸法、T7聚合酶(美國生化試劑，SequenaseTM)和Siemieniak描述的雙鏈測序程序[參見Analyt.Biochem.192441(1991)]。這些克隆的測序分析揭示了插入片段分別為1.994kb、2.368kb和1.576kb，而且這些序列代表了S RNA基因組的93％(見圖3)。利用GeneticsComputer Group(GCG，Madison，W1)的計算機程序并通過與TSWV分離株CONH 1、L3、I和BL的序列比較，分析了該組裝序列。
計算機分析表明2.842kb的組裝序列覆蓋了完整的52K非結(jié)構(gòu)蛋白基因、完整的基因區(qū)域(629kb)和737bp的NP基因(只有N基因39個N端核苷酸未被覆蓋)。為獲得N基因的這個丟失區(qū)域，多聚核苷酸激酶對引物TTCTGGTCTTCTTCAAACTCA(與N基因起始密碼子一段62個核苷酸的序列相同)進行末端標記，以篩選上述的cDNA文庫。得到5個推定的克隆。5個克隆的序列分析表明，只有克隆S6和S7包含了N基因的39個丟失的核苷酸。S7克隆也包括S RNA的3′末端。
利用5′RACE系統(tǒng)(GIBCO)獲得了S RNA的5′末端。將從被TSWV-B感染的煙草中分離的TSWV-B ssRNA和總RNA用于cDNA第一鏈的合成，該鏈與TSWV-B S RNA上核苷酸位置746-763的寡聚核苷酸(5′-CTGTAGCCATGAGCAAAG)互補。利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在cDNA第一鏈的3′端加尾dCTP。加尾cDNA然后通過PCR擴增，使用引物是一個能與多聚尾部退火的錨式(anshor)引物以及一個能與TSWV-B S RNA的核苷酸位置512-529退火的寡聚核苷酸(5′-TTATATCTTCTTCTTGGA)。PCR擴增的片段經(jīng)凝膠純化后直接克隆到T載體pT7Blue(Novagen)上，然后測序。利用一個寡聚核苷酸引物測序了8個獨立克隆。該引物(5′-GTTCTGAGATTTGCTAGT)緊靠SRNA的5′端區(qū)(TSWV-B S RNA的核苷酸位置是40-57)。所得克隆中的6個含有S RNA的5′末端，這些克隆的5′末端核苷酸序列是相同的。這樣，TSWV-B S RNA完整的核苷酸序列長度為3049個核苷酸。
這兩個克隆，加上以前測序過的三個克隆(L1、L22、L30、S6和S7)，覆蓋了以上描述的總長為3032個核苷酸。對TSWV-CPNH1和TSWV-I的末端序列進行比較發(fā)現(xiàn)，雖然在組裝好的序列中未反映出5′末端的18個核苷酸，但是TSWV-B S RNA 3′末端區(qū)與TSWV-I S RNA的3′末端區(qū)是相同的，并且與TSWV-CPNH1的3′末端區(qū)相比，15個核苷酸中僅有1個有差異。TSWV分離株的末端序列的保守性與布尼安病毒科屬的其它成員的保守性相一致。這支持了以下假說末端序列有可能形成穩(wěn)定的堿基對結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)涉及到其復制和包裝。
根據(jù)本發(fā)明TSWV-B(以上討論過的Brazilian分離株)的SRNA基因組的完整核苷酸序列為AGAGCAATTG GGTCATTTTT TATTCTAAAT CGAACCTCAA CTAGCAAATC 50TCAGAACTGT AATAAGCACA AGAGCACAAG AGCCACAATG TCGACATGCA100TTTATGAATC GATCATTCAG ACAAAGGCTT CAGTTTGGGG ATCGACAGCA150TCTGGTAAGT CCATCGTGGA TTCTTACTGG ATTTATGAGT TTCCAACTGG200TTCTCCACTG GTTCAAACTC AGTTGTACTC TGATTCGAGG AGCAAAAGTA250GCTTCGGCTA CACTTCAAAA ATTGGTGATA TTCCTGCTGT AGAGGAGGAA300ATTTTATCTC AGAACGTTCA TATCCCAGTG TTTGATGATA TTGATTTCAG350CATCAATATC AATGATTCTT TCTTGGCAAT TTCTGTTTGT TCCAACACAG400TTAACACCAA TGGAGTGAAG CATCAGGGTC ATCTTAAAGT TCTTTCTCTT450GCCCAATTGC ATCCCTTTGA ACCTGTGATG AGCAGGTCAG AGATTGCTAG500CAGATTCCGG CTCCAAGAAG AAGATATAAT TCCTGATGAC AAATATATAT550CTGCTGCTAA CAAGGGATGT CTCTCCTGTG TCAAAGAACA TACTTACAAA600GTCGAAATGA GCCACAATCA GGCTTTAGGC AAAGTGAATG TTCTTTCTCC650TAACAGAAAT GTTCATGAGT GGCTGTATAG TTTCAAACCA AATTTCAACC700AGATCGAAAG TAATAACAGA ACTGTAAATT CTCTTGCAGT CAAATCTTTG750CTCATGGCTA CAGAAAACAA CATTATGCCT AACTCTCAAG CTTTTGTTAA800AGCTTCTACT GATTCTCATT TTAAGTTGAG CCTTTGGCTG AGAATTCCAA850AAGTTTTGAA GCAAATAGCC ATACAGAAGC TCTTCAAGTT TGCAGGAGAC900GAAACCGGTA AAAGTTTCTA TTTGTCTATT GCATGCATCC CAAATCACAA950CAGTGTGGAA ACAGCTTTAA ATGTCACTGT TATATGTAGA CATCAGCTTC1000CAATCCCTAA GTCCAAAGCT CCTTTTGAAT TATCAATGAT TTTCTCCGAT1050CTGAAAGAGC CTTACAACAC TGTGCATGAT CCTTCATATC CTCAAAGGAT1100TGTTCATGCT TTGCTTGAGA CTCACACTTC CTTTGCACAA GTTCTCTGCA1150ACAAGCTGCA AGAAGATGTG ATCATATATA CTATAAACAG CCCTGAACTA1200ACCCCAGCTA AGCTGGATCT AGGTGAAAGA ACCTTGAACT ACAGTGAAGA1250TGCTTCGAAG AAGAAGTATT TTCTTTCAAA AACACTCGAA TGCTTGCCAG1300TAAATGTGCA GACTATGTCT TATTTGGATA GCATCCAGAT TCCTTCATGG1350AAGATAGACT TTGCCAGAGG AGAGATCAGA ATCTCCCCTC AATCTACTCC1400TATTGCAAGA TCTTTGCTCA AGCTGGATTT GAGCAAGATC AAGGAAAAGA1450AGTCCTTGAC TTGGGAAACA TCCAGCTATG ATCTAGAATA AAAGTGGCTC 1500ATACTACTCT AAGTAGTATT TGTCAACTTG CTTATCCTTT ATGTTGTTTA 1550TTTCTTTTAA ATCTAAAGTA AGTTAGATTC AAGTAGTTTA GTATGCTATA 1600GCATTATTAC AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAATATAA 1650AAAACCCAAA AAGATCCCAA AAGGGACGAT TTGGTTGATT TACTCTGTTT 1700TAGGCTTATC TAAGCTGCTT TTGTTTGAGC AAAATAACAT TGTAACATGC 1750AATAACTGGA ATTTAAAGTC CTAAAAGAAG TTTCAAAGGA CAGCTTAGCC 1800AAAATTGGTT TTTGTTTTTG TTTTTTTGTT TTTTGTTTTT TTGTTTTATT 1850TTTATTTTTA GTTTATTTTT TGTTTTTGTT ATTTTTATTT TTATTTTATT 1900TTCTTTTATT TTATTTATAT ATATATCAAA CACAATCCAC ACAAATAATT 1950TTAATTTCAA ACATTCTACT GATTTAACAC ACTTAGCCTG ACTTTATCAC 2000ACTTAACACG CTTAGTTAGG CTTTAACACA CTGAACCTAA TTAAAACACA 2050CTTAGTATTA TGCATCTCTT AATTAACACA CTTTAATAAT ATGCATCTCT 2100GAATCAGCCT TAAAGAAGCT TTTATGCAAC ACCAGCAATC TTGGCCTCTT 2150TCTTAACTCC AAACATTTCA TAGAATTTGT CAAGATTATC ACTGTAATAG 2200TCCATAGCAA TGCTTCCCTT AGCATTGGGA TTGCAAGAAC TAAGTATCTT 2250GGCATATTCT TTCCCTTTGT TTATCTGTGC ATCATCCATT GTAAATCCTT 2300TGCTTTTAAG CACTGTGCAA ACCTTCCCCA GAGCTTCCTT AGTGTTGTAC 2350TTAGTTGGTT CAATCCCTAA CTCCTTGTAC TTTGCATCTT GATATATGGC 2400AAGAACAACA CTGATCATCT CGAAGCTGTC AACAGAAGCA ATGAGAGGGA 2450TACTACCTCC AAGCATTATA GCAAGTCTCA CAGATTTTGC ATCTGCCAGA 2500GGCAGCCCGT AAGCTTGGAC CAAAGGGTGG GAGGCAATTT TTGCTTTGAT 2550AATAGCAAGA TTCTCATTGT TTGCAGTCTC TTCTATGAGC TTCACTCTTA 2600TCATGCTATC AAGCCTCCTG AAAGTCATAT CCTTAGCTCC AACTCTTTCA 2650GAATTTTCTT TTATCGTGAC CTTACCAAAA GTAAAATCAC TTTGGTTCAC 2700AACTTTCATA ATGCCTTGGC GATTCTTCAA GAAAGTCAAA CATGAAGTGA 2750TACTCATTTT CTTAATCAGG TCAAGATTTT CCTGACAGAA AGTCTTAAAG 2800TTGAATGCGA CCTGGTTCTG GTCTTCTTCA AACTCAACAT CTGCAGATTG 2850AGTTAAAAGA GAGACAATGT TTTCTTTTGT GAGCTTGACC TTAGACATGG 2900TGGCAGTTTA GATCTAGACC TTTCTCGAGA GATAAGATTC AAGGTGAGAA 2950AGTGCAACAC TGTAGACCGC GGTCGTTACT TATCCTGTTA ATGTGATGAT 3000TTGTATTGCT GAGTATTAGG TTTTTGAATA AAATTGACAC AATTGCTCT 3049根據(jù)本發(fā)明，非結(jié)構(gòu)(以上單劃線部分)與核蛋白殼蛋白的推導氨基酸序列如下Met Ser Ser Gly Val Tyr Glu Ser Ile Ile Gln Thr Lys Ala Ser5 10 15Val Trp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Lys Ser Ile Val Asp Ser Tyr20 25 30Trp Ile Tyr Glu Phe Pro Thr Gly Ser Pro Leu Val Gln Thr Gln35 40 45Leu Tyr Ser Asp Ser Arg Ser Lys Ser Ser Phe Gly Tyr Thr Ser50 55 60Lys Ile Gly Asp Ile Pro Ala Val Glu Glu Glu Ile Leu Ser Gln65 70 75Asn Val His Ile Pro Val Phe Asp Asp Ile Asp Phe Ser Ile Asn80 85 90IleAsn Asp Ser PheLeu Ala Ile Ser Val Cys Ser Asn Thr Val95 100 105Asn Thr Asn Gly Val Lys His Gln Gly His Leu Lys Val Leu Ser110 115 120Leu Ala Gln Leu His Pro Phe Glu Pro Val Met Ser Arg Ser Glu125 130 135Ile Ala Ser Arg Phe Arg Leu Gln Glu Glu Asp Ile Ile Pro Asp140 145 150Asp Lys Tyr Ile Ser Ala Ala Asn Lys Gly Ser Leu Ser Cys Val155 160 165Lys Glu His Thr Tyr Lys Val Glu Met Ser His Asn Gln Ala Leu170 175 180Gly Lys Val Asn Val Leu Ser Pro Asn Arg Asn Val His Glu Trp185 190 195Leu Tyr Ser Phe Lys Pro Asn Glu Asn Gln Ile Glu Ser Asn Asn200 205 210Arg Thr ValAsn Ser Leu Ala Val Lys Ser Leu Leu Met Ala Thr215 220 225Glu Asn Asn Ile Met Pro Asn Ser Gln Ala Phe Val Lys Ala Ser230 235 240Thr Asp Ser His Phe Lys Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ile Pro Lys245 250 255Val Leu Lys Gln Ile Ala Ile Gln Lys Leu Phe Lys Phe Ala Gly260 265 270Asp Glu Thr Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys Ile Pro275 280 285Asn His Asn Ser Val Glu Thr Ala LeuAsn Val Thr ValIle Cys290 295 300Arg His Gln Leu Pro Ile Pro Lys Ser Lys Ala Pro Phe Glu Leu305 310 315Ser Met Ile Phe Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Thr Val His320 325 330Asp Pro Ser Tyr Pro Gln Arg Ile Val His Ala Leu Leu Glu Thr335 340 345His Thr Ser Phe Ala Gln Val Leu Cys Asn Lys Leu Gln Glu Asp350 355 360Val Ile Ile Tyr Thr Ile Asn Ser Pro Glu Leu Thr Pro Ala Lys365 370 375Leu Asp Leu Gly Glu Arg Thr LeuAsn Tyr Ser GluAsp Ala Ser380 385 390Lys Lys Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys Leu Pro Val395 400 405Asn Val Gln Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln Ile Pro Ser410 415 420Trp Lys Ile Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Arg Ile Ser Pro Gln425 430 435Ser Thr Pro Ile Ala Arg Ser Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Lys440 445 450Ile Lys Glu Lys Lys Ser Leu Thr Trp Glu Thr Ser Ser Tyr Asp455 460 465Leu Glu；和Met Ser Lys Val Lys Leu Thr Lys Glu Asn Ile Val Ser Leu Leu5 10 15Thr Gln Ser Ala Asp Val Glu Phe Glu Glu Asp Gln Asn Gln Val20 25 30Ala Phe Asn Phe Lys Thr Phe Cys Gln Glu Asn Leu Asp Leu Ile35 40 45Lys Lys Met Ser Ile Thr Ser Cys Leu Thr Phe Leu Lys Asn Arg50 55 60Gln Gly Ile Met Lys Val ValAsn Gln Ser AspPhe Thr Phe Gly65 70 75Lys Val Thr Ile Lys Lys Asn Ser Glu Arg Val Gly Ala Lys Asp80 85 90Met Thr Phe Arg Arg Leu Asp Ser Met Ile Arg Val Lys Leu Ile95 100 105Glu Glu Thr Ala Asn Asn Glu Asn Leu Ala Ile Ile Lys Ala Lys110 115 120Ile Ala Ser His Pro Leu Val Gln Ala Tyr Gly Leu Pro Leu Ala125 130 135Asp Ala Lys Ser Val Arg Leu Ala Ile Met Leu Gly Gly Ser Ile140 145 150Pro Leu Ile Ala Ser Val Asp Ser Phe Glu Met Ile Ser Val Val155 160 165Leu Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Ile Glu170 175 180Pro Thr Lys Tyr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Gly Lys Val Cys Thr185 190 195Val Leu Lys Ser Lys Gly Phe Thr Met Asp Asp Ala Gln Ile Asn200 205 210Lys Gly Lys Glu Tyr Ala Lys Ile Leu Ser Ser Cys Asn Pro Asn215 220 225Ala Lys Gly Ser Ile Ala Met Asp Tyr Tyr Ser Asp Asn Leu Asp230 235 240Lys Phe Tyr Glu Met Phe Gly Val Lys Lys Glu Ala Lys Ile Ala245 250 255Gly Val Ala由于以上描述的核蛋白殼蛋白基因是在病毒互補鏈上，TSWV-B的核蛋白殼蛋白基因如下ATG TCT AAG GTC AAG CTC ACA AAA GAA AAC ATT GTC TCT CTT TTA 45ACT CAA TCT GCA GAT GTT GAG TTT GAA GAA GAC CAG AAC CAG GTC 90GCA TTC AAC TTT AAG ACT TTC TGT CAG GAA AAT CTT GAC CTG ATT 135AAG AAA ATG AGT ATC ACT TCA TGT TTG ACT TTC TTG AAG AAT CGC 180CAA GGC ATT ATG AAA GTT GTG AAC CAA AGT GAT TTT ACT TTT GGT 225AAG GTC ACG ATA AAG AAA AAT TCT GAA AGA GTT GGA GCT AAG GAT 270ATG ACT TTC AGG AGG CTT GAT AGC ATG ATA AGA GTG AAG CTC ATA 315GAA GAG ACT GCA AAC AAT GAG AAT CTT GCT ATT ATC AAA GCA AAA 360ATT GCC TCC CAC CCT TTG GTC CAA GCT TAC GGG CTG CCT CTG GCA 405GAT GCA AAA TCT GTG AGA CTT GCT ATA ATG CTT GGA GGT AGT ATC 450CCT CTC ATT GCT TCT GTT GAC AGC TTC GAG ATG ATC AGT GTT GTT 495CTT GCC ATA TAT CAA GAT GCA AAG TAC AAG GAG TTA GGG ATT GAA 540CCA ACT AAG TAC AAC ACT AAG GAA GCT CTG GGG AAG GTT TGC ACA 585GTG CTT AAA AGC AAA GGA TTT ACA ATG GAT GAT GCA CAG ATA AAC 630AAA GGG AAA GAA TAT GCC AAG ATA CTT AGT TCT TGC AAT CCC AAT 675GCT AAG GGA AGC ATT GCT ATG GAC TAT TAC AGT GAT AAT CTT GAC 720AAA TTC TAT CAA ATG TTT GGA GTT AAG AAA GAG GCC AAG ATT GCT 765GGT GTT GCA TAA 777TSWV-B的完整S RNA全長應(yīng)是3049個核苷酸，比TSWV-CPNH1的S RNA長134個核苷酸。這一差異主要是因為TSWV-B S RNA的基因間區(qū)域拉長了。對TSWV-B S RNA的測序區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)了兩個正如以上描述過的開放閱讀框，這與其它TSWV分離株的相似。較大的一個位于病毒RNA鏈，起始于核苷酸位置88，終止于核苷酸位置1491。病毒互補鏈上較小的一個閱讀框由一個起始于核苷酸位置2898的起始密碼子和一個核苷酸位置為2122的終止密碼子所確定。這二個開放閱讀框被一個長為629個核苷酸的基因間區(qū)域所分隔開。下表中比較了完整測序的TSWV-B S RNA與其它分離株的sRNA區(qū)，表中描述了通過將TSWV-B S RNA排列的核苷酸和氨基酸序列與其它分離株的相應(yīng)序列比較所得到的同源性百分率
綜合53K 蛋白基因基因間區(qū)29K 蛋白基因比較ant ntaa nt ntaaB/CPNH1 76.4b80.0 86.1(78.3)c72.4 77.5 91.5(79.1)B/L3 75.8 79.0 89.0(82.0) 76.4 78.0 91.1(79.9)B/BL 76.3 - -72.8 77.6 90.3(79.5)B/I 63.0 - -- 63.1 69.7(55.3)CPNH1/L3 94.8 95.6 92.0(89.4) 89.2 96.8 99.6(98.5)CPNH1/BL 96.4 - -95.9 97.2 98.8(96.9)CPNH1/I 62.7 - -- 60.8 69.5(55.1)L3/BL 95.1 - -92.6 97.3 99.2(98.5)L3/I 60.9 - -- 60.9 69.5(55.1)I/BL 61.7 - -- 60.9 68.8(53.9)a.將分離株TSWV-CPNH1(2.916kb)、TSWV-L3(2.837kb)、TSWV-BL(2.037kb)和TSWV-I(1.144kb)的部分或全長S RNA序列與TSWV-B(3.049kb)的S RNA序列進行比較。b.利用GCG序列分析軟件的BESTFIT程序，通過比較它們的核苷酸序列或推導的氨基酸序列，求算出相似程度的百分率。c.括號內(nèi)是相同的百分率。
如上所描述，用L型分離株(CHNH1、L3和BL)顯示了最大的核苷酸序列相似程序(75.8％～76.4％)。從較小的程序上看，在TSWV-B S RNA與被指定為I血清型的TSWV-I S RNA之間存在核苷酸序列相似性(63％)。比較而言，L型分離株(CHPN1、L3和BL)的已測序S RNA區(qū)享有94.8％-96.4％的核苷酸序列相似性。
777核苷酸的開放閱讀框編碼258個氨基酸的N蛋白，該蛋白預計分子量為28700 Da。來自TSWV分離株的N開放閱讀框的序列比較反映出，分離株CPNH1，L3和BL的N基因核苷酸序列與TSWV-B的的差異(22％-22.5％)比它們彼此之間的差異(2.7％-3.2％)大得多。與免疫生物學分析結(jié)果相一致，CPNH1，L3和BL分離株間的N氨基酸序列彼此間更緊密相關(guān)(相似程度為98.8％-99.6％或相同程度為96.9％-98.5％)，與TSWV-B相比則差距較遠(相似程度為90.3％-91.5％或相同程度為79.1％-79.9％)。而與TSWV-I相比，無論是核苷酸水平上(63.1％)還是氨基酸水平(相似程度為69.7％或相同程度為55.3％)上都是具有較低的同源性。除編碼262個氨基酸的TSWV-I的N開放閱讀框外，其它分離株的N開放閱讀框還編碼258個氨基酸。計算機分析認為TSWV-I N開放閱讀框的額外殘基是由于氨基酸序列插入所致(殘基82到84和殘基116)。在殘基68上發(fā)現(xiàn)了一個潛在的N-糖基化位點。
1404個核苷酸的第二個開放閱讀框編碼467個氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白，其預計分子量為52566 Da。與TSWV-CPNH 1和TSWV-L 3的同源開放閱讀框比較后發(fā)現(xiàn)，核苷酸水平上存在80％和79％的相似性，而在氨基酸水平存在86.1％(或78.3％相同)和89％(或82.0％相同)的相似性。該開放閱讀框含4個潛在的糖基化位點，位于與TSWV-CPNH 1和TSWV-L 3的恰好相同的位置。
由于幾個插入片段之故，TSWV-B S RNA的基因間區(qū)分別比TSWV-CPNH 1和TSWV-L 3的對應(yīng)物長126個和41個核苷酸。通過FOLD程序所做的序列分析表明基因間區(qū)域能通過其內(nèi)部的堿基A富集伸展序列與堿基U富集伸展序列間配對而形成極復雜和穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，按最小自由能值分析，上述發(fā)夾結(jié)構(gòu)與TSWV-CPNH 1和TSWV-L 3所產(chǎn)生的具有相似穩(wěn)定性。這種內(nèi)部堿基配對結(jié)構(gòu)可以充當轉(zhuǎn)錄終止信號。
上表的結(jié)果也反映出TSWV-B的N蛋白受到比52K蛋白更高的選擇壓力影響；52K蛋白的氨基酸序列間的相似程度較NP氨基酸序列所發(fā)現(xiàn)的要低?；蜷g區(qū)域的核苷酸序列差異性最高，這表明這一區(qū)域受到較別的遺傳區(qū)域更低的選擇壓力。
圖4中分析并描述了TSWV-B和其它4個TSWV分離株間的進化關(guān)系，其中進化樹構(gòu)成與從這些TSWV分離株所收集到血清學數(shù)據(jù)的親緣關(guān)系相一致。因此，根據(jù)本發(fā)明，TSWV-B與L型分離株較之與I-型分離株TSWV-I有更緊密的關(guān)系，但與L型分離株的相似程度比L型分離株彼此間的要低。
盡管癥狀表現(xiàn)稍有延緩，但轉(zhuǎn)基因植株并未表現(xiàn)出TSWV的Brazil分離株抗性。血清學的結(jié)果表明這一分離株與“L”和“I”型分離株關(guān)系遠，并且在生物學上不同于葫蘆分離株。因此，Brazil分離株可能仍屬于TSWV的另一種血清型?？傊?，感染結(jié)果表明，單個NP基因不可能提供對Tospovirus屬內(nèi)所有分離株的抗性。
根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生低或檢測不出的ELISA反應(yīng)(0～0.05OD405nm)的轉(zhuǎn)基因植株，對“L”血清型的異源分離株(Arkansas和10W pakchoy)的感染有抗性，而在積累高水平NP的植株中不抗這些分離株。與對照NP(-)植株的ELISA讀數(shù)(0.05 OD405nm)相比，這些轉(zhuǎn)基因植株如果有的話也僅產(chǎn)生很少的TSWV-BL NP。檢測不到CP累積的轉(zhuǎn)基因植株中觀察到類似結(jié)果，它們對病毒感染具有很高的抗性。目前，還難于對這一現(xiàn)象的機理作出解釋?？赡苁蔷哂胁《緩椭铺匦缘霓D(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的CP RNA分子干擾了這種類型的抗性，推測可能是通過與侵害性病毒的負義復制RNA雜交，與必須的宿主因子(如復制酶)結(jié)合，或是干擾病毒粒子組裝而進行的。
但是應(yīng)該注意到，對同源TSWV-BL分離株的抗性明顯不依賴于NP基因的表達水平。盡管沒有測定出TSWV-BL接種的單個R1代植株的相關(guān)NP水平，但有理由推測在這些接種的R1代植株(總共測試了145株植株)產(chǎn)生的NP范圍為從檢測不出到高水平。
與免受“L”血清型的異源分離株的感染之情況相反，在NP高表達的R1代植株中，發(fā)現(xiàn)可免受TSWV-I血清型的Begonia分離株的影響。比較“L”血清型的與“I”血清型的NP核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，在核苷酸和氨基酸水平上分別有62％和67％的相同性。兩個血清型的NP基因差異會如此之大，以致于轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的NP(“L”血清型)對于“I”血清型中的感染性Begonia分離株是一個機能障礙型蛋白。如果將這個“缺陷性”的外殼蛋白整合到病毒粒子中去，便會產(chǎn)生有缺陷的病毒，抑制病毒運動或其進一步復制。預期這種類型的相互作用需要高水平NP的保護作用?；蛘撸瑢egonia分離株的抗性也可能干擾有病毒復制之R1代植株產(chǎn)生的NP轉(zhuǎn)錄本。如果真是這樣，要抑制異源病毒復制則可能需要更多的NP轉(zhuǎn)錄本(歸因于兩個NP基因的異源特性)。
盡管對于單個R1代植株的NP水平與對“L”和“I”血清型異源分離株的抗性之間的相互關(guān)系的結(jié)果還沒有明顯的解釋，但是，由于這些數(shù)據(jù)來自大量植株(190株)，因此認為存在明顯的傾向。這樣，可以相信，測定單株植株的CP或NP水平可以提供一個更加可靠的方法以確定NP或CP水平與抗性之間的關(guān)系。通過數(shù)據(jù)分析這種形式，結(jié)果表明，在每個測試單株中的抗性與NP水平較之于與它們所來自的R0代株系的NP水平有更加緊密的關(guān)系。至少，對于煙草中的TSWV-BL NP基因，表現(xiàn)出NP基因在植物染色體中的整合位點可能對病毒抗性并不重要。
依據(jù)本發(fā)明，也研究了含有TSWV-BL核蛋白殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因R1代和R2代西紅柿對下列分離株的反應(yīng)Brazil(一個親緣關(guān)系遠的病毒)、T91(一個親緣關(guān)系近的病毒)和BL(一個同源分離株)。在這些研究中，轉(zhuǎn)基因西紅柿(L.esculentum)是通過根瘤土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移將西紅柿斑點枯萎病毒BL的萵苣分離株的核蛋白殼蛋白(N)基因，利用已發(fā)表方法的修改方案[參見PlantCell Reports 581(1986)]，轉(zhuǎn)入到萌發(fā)的子葉中而產(chǎn)生的。挑選西紅柿品系“Geneva 80”作轉(zhuǎn)化材料，是因為該品系含Tm-22基因，這個基因使TMV產(chǎn)生抗性，這樣就可能生產(chǎn)一個多病毒抗性品系。
從含卡那霉素的培養(yǎng)基上挑選出轉(zhuǎn)化體，再將生根了的轉(zhuǎn)基因西紅柿盆栽并移入溫室中。R1和R2代西紅柿苗表達了NPT II基因，說明該基因在植物基因組中是多拷貝插入的。相反，只有18％的種苗產(chǎn)生了可檢測水平的N蛋白。
測定9個R1代和3個R2代品系對下列三個已描述過的Tospovirus，具體講為TSWV-BL，TSWV-T91和TSWV-B的抗性。感染是基于對測試株的肉眼觀察。除幾個帶銹色斑的環(huán)或昆蟲損傷外，在植物看起來健康的情況下，將來自這些植株的提取物接種N.benthamiana以測定病毒是否存在。正如下表所描述的，幾乎所有對照西紅柿植株表現(xiàn)出典型癥狀植株矮化、鑲嵌黃葉以及皺葉，這些癥狀是在用TSWV-BL、TSWV-T91或TSWV-B接種3～4周后表現(xiàn)出來的。但是，只有4％的R1與R2代轉(zhuǎn)基因植株被TSWV-BL感染，7％被TSWV-T91感染和45％被TSWV-B感染。表達西紅柿斑點枯萎病毒萵苣分離株的核蛋白基因的轉(zhuǎn)基因R1與R2代西紅柿中的病毒抗性接種分離株a植物株系TSWV-BLTSWV-T91TSWV-BR1代植株T13-1 0/22 1/26 7/24T13-2 6/20 NTbNTT13-3 2/42 0/20 12/18T13-4 0/25 NT NTT13-9 0/20 NT NTT13-101/50 2/26 11/26T13-110/22 NT NTT13-121/29 NT NTT13-130/22 NT MT總數(shù) 10/252 3/72 30/68R2代植株T13-1-7 0/8 2/8 5/8T13-1-9 0/8 1/8 2/8T13-1-11 0/8 1/9 5/9總數(shù) 0/24 4/25 12/25對照 92/9551/5352/53a.在一葉到二葉齡階段，利用5倍、10倍或20倍稀釋的N.benthamiana、H423煙草或西紅柿的葉提取物接種植物；相同植株在7天后被再接種、再過14天后記錄癥狀表現(xiàn)；表中數(shù)據(jù)表示為有癥狀的植株數(shù)/被測試的植株數(shù)。b.未測試因此，上述描述支持了如下發(fā)現(xiàn)表達TSWV-BL N基因的轉(zhuǎn)基因西紅柿植株表現(xiàn)出抗TSWV-BL感染，抗與TSWV-BL關(guān)系緊密的其它TSWV分離株感染，以及抗關(guān)系更遠的TSWV-B的感染。
在進一步用另一分離株所做的有限研究中，所有轉(zhuǎn)基因植株抗10W(pakchoy)分離株，而對照則被感染。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因西紅柿可更好地免受近緣分離株而不是遠緣分離株的感染。不象在表達TSWV-BL N基因的轉(zhuǎn)基因煙草和N.benthamiana中，N蛋白表達水平與轉(zhuǎn)基因西紅柿中所觀察到的保護作用無關(guān)。55％轉(zhuǎn)基因西紅柿仍抗TSWV-B中的一個遠緣分離株，這在轉(zhuǎn)基因煙草和N.benthamiana植株中沒有觀察到。這些差異可能反映了西紅柿本身對Tospoviruses不太敏感。
此外，也研究確定了接種5周和7周后少量植株中病毒的分布。將每株完全伸展葉片的遠端半葉磨碎并用來再接種到N.benthamiana上。接種七天后所收集的結(jié)果表明，不會從受TSWV-BL、TSWV-T91或TSWV-B接種的無癥狀轉(zhuǎn)基因植株的任何葉片組織上回收到病毒，證實了以上報導過的肉眼觀察結(jié)果。在表現(xiàn)出癥狀的轉(zhuǎn)基因植株上，病毒不是分布在整株上。例如，不能得出最后結(jié)論的轉(zhuǎn)基因植株僅在8片葉片中的二片上(植物底部和頂部的第二葉片)肉眼可見含有病毒。相反，病毒在被感染的對照植株的所有葉片上都存在，但不存在于健康對照植株的所有葉片上。
嘗試了嫁接接種法以測試如果將病毒導入維管系統(tǒng)后抗性轉(zhuǎn)基因植株是否會受到感染。將已以1∶5，1∶10或1∶20稀釋的TSWV-BL、TSWV-T91或TSWV-B接種的R1和R2代植株嫁接到用同樣分離株與稀釋度感染的對照植株上。31天后，34個轉(zhuǎn)基因植株無癥狀表現(xiàn)，盡管非轉(zhuǎn)基因植株受到感染。23天后，轉(zhuǎn)基因植株的頂部46cm被修剪掉以誘導新的生長和更多的植物應(yīng)激反應(yīng)。盡管在接種后第31天，幼小并旺盛生長的新莖未表現(xiàn)出任何癥狀，但是，33％、31％和45％的TSWV-BL、TSWV-T91和TSWV-B分別在接種45天后表現(xiàn)出葉片或莖部癥狀。這些結(jié)果表明，一些轉(zhuǎn)基因植株具有耐受性，而其它則對感染具有免疫性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個目的，表達TSWV-BL分離株NP基因的轉(zhuǎn)基因植株對同源TSWV-BL分離株及同樣血清型(Arkansas和10Wpakchoy)的異源分離株的感染有高度抗性。更具體地說，這種抗性對來自其它血清型的Begonia分離株是有效的。簡言之，以上清楚地描述了，表達TSWV-BL核蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出TSWV和INSV抗性并表明這種保護作用是通過核蛋白抗遠緣INSV和由核蛋白基因核苷酸序列抗同源與近緣TSWV分離株而介導的。這是首次報道加工過的植株對不同TSWV分離株具有廣譜抗性。
盡管外殼蛋白保護作用通常表現(xiàn)感染與癥狀表現(xiàn)延緩和/或下降(而無免疫性)，但本發(fā)明提供了相當高百分率的無癥狀以及無感染性病毒的轉(zhuǎn)基因植株。在溫室條件下，這些植株的抗性能在整個植株生長周期內(nèi)得以維持，更重要的是能如上所述遺傳到它們的后代中去。
本發(fā)明觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生少量(如果有的話)TSWV-BL NP的轉(zhuǎn)基因植株，對TSWV相同血清型范圍內(nèi)的同源分離株與其它近緣分離株的感染有很高的抗性，但在這些表達高水平NP基因的轉(zhuǎn)基因植株中未發(fā)現(xiàn)有保護作用。
TSWV的生物多樣性已有很多記載，并已有報道克服了在栽培品種(如西紅柿)中的遺傳抗性。因此，培育多種TSWV菌株抗性的轉(zhuǎn)基因植物是極其重要的。本發(fā)明表明，有一種方法能夠利用病毒NP基因來提供這樣的抗性，這種抗性是針對多種TSWV分離株的。所以，本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的TSWV NP基因的表達能夠提供對各種TSWV分離株的高水平抗性，具有十分重要的商業(yè)價值。
在另一些研究中，構(gòu)建了質(zhì)粒BIN 19-N+并將它按實施例IV轉(zhuǎn)入根瘤土壤桿菌LBA 4404，然后按實施例V轉(zhuǎn)入Nicotianabenthamiana。用寡聚核苷酸引物INSV-A(5′-TACTTATGTAGAACCATGGACAAAGCAAAGATTACCAAGG)和INSV-B(5′-TACAGTGGATCCATGGTTATTTGAAATAATTTATAAAAGCAC)，擴增了INSV-Beg和INSV-LI的核蛋白殼基因，擴增是通過雙引物分別與INSV分離株的核蛋白殼基因的5′-端編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)雜交實現(xiàn)的。擴增的核蛋白殼基因片段依據(jù)實施例III純化，再依照實施例IV酶切消化并測序。
將總共24N+(用pBIN 19-N+轉(zhuǎn)化的)和18N-(用載體pBIN 19轉(zhuǎn)化的)轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植株移栽到土壤中并轉(zhuǎn)入溫室中生長。在4～5葉齡通過PCR分析證實所有N+系含有N基因序列。通過利用TSWV-BL N蛋白的抗體的DAS-ELISA技術(shù)，估測了每個獨立的R0代轉(zhuǎn)基因克隆系中N蛋白累積的相對水平。在總共24N+株系中，2個的OD405nm值為0.50-1.00，17個的OD405nm值為0.02-0.10，其余5個的OD405nm值小于0.02。健康的N.benthamiana或轉(zhuǎn)基因N-植株的OD405nm值為0.00-0/02。將全部R0代植株進行了自花授精，并且將以下轉(zhuǎn)基因株系的種子于含卡那霉素(300μg/ml)的篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)，用于接種分析(1)N--2和N--6，只含載體pBIN 19的對照轉(zhuǎn)基因株系；(2)N+-28，產(chǎn)生難于檢測數(shù)量的N蛋白(OD405nm＝0.005)的轉(zhuǎn)基因株系；(3)N+-21，一個產(chǎn)生低水平N蛋白(OD405nm＝0.085)的轉(zhuǎn)基因株系；和(4)N+-34和N+-37，兩個累積高水平N蛋白(OD405nm＝0.50-1.00)的轉(zhuǎn)基因株系。然后，用Northern雜交技術(shù)分析這6個株系，發(fā)現(xiàn)N基因的轉(zhuǎn)錄本強度與ELISA反應(yīng)水平密切相關(guān)。
通過在含卡那霉素篩選培養(yǎng)基上進行種子萌發(fā)，篩選來自這6個R0代株系的轉(zhuǎn)基因種苗，然后用5種Tospoviruses接種這些種苗。如果未接種葉片上觀察到病毒癥狀，就認為接種的R1代植株是敏感的。為排除遺漏的可能性，總是在每次接種轉(zhuǎn)基因N+植株時，使用轉(zhuǎn)基因?qū)φ誑-植株。此外，總是用每一接種提取物首先接種N+植株然后再用于對照N-植株?，F(xiàn)將這些研究結(jié)果描述如下表達N.benthamiana斑點枯萎病毒(TSWV)核蛋白殼(N)蛋白基因的R1代植株對接種Tospoviruses的反應(yīng)受感染植株數(shù)/接種植株數(shù)bTSWV 分離株INSV分離株R0株系 ELISAaBL 10WBegLITSWV-BN--21-6＜0.02 32/3232/32 32/3220/20 32/32N+-28 0.005 16/1616/16 15/16 16/16N+-21 0.085 9/40 17/40 39/4018/20 40/40N+-34 0.715 25/28c28/28 23/28c28/28N+-37 0.510 26/28c22/22 21/28c16/20c22/22a.衍生出R1代植株的R0代株系的ELISA數(shù)據(jù)b.將被感染的N.benthamiana植株葉提取物稀釋30倍，然后用于3-5葉齡植株的3片葉片。每個提取物總是先用于接種N+植株再用于接種對照N-植株。接種后至少二個月每日記錄數(shù)據(jù)，并表示成整株被感染的植株數(shù)/接種植株數(shù)。c.表明幾乎所有敏感的R1代植株均表現(xiàn)出癥狀表現(xiàn)明顯延緩。
正如上表所描述的，所有對照株系N--2和N--6的R1代植株皆于接種所有被測試病毒5～8天后表現(xiàn)出整株癥狀。沒有一個來自株系N+-28的R1代植株生產(chǎn)可檢測水平的N蛋白，并且除接種INSV-Beg的一株外，其余皆對這些病毒敏感。接種前取N+-28 R1代植株的葉盤作ELISA分析，清楚地表明，被鑒定具有INSV-Beg抗性表現(xiàn)型的植株確實積累了高水平的N蛋白(OD405nm＝0.78，而其余所有N+-28 R1植株的OD405nm小于0.02)。
低N基因表達株系N+-21對同源的(78％)和近緣TSWV-10W(57％)表現(xiàn)出最佳抗性，而對二個INSV分離株則抗性極低(3％和10％)；只有三株N+-21植株在接種INSV分離株后出現(xiàn)抗性表型。來自這些INSV抗性N+-21 R1代植株葉的樣品得到比敏感的N+-21植株(OD405nm＝0.02-0.20)更高的ELISA反應(yīng)(OD405nm＝0.5-1.00)以及更高量的N蛋白。高N基因表達株系N+-34和N+-37對INSV分離株(18％～25％)的抗性最高，其次是對同源TSWV-BL分離株(7％和11％)，但沒有一個植株有TSWV-10W抗性；不過，被INSV或TSWV-BL感染的N+-34和N+-37 R1代植株確實表現(xiàn)出不同程序地癥狀表現(xiàn)延遲。從這四個轉(zhuǎn)基因N+株系所得到的R1代植株沒有一個有TSWV-B抗性；一些來自N+-34和N+-37株系的R1代植株，其癥狀表現(xiàn)稍有延遲。
在確定N+R1代植株中的N蛋白生產(chǎn)水平是否與對不同Tospoviruses的抗性相關(guān)的研究中，不考慮起始R0代植株，根據(jù)接種前采樣組織的ELISA反應(yīng)強度，將前表中接種過的N+R1代植株重新分成四組。表達低水平N蛋白的N+R1代植株(0.02-0.2OD)，對TSWV-BL和TSWV-10W表現(xiàn)出高抗性(100％和80％)，而對INSV-Beg和INSV-LI都敏感，表明與對照N-植株相比沒有明顯的癥狀表現(xiàn)延遲。相反，幾乎所有含高水平N蛋白的N+R1代植株(0.20-1.00OD)，與對照N-植株相比，在抵御TSWV-BL、INSV-Beg和INSV-LI方面，表現(xiàn)出各種水平的保護作用，從癥狀表現(xiàn)稍有延遲，直到完全抗性，大部分植株癥狀表現(xiàn)有不同程度的延遲。但在抗TSWV-10W的高表達體中沒有保護作用。此外，不管N基因表達水平如何，N+R1代植株都沒有TSWV-B抗性，但生產(chǎn)高水平N蛋白的N+R1代植株中觀察到短期延遲癥狀的表現(xiàn)。所有對照N-R1植株及有難于檢測的ELISA反應(yīng)之轉(zhuǎn)基因N+R1植株(0～0.02OD)對全部測試Tospoviruses都敏感。
還研究了表達TSWV-BL核蛋白殼基因的N.benthamiana原生質(zhì)體中遠緣INSV復制的抑制問題。在這些研究中，用整個INSV-LI病毒粒子感染從三個轉(zhuǎn)基因株系分離到的原生質(zhì)體，以研究轉(zhuǎn)入基因產(chǎn)物對進入病毒的復制的影響。利用INSV N蛋白特異抗體，通過測定轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體中感染INSV的N蛋白水平來確定病毒復制。DAS-ELISA分析表明，所給株系的所有后代都是相對均一的，并且?guī)缀跛蠷1后代都產(chǎn)生與其親本轉(zhuǎn)基因株系相似的轉(zhuǎn)基因N基因的表達水平。這些結(jié)果使得可以在其親本株系的表達水平的基礎(chǔ)上預測R1群體的表達水平。來自低表達株系N+-21 R1代植株的原生質(zhì)體支持INSV-LI的復制，而來自高表達株系N+-37 R1代植株的原生質(zhì)體接種42小時后在觀察到低水平病毒復制時才表現(xiàn)為支持INSV-LI的復制。通過使用TSWV-BL N蛋白特異抗體的DAS-ELISA在不同時間間隔(如0、19、30和42小時)檢測相同的原生質(zhì)體，以監(jiān)測轉(zhuǎn)基因的表達水平。不出所料，N+-21 R1代植株原生質(zhì)體產(chǎn)生相對低的水平(0.338-0.395OD405nm)，而N+-37 R1代植株的原生質(zhì)體產(chǎn)生高水平(0.822-0.865 OD405nm)。并且，各時間點的表達水平是一致的。
在本發(fā)明的這一目的中，業(yè)已表明積累低量TSWV-BL N蛋白的轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植株對同源和近緣(TSWV-10W)分離株有高抗性，而積累高水平TSWV-BL N蛋白的植株對于抵御同源和遠緣(INSV-Beg和INSV-LI)病毒，有中等水平的保護作用。更重要的是，這些發(fā)現(xiàn)表明轉(zhuǎn)基因N.benthamiana植株(INSV的整株寄主)受到保護以抵御INSV-Beg和INSV-LI分離株。
正如以上所討論過的，我們已表明表達TSWV N基因的轉(zhuǎn)基因植株抗同源分離株，而表達TSWV-BL N基因的植株能抗TSWV和INSV。也還表明，積累低水平N蛋白的轉(zhuǎn)基因植株對同源和近緣分離株具有最佳抗性，而表達高水平TSWV-BL N蛋白的轉(zhuǎn)基因植株對血清學上遠緣的INSV分離株有更高的抗性，這一觀察結(jié)果使我們對翻譯出的N蛋白在所觀察的抗同源和近緣分離株的保護作用中的作用產(chǎn)生懷疑，并且推測，在保護作用中涉及的究竟是插入到植株基因組中的N基因本身，還是其轉(zhuǎn)錄本。為證實這一假說，生產(chǎn)含無啟動子的N基因的或者是表達有義或反義不可翻譯N基因編碼序列的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有義和反義不可翻譯N基因的RNA提供了抵御同源和近緣分離株的保護作用，而且這些RNA介導的保護作用在合成各種低水平RNA的植物中非常有效，并且是通過抑制病毒復制達到的。
更具體地說，導入轉(zhuǎn)基因植物中的編碼序列如圖7所示。正如所描述過的，構(gòu)建體pBIN 19-N含有插入植物轉(zhuǎn)化載體pBIN 19中的無啟動子N基因(見實施例IV)。所有其它構(gòu)建體包括一個雙CaMV的35S啟動子，苜?；ㄈ~病毒的一個5′端非翻譯前導序列，以及一個胭脂堿合成酶基因的3′端非翻譯/多聚腺苷酸序列。pBI525是一個植物表達載體，在本實驗中用作對照。pBI525-mN含有N基因的突變(不可翻譯)形式；pBI525-asN含有不可翻譯N基因的反義形式。用破折號表明了突變N基因5′端的一個核苷酸缺失。ATG密碼子下劃有一道橫線，突變基因中的框內(nèi)(inframe)終止子用黑體表明。
實施例VIII按如下完成TSWV-BLN基因的針對引物的誘變與克隆按Phytopathology 821223(1992)所描述的方法(該文獻全部引入本文)通過反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)合成全長N基因。用寡聚核苷酸引物A(AGCATTGGATCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC，該引物與TSWV-BL N基因中3′端非編碼區(qū)的S RNA相同)和引物B(AGCTAATCTAGAACCATGGATGACTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC，該引物與N基因5′端的S RNA互補)通過RT-PGR相似地合成不可翻譯的N編碼序列。在緊跟翻譯起始密碼子和幾個終止密碼子之后，后面的寡聚核苷酸引物B含有一個移碼突變，以阻斷可能的翻譯通讀。按上述實施例II所述，在1.2％瓊脂糖凝膠上純化完整和突變的N基因片段，然后用凝膠純化過的完整的和突變的N基因片段用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化并分別直接克隆到經(jīng)BamHI/Xbal消化過的植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19和經(jīng)NcoI消化過的植物表達載體pBI525上(按實施例IV方法)。所得質(zhì)粒經(jīng)鑒定后并命名為pBIN 19-N，含有完整的，無啟動子的N基因，而pBI525-mN與pBI525-asN相對于花椰菜花葉病毒35S啟動子，分別在有意義和反義方向上含有突變編碼序列。通過在煙草原生質(zhì)體中瞬間表達分析檢測表達盒中突變N編碼序列的翻譯能力；然后利用HindIII/EcoRI(因為N編碼序列含有內(nèi)源HindIII和ExoRI位點)通過部分酶切從質(zhì)粒pBI525上將含有義或反義突變N編碼序列的表達盒切割下來，并連接到用同種酶切割過的植物表達載體pBIN 19上。利用上述實施例IV中的方法將所得載體以及pBIN19-N轉(zhuǎn)入根瘤土壤桿菌LBA4404中，再用含各種構(gòu)建體的根瘤土壤桿菌LBA4404接種煙草var Havana cv 423的葉盤，并使所得的轉(zhuǎn)基因植株進行自花授精，并且種子于含卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇性萌發(fā)。
按前述方法對每個R0代轉(zhuǎn)基因株系進行PCR。用寡聚核苷酸引物A和B以確定TSWV-BL N編碼序列的存在。將寡聚核苷酸引物35S-啟動子(CCCACTATCCTTCGCAAGACCC)與寡聚核苷酸引物A或B結(jié)合，以確證插入到植物基因組中的突變N編碼序列的方向(相對于CaMV 35S啟動子)。利用TSWV-BL N蛋白的多克隆抗體完成DAS-ELISA，以檢測轉(zhuǎn)基因植株中的N蛋白。為了通過Northern印跡來估測轉(zhuǎn)基因植株中RNA轉(zhuǎn)錄本水平，根據(jù)Napoli[見The PlantCell 2279(1990)]方法分離植株總RNA，并于含甲醛的瓊脂糖凝膠(10μg/每條帶)上分離。然后用溴化乙錠將瓊脂糖凝膠染色以確保每條帶中植株總RNA的均一性。雜交條件按廠商提供的GeneScreen Plus方法。根據(jù)每個印跡中所包括的對照條帶的N基因轉(zhuǎn)錄本(mN R1代植株產(chǎn)生高水平的N基因轉(zhuǎn)錄本)，對所產(chǎn)生的雜交信號進行了比較和標準化。產(chǎn)生密度讀數(shù)(Hewlet ScanJet andImage Analysis Program)在100～150之間的轉(zhuǎn)基因植株被估定為高表達體，而密度讀數(shù)范圍為15～50的轉(zhuǎn)基因植株估定為低表達體。
除標明外，按前述于3～4葉齡階段所完成的接種，用Tospovirus接種轉(zhuǎn)基因植株。
從表面消毒過的R1代植株葉片中制備出煙草原生質(zhì)體[參見Z.Pflanzanphysiol.78453(1992)并經(jīng)修改過]。然后通過PEG方法[參見Plant Mol.Biol.8363(1987)]，用0.68 OD260nm的純化TSWV-BL病毒粒子制品轉(zhuǎn)化分離的原生質(zhì)體(6×106個原生質(zhì)體)。轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體以終濃度為1×106個原生質(zhì)體/ml轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基上并于26℃黑暗培養(yǎng)。經(jīng)各培養(yǎng)間隔后，用W5溶液沖洗二次培養(yǎng)過的原生質(zhì)體，并于酶連接緩沖液中通過滲透休克裂解。利用DAS-ELISA，通過測定N蛋白估測了病毒的增殖(復制)。
如前所述，本發(fā)明的目的之一表明，不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生可檢測量N蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草具同源和近緣分離株抗性。這一結(jié)果表明，所觀察到的抗性可能歸因于引入的病毒N基因RNA與轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的N基因轉(zhuǎn)錄本或與N編碼序列本身之間的反式相互作用(transinteraction)。為證實核N基因是否起了作用，用四個Tospoviruses(TSWV-BL，TSWV-10W，INSV-Beg和TSWV-B)攻擊來自二個P°N株系的轉(zhuǎn)基因P°N R0代株系和R1代植株。只有無病癥的植株才被認為是抗性的，而表現(xiàn)出任何癥狀的植株都被認為是敏感的。所有接種過的R0和R1代植株都對病毒敏感。
為進一步證實在保護作用中涉及N轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本的可能性，用同源分離株接種大量能產(chǎn)生有義或反義N基因轉(zhuǎn)錄本但不產(chǎn)生N蛋白的R0代轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果列表如下轉(zhuǎn)基因aN基因b測試的R0接種的c抗性株系形式 RNA水平株系數(shù)量株系數(shù)量 數(shù)量mN H 8 40L 17 16 16nd 4 10asN H 6 30L 9 55nd 1 00P°N nd 12 60a.mN和asN分別代表表達有義和反義不可翻譯N基因的植株，P°N代表含無啟動子N基因的植株；b.N基因RNA的水平是對每個株系進行Northern印跡而估測的，nd代表未檢測的N基因轉(zhuǎn)錄本；c.將經(jīng)TSWV-BL感染的N.benthamiana 30倍稀釋的葉提取物在6-7葉齡階段用于每一植株上的三片葉。每一提取物首先用于全部測試植株然后再用于對照健康植株。接種后45天每日記錄數(shù)據(jù)，并且只有無癥狀的植株才算是抗性的。
與對照(接種7～9天后形成典型的整株癥狀)相反，21個mN中16株和8個asN中5株在其整個生長周期中未見癥狀表現(xiàn)。接種前采葉組織樣品所做的Northern印跡分析表明，所有抗性R0代株系產(chǎn)生低水平的有義或反義N基因RNA，而敏感的R0代株系則不產(chǎn)生或產(chǎn)生高水平的RNA。由于該資料表明對TSWV-BL有抗性的轉(zhuǎn)基因植株與它們的N基因轉(zhuǎn)錄本的相對水平有關(guān)，所以，通過于含卡那霉素的培養(yǎng)基上萌發(fā)，篩選出轉(zhuǎn)基因后代，這些后代來自具有高或低水平N基因轉(zhuǎn)錄本水平的4個mN和3個asN R0代株系。然后在3～4葉齡階段，測試這些轉(zhuǎn)基因植株對四個Tospoviruses的抗性，除來自2個asN株系的一些R1代植株是在6～7葉齡階段進行接種測試。將這些結(jié)果匯總列于下表R0株系N基因RNAaISWV-BLTSWV-10WINSV-BegTSWV-B無啟動子N基因P°N-1nd 10/10 10/10 10/10 10/10P°N-2nd 15/15 10/10 10/10 10/10N°-3 nd8/86/6 6/66/6不可翻譯的N基因mN-2 H 20/20 20/20 20/20 20/20mN-7 H 20/20 20/20 20/20 20/20mN-13 L2/20 4/20 20/20 20/20mN-18 L4/20 1/20 20/20 20/20N°-3 nd 24/24 32/32 24/24 24/24反義N基因asN-1 L20/20b20/2020/20 20/20asN-4 H 20/20 20/20 20/20 20/20(16/16)c(16/16)asN-9 L19/2020/2020/20 20/20(3/41) (5/21)N°-3 nd 16/16 16/16 16/16 16/16(32/32)(20/20)a.衍生出R1代植株的R0株系的Northern分析(見前表)；b.劃線部分表明大多數(shù)敏感的R1代植株表現(xiàn)出明顯的癥狀延緩；c.括號中部分代表在6～7葉齡階段接種植株得到的接種數(shù)據(jù)；表中其余數(shù)據(jù)來自3～4葉齡階段的接種植株；接種植株接種后45天每日進行觀察。
來自高表達體株系mN-2和mN-7的所有R1代植株均對全部測試的Tospoviruses感染敏感，而且，這些植株與對照相比，未表現(xiàn)出癥狀延遲。相反，來自低表達體株系mN-13和mN-18的大部分R1代植株抗同源(TSWV-BL)和近緣(TSWV-10W)分離株，但對遠緣Tospoviruses(INSV-Beg和TSWV-B)的感染沒有抗性。來自低表達體R0株系的asN R1植株的抗性明顯受到接種用TSWV分離株的影響。只是當接種同源的TSWV-BL或近緣的TSWV-10W分離株時，盡管癥狀表現(xiàn)有所延遲，但來自低表達體株系asN-1和asN-9的小R1植株(3～4葉齡階段)，除一個以外全部受到感染。相反，大多數(shù)來自株系asN-9的大R1植株(6～7葉齡階段)都抗這兩種分離株。相比之下，對照R1植株和來自高表達體株系如asN-4的R1植株，不管測試植株大小如何，對這兩種分離物中的任何一種都不表現(xiàn)抗性。反義RNA介導的保護作用對于抗遠緣INSV-Beg和TSWV-B分離株的感染無效果。
對以上兩表中數(shù)據(jù)的分析可以認為，有義和反義RNA介導的保護作用只能在N基因的低水平表達體中觀察到。產(chǎn)生高水平反義N基因轉(zhuǎn)錄本的R1asN植株與對照植株一樣是敏感的。相反，asN低表達體在3～4葉齡接種時，表現(xiàn)出癥狀延遲，而在6～7葉齡接種時，表現(xiàn)出抗性水平增加。
還注意到，在表達不可翻譯N編碼序列的有義或反義形式的煙草原生質(zhì)體中抑制病毒復制。在這一情形中，TSWV-BL的全病毒粒子制備物用于轉(zhuǎn)染從轉(zhuǎn)基因株系分離的原生質(zhì)體，以調(diào)查有義或反義N基因轉(zhuǎn)錄本對所導入病毒復制的影響。病毒復制是通過測定轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體中導入病毒的N蛋白水平來確定的，從各自產(chǎn)生高水平RNA轉(zhuǎn)錄本的植物(mN-7和asN-4)中分離的原生質(zhì)體，有助于病毒的復制，而來自mN低表達體(mN-18)的原生質(zhì)體則不能。來自asN低表達體(asN-9)中的原生質(zhì)體有助于很低水平的病毒復制。
因此，在本發(fā)明的這一方面，我們表明表達不可翻譯的N基因編碼序列的有義或反義形式的轉(zhuǎn)基因植株對同源(TSWV-BL)和近緣(TSWV-10W)分離株有抗性，但 對遠緣的Tospoviruses(INSV-Beg和TSWV-B)則沒有。下表列出在表達各種形式TSWV-BL N基因的轉(zhuǎn)基因煙草之間對Tospoviruses的抗性比較轉(zhuǎn)基因形式a與TSWV-BL NTospovirus基因b的同源性NmNasNP°NTSWV-BL 100％ R R RcSTSWV-10W 99％ R R RcSINSV-Beg 60％ RcS S STSWV-B 78％ S S S Sa.包括表達TSWV-BL的完整N基因(N)的轉(zhuǎn)基因煙草與N。benthamiana植株對接種4種Tospoviruses的反應(yīng)，并與含有不可翻譯的(mN)、反義的(asN)和無啟動子的(P°N)N編碼序列的轉(zhuǎn)基因植株的接種結(jié)果相比較，R＝抗性的，S＝敏感的b.Phytopathology 821223(1992)和Phytopathology 83728(1993)中報道過的核苷酸序列c.抗性水平可能取決于接種物的濃度。
這些結(jié)果證實并拓展了本發(fā)明較早提及的關(guān)于用TSWW由RNA介導的保護作用。而且，在產(chǎn)生低的而不是高水平N基因轉(zhuǎn)錄本的植株中觀察到了保護作用，并且盡管本文中較早提到的研究表明產(chǎn)生高水平TSWV-BL N蛋白的煙草植株表現(xiàn)出對INSV-Beg有抗性，但是這個輔助數(shù)據(jù)表明由于在表達不可翻譯N基因的有義或反義形式的轉(zhuǎn)基因植株中未觀察到對INSV-Beg的抗性，因此，這樣清楚地表明了抗INSV-Beg的保護作用是由于N蛋白的存在而不是N基因轉(zhuǎn)錄本存在之故。所以，很明顯，根據(jù)本發(fā)明保護轉(zhuǎn)基因植株不受TSWV和INSVTospoviruses感染涉及兩個機制。一個機制涉及到N基因轉(zhuǎn)錄本(RNA介導)，另一個機制涉及到N蛋白(蛋白介導)。此外，原生質(zhì)體實驗的結(jié)果表明，N基因RNA介導的保護作用是通過抑制病毒復制的過程實現(xiàn)的，而且從上表中的數(shù)據(jù)也可以推測抵御遠緣INSV-Beg分離株的保護作用是由TSWV-BI的N蛋白而不是由基因轉(zhuǎn)錄本提供的。
最后，完成進一步研究以提供本發(fā)明的另一目的一部分Tospovirus的核蛋白基因為轉(zhuǎn)基因植物提供了免受Tospovirus感染的保護作用。以上業(yè)已表明N基因RNA保護抵御同源和近緣TSWV分離株感染而N蛋白保護抵御同源植株和遠緣INSV分離株感染；N基因RNE介導的保護作用在表達低水平N基因的植株中是有效的，而N蛋白介導的保護作用則需要高水平N蛋白的累積；N基因RNA介導的保護作用是通過抑制病毒復制實現(xiàn)的?；诖饲皵?shù)據(jù)，我們接下來開始確定部分N基因是否可能抗病毒感染。我們發(fā)現(xiàn)，正如以下所討論的，表達約一半N基因序列的轉(zhuǎn)基因植株對病毒有抗性。
以下描述TSWV-BL的半個N基因片段的克隆，以便說明本發(fā)明的這一最后目的。通過以前描述過的反轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)，產(chǎn)生了可翻譯和不可翻譯N基因的第一與第二半片段。如圖8所描述的，由破折號標出了不可翻譯的半N基因片段5′端的核苷酸缺失或插入；ATG密碼子下劃有橫線，用黑體標明了緊跟不可翻譯半N基因片段的起始密碼子之后的全部可能的終止子。
通過RT-PCR合成了N基因的第一半片段，使用引物與TSWV-BL N基因的中心區(qū)互補的寡聚核苷酸引物i(5′-TACAGTGGATCCATGGTTAAGGTAATCCATAGGCTTGAC)，以及用于可翻譯的第一半N基因片段的寡聚核苷酸引物ii(5′-AGCTAAGCATGGTTAAGCTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC)或用于不可翻譯的第一半N基因片段的寡聚核苷酸引物iii(5′-AGCTAATCTAGAACCATGGATGACTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC)，其中后二個寡聚核苷酸引物與N基因的5′端相同。相似地，利用RT-PCR生產(chǎn)了N基因的第二半片段，使用引物與TSWV-BL N基因的3′端非編碼區(qū)互補的寡聚核苷酸引物iV(5′-AGCATTGGATCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC)，以及用于可翻譯的第二半N基因片段的寡聚核苷酸引物v(5′-TACAGTTCTAGAACCATGGATGATGCAAAGTCTGTGAGG)或用于不可翻譯的第二半N基因片段的寡聚核苷酸引物vi(5′-AGATTCTCTAGACCATGGTGACTTGATGAGCAAAGTCTGTGAGGCTTGC)，其中后兩個寡聚核苷酸引物與N基因的中心區(qū)相同。寡聚核苷酸引物iii在緊跟翻譯密碼子和幾個終止密碼子之后含有移碼突變，以阻斷可能的翻譯通讀，而寡聚核苷酸引物vi在緊跟翻譯起始密碼子之后含有幾個框內(nèi)終止密碼子。
按前述方法，在1.2％的瓊脂糖凝膠上純化半基因片段，然后用限制性內(nèi)切酶消化凝膠分離的基因片段并直接克隆到NcoI酶切過的植物表達載體pBI525中。所得的質(zhì)粒經(jīng)鑒定后命名為(1)pBI525-1N，含第一半可翻譯的N基因；(2)pBI525-1N′，含第一半不可翻譯的N基因；(3)pBI525-1N-，于反義方向上含第一半可翻譯N基因；(4)pBI525-2N，含第二半可翻譯的N基因；(5)pBI525-2n′，含第二半不可翻譯的N基因；和(6)pBI525-2N-，于反義方向上含第二半可翻譯的N基因。然后，用HindIII/EcoRI消化從質(zhì)粒pBI525中切下表達盒，并按上述方法連接到已用同樣酶切割過的植物轉(zhuǎn)化載體pBIN 19中。用所得的載體以及質(zhì)粒pBIN 19按Holsters(上文)報道的方法轉(zhuǎn)入根瘤土壤桿菌LBA4404中，再用含各種構(gòu)建體的根瘤土壤桿菌LBA4404接種N.benthamiana的葉盤。將所獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行自花授精，按前述方法于含卡那霉素的培養(yǎng)基上使種子選擇性萌發(fā)。
用PCR和Northern雜交分析轉(zhuǎn)基因植物，按前述方法對每個R0轉(zhuǎn)基因株系進行PCR。用寡聚核苷酸引物i～vi來確定TSWV-BL的N編碼序列的存在。同時，將寡聚核苷酸引物35 S-啟動子(參見實施例VIII)與上述寡聚核苷酸引物之一結(jié)合，以確證插入到植物基因組中的半基因序列的方向(與相對于CaMV 35S啟動子)。Northern雜交分析則按實施例VIII描述過的方法進行。
用TSWV(TSWV-BL)的萵苣分離株攻擊轉(zhuǎn)基因植株。按前述方法用3～4葉齡階段的測試植株接種分離株。為避免遺漏的可能性，每次實驗都要設(shè)立對照植株，而且，用每個接種提取物先接種轉(zhuǎn)基因植株然后再接種對照植株。
本發(fā)明這一方面所用的各種構(gòu)建體用圖8來說明。用RT-PCR合成了可翻譯和不可翻譯的半N基因片段，然后直接克隆到植物表達載體pBI525中。用于由RT-PCR合成不可翻譯的半N基因片段的寡聚核苷酸引物iii和vi，在緊跟翻譯起始密碼子之后有一個突變，所得閱讀框含有幾個終止密碼子以阻斷可能的翻譯通讀。這樣，第一和第二半不可翻譯的N基因片段應(yīng)該是都不能在導入植物之后產(chǎn)生截短的N蛋白片段。然后，將可翻譯與不可翻譯的半N基因片段于有義或反義方向連接到載體pBI525 CaMV 35 S啟動子的下游。這樣，TSWV-BL的半N編碼序列的表達受到一個雙CaMV 35 S啟動子的調(diào)控，該啟動子是與表達載體pBI525的苜?；ㄈ~病毒(ALMV)上非翻譯的前導序列融合。利用疊加的雙CaMV 35 S啟動子元件的表達載體已知比利用單個35 S啟動子元件的相似載體能產(chǎn)生更高水平的mRNA轉(zhuǎn)錄本。將載體pBI525上的表達盒轉(zhuǎn)移到植物轉(zhuǎn)化載體pBIN 19上。構(gòu)建的質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒pBIN 19再轉(zhuǎn)入根瘤土壤桿菌LBA4404中。所得轉(zhuǎn)基因植株的命名如圖8所示。
所有抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)PCR證實在預期方向上含有恰當?shù)腘編碼序列。每個轉(zhuǎn)基因R0株系結(jié)出種子，然后用Northern印跡進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個1N中的6個，6個1N′中的4個，6個1N-中的6個，6個2N中的6個，8個2N′中的7個以及7個2N-中的6個轉(zhuǎn)基因R0代株系產(chǎn)生了半N基因RNAs。
用同源分離株TSWV-BL侵染一組轉(zhuǎn)基因R0代植株。只有無癥狀的植株才算作抗性植株，而表現(xiàn)任何癥狀(局部損傷或整株感染)的植株都算是敏感性的。所有接種的R0對照植株對病毒都敏感；相反，9個1N′中的2個，6個1N-中的2個，10個2N′中的4個以及8個2N-中的1個R0代株系則發(fā)現(xiàn)完全抗病毒感染。盡管沒有1N和2N R0代株系表現(xiàn)出高水平抗性，但這些植株中有一些癥狀顯現(xiàn)明顯的癥狀延遲。
讓另一組轉(zhuǎn)基因R0代株系生長成熟并結(jié)出種子。然后將種子于含卡那霉素的培養(yǎng)基上萌發(fā)幼苗，再用TSWV-BL接種。正如下表所示，對照幼苗與一些轉(zhuǎn)基因株系的幼苗都對分離株敏感，而1N-151、1N′-123和2N′-134株系的幼苗則表現(xiàn)出各個水平上的保護作用，范圍從癥狀顯現(xiàn)延遲到完全抗性。
感染植物數(shù)/接種植物數(shù)R0品系 6DPI 15DPI 30DPI對照50/501N-149 17/171N-151 2/20 13/20 17/201N′-12316/20 17/20 17/201N′-12420/201N′-12619/191N--13012/15 15/151N--13218/19 19/192N--15520/202N′-1340/20 10/20 10/202N′-13519/192N--14220/202N--14320/20在上表中，N.benthamiana感染的植物抽提物30倍稀釋用于接種3～4片葉子時期的轉(zhuǎn)基因植物，用轉(zhuǎn)基因植物做對照。DPI＝接種后的天數(shù)。
概括性地講，本發(fā)明的這個方面表現(xiàn)出表達可翻譯或不可翻譯N基因片段的第一或第二部分的轉(zhuǎn)基因植物對同源的TSWV-BL分離株具有很高的抗性。這一結(jié)果證明了N基因的一部分足以產(chǎn)生對病毒的抗性。
如前所述的本發(fā)明的核苷酸和氨基酸順序 列表如下序列表(1)一般信息(i)申請人Dennis Gonsalves和Sheng-Zhi Pang(ii)發(fā)明名稱西紅柿斑點枯萎病毒(iii)序列數(shù)目30(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1AGCAGGCAAA ACTCGCAGAA CTTGC 25(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GCAAGTTCTG CGAGTTTTGC CTGCT 25(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3AGCTAACCAT GGTTAAGCTC ACTAAGGAAA GC 32(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4AGCATTCCAT GGTTAACACA CTAAGCAAGC AC 32(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征
(A)長度2265個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CAAGTTGAAA GCAACAACAG AACTGTAAAT TCTCTTGCAG TGAAATCTCT 50GCTCATGTCA GCAGAAAACA ACATCATGCC TAACTCTCAA GCTTCCACTG100ATTCTCATTT CAAGCTGAGC CTCTGGCTAA GGGTTCCAAA GGTTTTGAAG150CAGGTTTCCA TTCAGAAATT GTTCAAGGTT GCAGGAGATG AAACAAACAA200AACATTTTAT TTATCTATTG CCTGCATTCC AAACCATAAC AGTGTTGAGA250CAGCTTTAAA CATTACTGTT ATTTGCAAGC ATCAGCTCCC AATTCGCAAA300TGCAAAGCTC CTTTTGAATT ATCAATGATG TTTTCTGATT TAAAGGAGCC350TTACAACATT GTTCATGACC CTTCATACCC CAAAGGATCG GTTCCAATGC400TCTGGGTCGA AACTCACACA TCTTTGCACA AGTTCTTTGC AACTAACTTG450CAAGAAGATG TAATCATCTA CACTTTGAAC AACCTTGAGC TAACTCCTGG500AAAGTTAGAT TTAGGTGAAA GAACCTTGAA TTACAGTGAA GATGCCTACA550AAAGGAAATA TTTCCTTTCA AAAACACTTG AATGTCTTCC ATCTAACACA600CAAACTATGT CTTACTTAGA CAGCATCCAA ATCCCTTCAT GGAAGATAGA650CTTTGCCAGA GGAGAAATTA AAATTTCTCC ACAATCTATT TCAGTTGCAA700AATCTTTGTT AAAGCTTGAT TTAAGCGGGA TCAAAAAGAA AGAATCTAAG750GTTAAGGAAG CGTATGCTTC AGGATCAAAA TAATCTTGCT TTGTCCAGCT800TTTTCTAATT ATGTTATGTT TATTTTCTTT CTTTACTTAT AATTATTTCT850CTGTTTGTCA TCTCTTTCAA ATTCCTCCTG TCTAGTAGAA ACCATAAAAA900CAAAAAATAA AAATGAAAAT AAAATTAAAA TAAAATAAAA TCAAAAAATG 1000AAATAAAAAC AACAAAAAAT TAAAAAACGA AAAACCAAAA AGACCCGAAA 1050GGGACCAATT TGGCCAAATT TGGGTTTTGT TTTTGTTTTT TGTTTTTTGT 1100TTTTTATTTT TTATTTTATT TTTATTTTAT TTTATTTTTA TTTTATTTTT 1150ATTTTATTTA TTTTTTGTTT TCGTTGTTTT TGTTATTTTA TTATTTATTA 1200AGCACAACAC ACAGAAAGCA AACTTTAATT AAACACACTT ATTTAAAATT 1250TAACACACTA AGCAAGCACA AGCAATAAAG ATAAAGAAAG CTTTATATAT 1300TTATAGGCTT TTTTATAATT TAACTTACAG CTGCTTTCAA GCAAGTTCTG 1350CGAGTTTTGC CTGCTTTTTA ACCCCGAACA TTTCATAGAA CTTGTTAAGA 1400GTTTCACTGT AATGTTCCAT AGCAACACTC CCTTTAGCAT TAGGATTGCT 1450GGAGCTAAGT ATAGCAGCAT ACTCTTTCCC CTTCTTCACC TGATCTTCAT 1500TCATTTCAAA TGCTTTGCTT TTCAGCACAG TGCAAACTTT TCCTAAGGCT 1550TCCTTGGTGT CATACTTCTT TGGGTCGATC CCGAGGTCCT TGTATTTTGC 1600ATCCTGATAT ATAGCCAAGA CAACACTGAT CATCTCAAAG CTATCAACTG 1650AAGCAATAAG AGGTAAGCTA CCTCCCAGCA TTATGGCAAG TCTCACAGAC 1700TTTGCATCAT CGAGAGGTAA TCCATAGGCT TGAATCAAAG GATGGGAAGC 1750AATCTTAGAT TTGATAGTAT TGAGATTCTC AGAATTCCCA GTTTCTTCAA 1800CAAGCCTGAC CCTGATCAAG CTATCAAGCC TTCTGAAGGT CATGTCAGTG 1850CCTCCAATCC TGTCTGAAGT TTTCTTTATG GTAATTTTAC CAAAAGTAAA 1900ATCGCTTTGC TTAATAACCT TCATTATGCT CTGACGATTC TTTAGGAATG 1950TCAGACATGA AATAACGCTC ATCTTCTTGA TCTGGTCGAT GTTTTCCAGA 2000CAAAAAGTCT TGAAGTTGAA TGCTACCAGA TTCTGATCTT CCTCAAACTC 2050AAGGTCTTTG CCTTGTGTCA ACAAAGCAAC AATGCTTTCC TTAGTGAGCT 2100TAACCTTAGA CATGATGATC GTAAAAGTTG TTATAGCTTT GACCGTATGT 2150AACTCAAGGT GCGAAAGTGC AACTCTGTAT CCCGCAGTCG TTTCTTAGGT 2200TCTTAATGTG ATGATTTGTA AGACTGAGTG TTAACGTATG AACACAAAAT 2250TGACACGATT GCTCT 22G5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度1709個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6AAATTCTCTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA 50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG 100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA 150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT 200CTATTGCCTG CATTCCAAAC CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT 250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT 300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC 350ATGATCCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC 400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT 450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG 500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT 550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACCA TGTCTTATTT 600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA 650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT 700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC 750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT 800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT 850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA 900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA 950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGCA AACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCACA AACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGC TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTGCAAACTT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGAATCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT 1700CAGAATTCC 1709(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度260個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Gln Val Glu Ser Asn Asn Arg Thr Val Asn Ser Leu Ala Val Lys5 10 15Ser Leu Leu Met Ser Ala Glu Asn Asn Ile Met Pro Asn Ser Gln20 25 30Ala Ser Thr Asp Ser His Phe Lys Leu Ser Leu Trp Leu Arg Val35 40 45Pro Lys Val Leu Lys Gln Val Ser Ile Gln Lys Leu Phe Lys Val50 55 60Ala Gly Asp Glu Thr Asn Lys Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys65 70 75Ile Pro Asn His Asn Ser Val Glu Thr Ala Leu Asn Ile Thr Val80 85 90Ile Cys Lys His Gln Leu Pro Ile Arg Lys Cys Lys Ala Pro Phe95 100 105Glu Leu Ser Met Met Phe Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Ile110 115 120Val His Asp Pro Ser Tyr Pro Lys Gly Ser Val Pro Met Leu Trp125 130 135Leu Glu Thr His Thr Sar Leu His Lys Phe Phe Ala Thr Asn Leu140 145 150Gln Glu Asp Val Ile Ile Tyr Thr Leu Asn Asn Leu Glu Leu Thr155 160 165Pro Gly Lys Leu Asp Lau Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu170 175 180Asp Ala Tyr Lys Atg Asp Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys185 190 195Leu Pro Ser Ash Thr Gln Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln200 205 210Ile Pro Ser Trp Lys Ile Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Lys Ile215 220 225Ser Pro Gln Ser Ile Ser Val Ala Lys Ser Lau Leu Lys Leu Asp230 235 240Leu Ser Gly Ile Lys Lys Lys Glu Ser Lys Val Lys Glu Ala Tyr245 250 255Ala Ser Gly Ser Lys260(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度858個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA GATAAAGAAA GCTTTATATA 50TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT 100GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC ATTTCATAGA ACTTGTTAAG 150GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT TCCTTTAGCA TTAGGATTGC 200TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC CCTTCTTCAC CTGATCTTCA 250TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA GTGCAAACTT TTCCTAAGGC 300TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT CCCGAGATCC TTGTATTTTG 350CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA TCATCTCAAA GCTATCAACT 400GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC ATTATGGCAA GCCTCACAGA 450CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC TTGACTCAAA GGGTGGGAAG 500CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT CAGAATTCCC AGTTTCCTCA 550ACAAGCCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC CTTCTGAAGG TCATGTCAGT 600GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT GGTAATTTTA CCAAAAGTAA 650AATCGATTTG CTTAATAACC TTCATTATGC TCTGACGATT CTTCAGGAAT 700GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG ATCTGGTCAA GGTTTTCCAG 750ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG ATTCTGATCT TCCTCAAACT 800CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA CAATGCTTTC CTTAGTGAGC 850TTAACCAT 858(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度2028個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9AAATTCTCTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG 100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA 150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT 200CTATTGCCTG CATTCCAAAC CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT 250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT 300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC 350ATGATCCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC 400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT 450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG 500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT 550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACTA TGTCTTATTT 600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA 650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT 700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC 750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT 800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT 850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA 900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA 950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGC AAACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGG TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTGCAAACTT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGACTCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT 1700CAGAATTCCC AGTTTCCTCA ACAAGCCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC 1750CTTCTGAAGG TCATGTCAGT GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT 1800GGTAATTTTA CCAAAAGTAA AATCGCTTTG CTTAATAACC TTCATTATGC 1850TCTGACGATT CTTCAGGAAT GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG 1900ATCTGGTCAA GGTTTTCCAG ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG 1950ATTCTGATCT TCCTCAAACT CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA 2000CAATGCTTTC CTTAGTGAGC TTAACCAT 2028(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TTCTGGTCTT CTTCAAACT CA 22(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CTGTAGCCAT GAGCAAAG 18(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度467個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ser Ser Gly Val Tyr Glu Ser Ile Ile Gln Thr Lys Ala Ser5 10 15Val Trp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Lys Ser Ile Val Asp Ser Tyr20 25 30Trp Ile Tyr Glu Phe Pro Thr Gly Ser Pro Leu Val Gln Thr Gln35 40 45Leu Tyr Ser Asp Ser Arg Ser Lys Ser Ser Phe Gly Tyr Thr Ser50 55 60Lys Ile Gly Asp Ile Pro Ala Val Glu Glu Glu Ile Leu Ser Gln65 70 75Asn Val His Ile Pro Val Phe Asp Asp Ile Asp Phe Ser Ile Asn80 85 90Ile Asn Asp Ser Phe Leu Ala Ile Ser Val Cys Ser Asn Thr Val95 100 105Asn Thr Asn Gly Val Lys His Gln Gly His Leu Lys Val Leu Ser110 115 120Leu Ala Gln Leu His Pro Phe Glu Pro Val Met Ser Arg Ser Glu125 130 135Ile Ala Ser Arg Phe Arg Leu Gln Glu Glu Asp Ile Ile Pro Asp140 145 150Asp Lys Tyr Ile Ser Ala Ala Asn Lys Gly Ser Leu Ser Cys Val155 160 165Lys Glu His Thr Tyr Lys Val Glu Met Ser His Asn Gln Ala Leu170 175 180Gly Lys Val Asn Val Leu Ser Pro Asn Arg Asn Val His Glu Trp185 190 195Leu Tyr Ser Phe Lys Pro Asn Glu Asn Gln Ile Glu Ser Asn Asn200 205 210Arg Thr Val Asn Ser Leu Ala Val Lys Ser Leu Leu Met Ala Thr215 220 225Glu Asn Asn Ile Met Pro Asn Ser Gln Ala Phe Val Lys Ala Ser230 235 240Thr Asp Ser His Phe Lys Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ile Pro Lys245 250 255Val Leu Lys Gln Ile Ala Ile Gln Lys Leu Phe Lys Phe Ala Gly260 265 270Asp Glu Thr Gly Lys Ser Phe Tyr Teu Ser Ile Ala Cys Ile Pro275 280 285Asn His Asn Ser Val Glu Thr Ala Leu Asn Val Thr Val Ile Cys290 295 300Arg His Gln Leu Pro Ile Pro Lys Ser Lys Ala Pro Phe Glu Leu305 310 315Ser Met Ile Phe Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Thr Val His320 325 330Asp Pro Ser Tyr Pro Gln Arg Ile Val His Ala Leu Leu Glu Thr335 340 345His Thr Ser Phe Ala Gln Val Leu Cys Asn Lys Leu Gln Glu Asp350 355 360Val Ile Ile Tyr Thr Ile Asn Ser Pro Glu Leu Thr Pro Ala Lys365 370 375Leu Asp Leu Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu Asp Ala Ser380 385 390Lys Lys Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys Leu Pro Val395 400 405Asn Val Gln Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln Ile Pro Ser410 415 420Trp Lys Ile Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Arg Ile Ser Pro Gln425 430 435Ser Thr Pro Ile Ala Arg Ser Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Lys440 445 450Ile Lys Glu Lys Lys Ser Leu Thr Trp Glu Thr Ser Ser Tyr Asp455 460 465Leu Glu；(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度258個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Ser Lys Val Lys Leu Thr Lys Glu Asn Ile Val Ser Leu Leu5 10 15Thr Gln Ser Ala Asp Val Glu Phe Glu Glu Asp Gln Asn Gln Val20 25 30Ala Phe Asn Phe Lys Thr Phe Cys Gln Glu Asn Leu Asp Leu Ile35 40 45Lys Lys Met Ser Ile Thr Ser Cys Leu Thr Phe Leu Lys Asn Arg50 55 60Gln Gly Ile Met Lys Val Val Asn Gln Ser Asp Phe Thr Phe Gly65 70 75Lys Val Thr Ile Lys Lys Asn Ser Glu Arg Val Gly Ala Lys Asp80 85 90Met Thr Phe Arg Arg Leu Asp Ser Met Ile Arg Val Lys Leu Ile95 100 105Glu Glu Thr Ala Asn Asn Glu Asn Leu Ala Ile Ile Lys Ala Lys110 115 120Ile Ala Ser His Pro Leu Val Gln Ala Tyr Gly Leu Pro Leu Ala125 130 135Asp Ala Lys Ser Val Arg Leu Ala Ile Met Leu Gly Gly Ser Ile140 145 150Pro Leu Ile Ala Ser Val Aso Ser Phe Glu Met Ile Ser Val Val155 160 165Leu Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Ile Glu170 175 180Pro Thr Lys Tyr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Gly Lys Val Cys Thr185 190 195Val Leu Lys Ser Lys Gly Phe Thr Met Asp Asp Ala Gln Ile Asn200 205 210Lys Gly Lys Glu Tyr Ala Lys Ile Leu Ser Ser Cys Asn Pro Asn215 220 225Ala Lys Gly Ser Ile Ala Met Asp Tyr Tyr Ser Asp Asn Leu Asp230 235 240Lys Phe Tyr Glu Met Phe Gly Val Lys Lys Glu Ala Lys Ile Ala245 250 255Gly Val Ala(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度3049個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DAN(xi)序列描述SEQ ID NO14AGAGCAATTG GGTCATTTTT TATTCTAAAT CGAACCTCAA CTAGCAAATC 50TCAGAACTGT AATAAGCACA AGAGCACAAG AGCCACAATG TCATCAGGTG100TTTATGAATC GATCATTCAG ACAAAGGCTT CAGTTTGGGG ATCGACAGCA150TCTGGTAAGT CCATCGTGGA TTCTTACTGG ATTTATGAGT TTCCAACTGG200TTCTCCACTG GTTCAAACTC AGTTGTACTC TGATTCGAGG AGCAAAAGTA250GCTTCGGCTA CACTTCAAAA ATTGGTGATA TTCCTGCTGT AGAGGAGGAA300ATTTTATCTC AGAACGTTCA TATCCCAGTG TTTGATGATA TTGATTTCAG350CATCAATATC AATGATTCTT TCTTGGCAAT TTCTGTTTGT TCCAACACAG400TTAACACCAA TGGAGTGAAG CATCAGGGTC ATCTTAAAGT TCTTTCTCTT450GCCCAATTGC ATCCCTTTGA ACCTGTGATG AGCAGGTCAG AGATTGCTAG500CAGATTCCGG CTCCAAGAAG AAGATATAAT TCCTGATGAC AAATATATAT550CTGCTGCTAA CAAGGGATCT CTCTCCTGTG TCAAAGAACA TACTTACAAA600GTCGAAATGA GCCACAATCA GGCTTTAGGC AAAGTGAATG TTCTTTCTCC650TAACAGAAAT GTTCATGAGT GGCTGTATAG TTTCAAACCA AATTTCAACC700AGATCGAAAG TAATAACAGA ACTGTAAATT CTCTTGCAGT CAAATCTTTG750CTCATGGCTA CAGAAAACAA CATTATGCCT AACTCTCAAG CTTTTGTTAA800AGCTTCTACT GATTCTCATT TTAAGTTGAG CCTTTGGCTG AGAATTCCAA850AAGTTTTGAA GCAAATAGCC ATACAGAAGC TCTTCAAGTT TGCAGGAGAC900GAAACCGGTA AAAGTTTCTA TTTGTCTATT GCATGCATCC CAAATCACAA950CAGTGTGGAA ACAGCTTTAA ATGTCACTGT TATATGTAGA CATCAGCTTC 1000CAATCCCTAA GTCCAAAGCT CCTTTTGAAT TATCAATGAT TTTCTCCGAT 1050CTGAAAGAGC CTTACAACAC TGTGCATGAT CCTTCATATC CTCAAAGGAT 1100TGTTCATGCT TTGCTTGAGA CTCACACTTC CTTTGCACAA GTTCTCTGCA 1150ACAAGCTGCA AGAAGATGTG ATCATATATA CTATAAACAG CCCTGAACTA 1200ACCCCAGCTA AGCTGGATCT AGGTGAAAGA ACCTTGAACT ACAGTGAAGA 1250TGCTTCGAAG AAGAAGTATT TTCTTTCAAA AACACTCGAA TGCTTGCCAG 1300TAAATGTGCA GACTATGTCT TATTTGGATA GCATCCAGAT TCCTTCATGG 1350AAGATAGACT TTGCCAGAGG AGAGATCAGA ATCTCCCCTC AATCTACTCC 1400TATTGCAAGA TCTTTGCTCA AGCTGGATTT GAGCAAGATC AAGGAAAAGA 1450AGTCCTTGAC TTGGGAAACA TCCAGCTATG ATCTAGAATA AAAGTGGCTC 1500ATACTACTCT AAGTAGTATT TGTCAACTTG CTTATCCTTT ATGTTGTTTA 1550TTTCTTTTAA ATCTAAAGTA AGTTAGATTC AAGTAGTTTA GTATGCTATA 1600GCATTATTAC AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAATATAA 1650AAAACCCAAA AAGATCCCAA AAGGGACGAT TTGGTTGATT TACTCTGTTT 1700TAGGCTTATC TAAGCTGCTT TTGTTTGAGC AAAATAACAT TGTAACATGC 1750AATAACTGGA ATTTAAAGTC CTAAAAGAAG TTTCAAAGGA CAGCTTAGCC 1800AAAATTGGTT TTTGTTTTTG TTTTTTTGTT TTTTGTTTTT TTGTTTTATT 1850TTTATTTTTA GTTTATTTTT TGTTTTTGTT ATTTTTATTT TTATTTTATT 1900TTCTTTTATT TTATTTATAT ATATATCAAA CACAATCCAC ACAAATAATT 1950TTAATTTCAA ACATTCTACT GATTTAACAC ACTTAGCCTG ACTTTATCAC 2000ACTTAACACG CTTAGTTAGG CTTTAACACA CTGAACTGAA TTAAAACACA 2060CTTAGTATTA TGCATCTCTT AATTAACACA CTTTAATAAT ATGCATCTCT 2100GAATCAGCCT TAAAGAAGCT TTTATGCAAC ACCAGCAATC TTGGCCTCTT 2150TCTTAACTCC AAACATTTCA TAGAATTTGT CAAGATTATC ACTGTAATAG 2200TCCATAGCAA TGCTTCCCTT AGCATTGGGA TTGCAAGAAC TAAGTATCTT 2250GGCATATTCT TTCCCTTTGT TTATCTGTGC ATCATCCATT GTAAATCCTT 2300TGCTTTTAAG CACTGTGCAA ACCTTCCCCA GAGCTTCCTT AGTGTTGTAC 2350TTAGTTGGTT CAATCCCTAA CTCCTTGTAC TTTGCATCTT GATATATGGC 2400AAGAACAACA CTGATCATCT CGAAGCTGTC AACAGAAGCA ATGAGAGGGA 2450TACTACCTCC AAGCATTATA GCAAGTCTCA CAGATTTTGC ATCTGCCAGA 2500GGCAGCCCGT AAGCTTGGAC CAAAGGGTGG GAGGCAATTT TTGCTTTGAT 2550AATAGCAAGA TTCTCATTGT TTGCAGTCTC TTCTATGAGC TTCACTCTTA 2600TCATGCTATC AAGCCTCCTG AAAGTCATAT CCTTAGCTCC AACTCTTTCA 2650GAATTTTTCT TTATCGTGAC CTTACCAAAA GTAAAATCAC TTTGGTTCAC 2700AACTTTCATA ATGCCTTGGC GATTCTTCAA GAAAGTCAAA CATGAAGTGA 2750TACTCATTTT CTTAATCAGG TCAAGATTTT CCTGACAGAA AGTCTTAAAG 2800TTGAATGCGA CCTGGTTCTG GTCTTCTTCA AACTCAACAT CTGCAGATTG 2850AGTTAAAAGA GAGACAATGT TTTCTTTTGT GAGCTTGACC TTAGACATGG 2900TGGCAGTTTA GATCTAGACC TTTCTCGAGA GATAAGATTC AAGGTGAGAA 2950AGTGCAACAC TGTAGACCGC GGTCGTTACT TATCCTGTTA ATGTGATGAT 3000TTGTATTGCT GAGTATTAGG TTTTTGAATA AAATTGACAC AATTGCTCT 3049(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度778個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15ATG CAA CAC CAG CAA TCT TGG CCT CTT TCT TAA CTC CAA 39ACA TTT CAT AGA ATT TGT CAA GAT TAT CAC TGT AAT AGT 78CCA TAG CAA TGC TTC CCT TAG CAT TGG GAT TGC AAG AAC 117TAA GTA TCT TGG CAT ATT CTT TCC CTT TGT TTA TCT GTG 156CAT CAT CCA TTG TAA ATC CTT TGC TTT TAA GCA CTG TGC 195AAA CCT TCC CCA GAG CTT CCT TAG TGT TGT ACT TAG TTG 234GTT CAA TCC CTA ACT CCT TGT ACT TTG CAT CTT GAT ATA 273TGG CAA GAA CAA CAC TGA TCA TCT CGA AGC TGT CAA CAG 312AAG CAA TGA GAG GGA TAC TAC CTC CAA GCA TTA TAG CAA 351GTC TCA CAG ATT TTG CAT CTG CCA GAG GCA GCC CGT AAG 390CTT GGA CCA AAG GGT GGG AGG CAA TTT TTG CTT TGA TAA 429TAG CAA GAT TCT CAT TGT TTG CAG TCT CTT CTA TGA GCT 468TCA CTC TTA TCA TGG TAT CAA GCC TCC TGA AAG TCA TAT 507CCT TAG CTC VAA CTC TTT CAG AAT TTT TCT TTA TCG TGA 546CCT TAC CAA AAG TAA AAT CAC TTT GGT TCA CAA CTT TCA 585TAA TGC CTT GGC GAT TCT TCA AGA AAG TCA AAC ATG AAG 524TGA TAC TCA TTT TCT TAA TCA GGT CAA GAT TTT CCT GAC 663AGA AAG TCT TAA AGT TGA ATG CGA CCT GGT TCT GGT CTT 702CTT CAA ACT CAA CAT CTG CAG ATT GAG TTA AAA GAG AGA 741CAA TGT TTT CTT TTG TGA GCT TGA CCT TAG ACA TGG 778(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GTTCTGAGAT TTGCTAGT 18(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17TTATATCTTC TTCTTGGA 18(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度1401個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18ATG TCA TCA GGT GTT TAT GAA TCG ATC ATT CAG ACA AAG 39GCT TCA GTT TGG GGA TCG ACA GCA TCT GGT AAG TCC ATC 78GTG GAT TCT TAC TGG ATT TAT GAG TTT CCA ACT GGT TCT 117CCA CTG GTT CAA ACT CAG TTG TAC TCT GAT TCG AGG AGC 156AAA AGT AGC TTC GGC TAC ACT TCA AAA ATT GGT GAT ATT 195CCT GCT GTA GAG GAG GAA ATT TTA TCT CAG AAC GTT CAT 234ATC CCA GTG TTT GAT GAT ATT GAT TTC AGC ATC AAT ATC 273AAT GAT TCT TTC TTG GCA ATT TCT GTT TGT TCC AAC ACA 312GTT AAC ACC AAT GGA GTG AAG CAT CAG GGT CAT CTT AAA 351GTT CTT TCT CTT GCC CAA TTG CAT CCC TTT GAA CCT GTG 390ATG AGC AGG TCA GAG ATT GCT AGC AGA TTC CGG CTC CAA 429GAA GAA GAT ATA ATT CCT GAT GAC AAA TAT ATA TGT GCT 468GCT AAC AAG GGA TCT CTC TCC TGT GTC AAA GAA CAT ACT 507TAC AAA GTC GAA ATG AGC CAC AAT CAG GCT TTA GGC AAA 546GTG AAT GTT CTT TCT CCT AAC AGA AAT GTT CAT GAG TGG 585CTG TAT AGT TTC AAA CCA AAT TTC AAC CAG ATC GAA AGT624AAT AAC AGA ACT GTA AAT TCT CTT GCA GTC AAA TCT TTG663CTC ATG GCT ACA GAA AAC AAC ATT ATG CCT AAC TCT CAA702GCT TTT GTT AAA GCT TCT ACT GAT TCT CAT TTT AAG TTG741AGC CTT TGG CTG AGA ATT CCA AAA GTT TTG AAG CAA ATA780GCC ATA CAG AAG CTC TTC AAG TTT GCA GGA GAC GAA ACC819GGT AAA AGT TTC TAT TTG TCT ATT GCA TGC ATC CCA AAT858CAC AAC AGT GTG GAA ACA GCT TTA AAT GTC ACT GTT ATA897TGT AGA CAT CAG CTT CCA ATC CCT AAG TCC AAA GCT CCT936TTT GAA TTA TCA ATG ATT TTC TCC GAT CTG AAA GAG CCT975TAC AAC ACT GTG CAT GAT CCT TCA TAT CCT CAA AGG ATT 1014GTT CAT GCT TTG CTT GAG ACT CAC ACT TCC TTT GCA CAA 1053GTT CTC TGC AAC AAG CTG CAA GAA GAT GTG ATC ATA TAT 1092ACT ATA AAC AGC CCT GAA CTA ACC CCA GCT AAG CTG GAT 1131CTA GGT GAA AGA ACC TTG AAC TAC AGT GAA GAT GCT TCG 1170AAG AAG AAG TAT TTT CTT TCA AAA ACA CTC GAA TGC TTG 1209CCA GTA AAT GTG CAG ACT ATG TCT TAT TTG GAT AGC ATC 1248CAG ATT CCT TCA TGG AAG ATA GAC TTT GCC AGA GGA GAG 1287ATC AGA ATC TCC CCT CAA TCT ACT CCT ATT GCA AGA TCT 1326TTG CTC AAG CTG GAT TTG AGC AAG ATC AAG GAA AAG AAG 1365TCC TTG ACT TGG GAA ACA TCC AGC TAT GAT CTA GAA 1401(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度777個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19ATG TCT AAG GTC AAG CTC ACA AAA GAA AAC ATT GTC TCT CTT TTA 45ACT CAA TCT GCA GAT GTT GAG TTT GAA GAA GAC CAG AAC CAG GTC 90GCA TTC AAC TTT AAG ACT TTC TGT CAG GAA AAT CTT GAC CTG ATT135AAG AAA ATG AGT ATC ACT TCA TGT TTG ACT TTC TTG AAG AAT CGC180CAA GGC ATT ATG AAA GTT GTG AAC CAA AGT GAT TTT ACT TTT GGT225AAG GTC ACG ATA AAG AAA AAT TCT GAA AGA GTT GGA GCT AAG GAT270ATG ACT TTC AGG AGG CTT GAT AGC ATG ATA AGA GTG AAG CTC ATA315GAA GAG ACT GCA AAC AAT GAG AAT CTT GCT ATT ATC AAA GCA AAA360ATT GCC TCC CAC CCT TTG GTC CAA GCT TAC GGG CTG CCT CTG GCA405GAT GCA AAA TCT GTG AGA CTT GCT ATA ATG CTT GGA GGT AGT ATC450CCT CTC ATT GCT TCT GTT GAC AGC TTC GAG ATG ATC AGT GTT GTT495CTT GCC ATA TAT CAA GAT GCA AAG TAC AAG GAG TTA GGG ATT GAA540CCA ACT AAG TAC AAC ACT AAG GAA GCT CTG GGG AAG GTT TGC ACA585GTG CTT AAA AGC AAA GGA TTT ACA ATG GAT GAT GCA CAG ATA AAC630AAA GGG AAA GAA TAT GCC AAG ATA CTT AGT TCT TGC AAT CCC AAT675GCT AAG GGA AGC ATT GCT ATG GAC TAT TAC AGT GAT AAT CTT GAC720AAA TTC TAT GAA ATG TTT GGA GTT AAG AAA GAG GCC AAG ATT GCT765GGT GTT GCA TAA 777(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO20TACTTATCTA GAACCATGGA CAAAGCAAAG ATTACCAAGG 40(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征
(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO21TACAGTGGAT CCATGGTTAT TTCAAATAAT TTATAAAAGC AC 42(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCATTGGAT CCATGGTTAA CACACTAAGC AAGCAC 36(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO23AGCTAATCTA GAACCATGGA TGACTCACTA AGGAAAGCAT TGTTGC 46(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO24CCCACTATCC TTCGCAAGAC CC 22(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO25TACAGTGGAT CCATGGTTAA GGTAATCCAT AGGCTTGAC 39(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO26AGCTAACCAT GGTTAAGCTC ACTAAGGGAAA GCATTGTTGC 40(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO27AGCTAATCTA GAACCATGGA TGACTCACTA AGGAAAGCAT TGTTGC 46(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO28AGCATTGGAT CCATGGTTAA CACACTAAGC AAGCAC 36(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO29TACAGTTCTA GAACCATGGA TGATGCAAAG TCTGTGAGG 39(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO30AGATTCTCTA GACCATGGTG ACTTGATGAG CAAAGTCTGT GAGGCTTGC 49因此，在我們已經(jīng)對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行闡明和描述的時候，應(yīng)理解為對本發(fā)明能夠進行改變和修改，所以我們不希望被前述的確切術(shù)語所限制，希望我們自己能利用使本發(fā)明適合各種不同用途和情況所做的這種改變和變化。這種改變和修改，如，包括結(jié)構(gòu)上相似的核酸序列的替換，其中所述序列與變化的序列間的差異使得用該變化的序列幾乎不會帶來任何好處(如果有好處的話)，也就是說，該序列實質(zhì)上產(chǎn)生與如前所述相似的結(jié)果。因此，由替換、缺失、插入、或增加核苷酸(在核苷酸序列內(nèi))或氨基酸(在肽序列內(nèi))所致的實質(zhì)上并不會改變這些序列特別是上面所詳述的序列的功能的序列變化被視為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，我們意欲將本發(fā)明加以修改，將來自不同分離株的N基因放在一單一的盒子(cassette)里，這些基因按照本發(fā)明使Tospovirus感染的植物產(chǎn)生抗性或免疫性，用該盒作為一個轉(zhuǎn)基因以使獲得Tospoviruses廣泛的抗性，特別是對TSWV-BL，TSWV-B和INSV的抗性。相應(yīng)地，等同物全長范圍內(nèi)的這種變化和改變當然是在等同物的全部范圍內(nèi)，因此也在下面所述的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
因此，已經(jīng)對我們的發(fā)明和方式及制造和使用它的方法進行了全面、清楚、簡明和準確的描述，以便本發(fā)明所屬領(lǐng)域或與本發(fā)明極相近領(lǐng)域的任何技術(shù)人員能夠制造和使用。
權(quán)利要求
1.選自下列的分離的核苷酸序列AAATTCTCTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG 100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA 150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT 200CTATTGCCTG CATTCCAAAG CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT 250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT 300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC 350ATGATGCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC 400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT 450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG 500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT 550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACTA TGTCTTATTT 600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA 650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT 700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC 750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT 800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT 850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA 900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA 950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGCA AACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCACA AACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGC TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTGCAAACTT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGAATCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT 1700CAGAATTCC 1709；TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA GATAAAGAAA GCTTTATATA50TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT 100GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC ATTTCATAGA ACTTGTTAAG 150GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT TCCTTTAGCA TTAGGATTGC 200TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC CCTTCTTCAC CTGATCTTCA 250TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA GTGCAAACTT TTCCTAAGGC300TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT CCCGAGATCC TTGTATTTTG350CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA TCATCTCAAA GCTATCAACT400GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC ATTATGGCAA GCCTCACAGA450CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC TTGACTCAAA GGGTGGGAAG500CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT CAGAATTCCC AGTTTCCTCA550ACAAGCCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC CTTCTGAAGG TCATGTCAGT600GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT GGTAATTTTA CCAAAAGTAA650AATCGCTTTG CTTAATAACC TTCATTATGC TCTGACGATT CTTCAGGAAT700GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG ATCTGGTCAA GGTTTTCCAG750ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG ATTCTGATCT TCCTCAAACT800CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA CAATGCTTTC CTTAGTGAGC850TTAACCAT 858；AAATTCTCTT GCAGTGAAAT CTCTGCTCAT GTTAGCAGAA AACAACATCA 50TGCCTAACTC TCAAGCTTTT GTCAAAGCTT CTACTGATTC TAATTTCAAG100CTGAGCCTCT GGCTAAGGGT TCCAAAGGTT TTGAAGCAGA TTTCCATTCA150GAAATTGTTC AAGGTTGCAG GAGATGAAAC AAATAAAACA TTTTATTTAT200CTATTGCCTG CATTCCAAAC CATAACAGTG TTGAGACAGC TTTAAACATT250ACTGTTATTT GCAAGCATCA GCTCCCAATT CGTAAATGTA AAACTCCTTT300TGAATTATCA ATGATGTTTT CTGATTTAAA GGAGCCTTAC AACATTATTC350ATGATCCTTC ATATCCCCAA AGGATTGTTC ATGCTCTGCT TGAAACTCAC400ACATCTTTTG CACAAGTTCT TTGCAACAAC TTGCAAGAAG ATGTGATCAT450CTACACCTTG AACAACCATG AGCTAACTCC TGGAAAGTTA GATTTAGGTG500AAATAACTTT GAATTACAAT GAAGACGCCT ACAAAAGGAA ATATTTCCTT550TCAAAAACAC TTGAATGTCT TCCATCTAAC ATACAAACTA TGTCTTATTT600AGACAGCATC CAAATCCCTT CCTGGAAGAT AGACTTTGCC AGGGGAGAAA650TTAAAATTTC TCCACAATCT ATTTCAGTTG CAAAATCTTT GTTAAATCTT700GATTTAAGCG GGATTAAAAA GAAAGAATCT AAGATTAAGG AAGCATATGC750TTCAGGATCA AAATGATCTT GCTGTGTCCA GCTTTTTCTA ATTATGTTAT800GTTTATTTTC TTTCTTTACT TATAATTATT TTTCTGTTTG TCATTTCTTT850CAAATTCCTC CTGTCTAGTA GAAACCATAA AAACAAAAAT AAAAATAAAA900TAAAATCAAA ATAAAATAAA AATCAAAAAA TGAAATAAAA GCAACAAAAA950AATTAAAAAA CAAAAAACCA AAAAAGATCC CGAAAGGACA ATTTTGGCCA 1000AATTTGGGGT TTGTTTTTGT TTTTTGTTTT TTTGTTTTTT GTTTTTATTT 1050TTATTTTTAT TTTTATTTTT ATTTTATTTT ATTTTATGTT TTTGTTGTTT 1100TTGTTATTTT GTTATTTATT AAGCACAACA CACAGAAAGC AAACTTTAAT 1150TAAACACACT TATTTAAAAT TTAACACACT AAGCAAGCAC AAACAATAAA 1200GATAAAGAAA GCTTTATATA TTTATAGGCT TTTTTATAAT TTAACTTACA 1250GCTGCTTTTA AGCAAGTTCT GTGAGTTTTG CCTGTTTTTT AACCCCAAAC 1300ATTTCATAGA ACTTGTTAAG GGTTTCACTG TAATGTTCCA TAGCAATACT 1350TCCTTTAGCA TTAGGATTGC TGGAGCTAAG TATAGCAGCA TACTCTTTCC 1400CCTTCTTCAC CTGATCTTCA TTCATTTCAA ATGCTTTTCT TTTCAGCACA 1450GTGCAAACTT TTCCTAAGGC TTCCCTGGTG TCATACTTCT TTGGGTCGAT 1500CCCGAGATCC TTGTATTTTG CATCCTGATA TATAGCCAAG ACAACACTGA 1550TCATCTCAAA GCTATCAACT GAAGCAATAA GAGGTAAGCT ACCTCCCAGC 1600ATTATGGCAA GCCTCACAGA CTTTGCATCA TCAAGAGGTA ATCCATAGGC 1650TTGACTCAAA GGGTGGGAAG CAATCTTAGA TTTGATAGTA TTGAGATTCT1700CAGAATTCCC AGTTTCCTCA ACAAGCCTGA CCCTGATCAA GCTATCAAGC1750CTTCTGAAGG TCATGTCAGT GGCTCCAATC CTGTCTGAAG TTTTCTTTAT1800GGTAATTTTA CCAAAAGTAA AATCGCTTTG CTTAATAACC TTCATTATGC1850TCTGACGATT CTTCAGGAAT GTCAGACATG AAATAATGCT CATCTTTTTG1900ATGTGGTCAA GGTTTTCCAG ACAAAAAGTC TTGAAGTTGA ATGCTACCAG1950ATTCTGATCT TCCTCAAACT CAAGGTCTTT GCCTTGTGTC AACAAAGCAA2000CAATGCTTTC CTTAGTGAGC TTAACCAT 2028；和AGAGCAATTG GGTCATTTTT TATTCTAAAT CGAACCTCAA CTAGCAAATC 50TCAGAACTGT AATAAGCACA AGAGCACAAG AGCCACAATG TCATCAGGTG 100TTTATGAATC GATCATTCAG ACAAAGGCTT CAGTTTGGGG ATCGACAGCA 150TCTGGTAAGT CCATCGTGGA TTCTTACTGG ATTTATGAGT TTCCAACTGG 200TTCTCCACTG GTTCAAACTC AGTTGTACTC TGATTCGAGG AGCAAAAGTA 250GCTTCGGCTA CACTTCAAAA ATTGGTGATA TTCCTGCTGT AGAGGAGGAA 300ATTTTATCTC AGAACGTTCA TATCCCAGTG TTTGATGATA TTGATTTCAG 350CATCAATATC AATGATTCTT TCTTGGCAAT TTCTGTTTGT TCCAACACAG 400TTAACACCAA TGGAGTGAAG CATCAGGGTC ATCTTAAAGT TCTTTCTCTT 450GCCCAATTGC ATCCCTTTGA ACCTGTGATG AGCAGGTCAG AGATTGCTAG 500CAGATTCCGG CTCCAAGAAG AAGATATAAT TCCTGATGAC AAATATATAT 550CTGCTGCTAA CAAGGGATCT CTCTCCTGTG TCAAAGAACA TACTTACAAA 600GTCGAAATGA GCCACAATCA GGCTTTAGGC AAAGTGAATG TTCTTTCTCC 650TAACAGAAAT GTTCATGAGT GGCTGTATAG TTTCAAACCA AATTTCAACC 700AGATCGAAAG TAATAACAGA ACTGTAAATT CTCTTGCAGT CAAATCTTTG 750CTCATGGCTA CAGAAAACAA CATTATGCCT AACTCTCAAG CTTTTGTTAA 800AGCTTCTACT GATTCTCATT TTAAGTTGAG CCTTTGGCTG AGAATTCCAA 850AAGTTTTGAA GCAAATAGCC ATACAGAAGC TCTTCAAGTT TGCAGGAGAC 900GAAACCGGTA AAAGTTTCTA TTTGTCTATT GCATGCATCC CAAATCACAA 950CAGTGTGGAA ACAGCTTTAA ATGTCACTGT TATATGTAGA CATCAGCTTC1000CAATCCCTAA GTCCAAAGCT CCTTTTGAAT TATCAATGAT TTTCTCCGAT1050CTGAAAGAGC CTTACAACAC TGTGCATGAT CCTTCATATC CTCAAAGGAT1100TGTTCATGCT TTGCTTGAGA CTCACACTTC CTTTGCACAA GTTCTCTGCA1150ACAAGCTGCA AGAAGATGTG ATCATATATA CTATAAACAG CCCTGAACTA1200ACCCCAGCTA AGCTGGATCT AGGTGAAAGA ACCTTGAACT ACAGTGAAGA1250TGCTTCGAAG AAGAAGTATT TTCTTTCAAA AACACTCGAA TGCTTGCCAG1300TAAATGTGCA GACTATGTCT TATTTGGATA GCATCCAGAT TCCTTCATGG1350AAGATAGACT TTGCCAGAGG AGAGATCAGA ATCTCCCCTC AATCTACTCC1400TATTGCAAGA TCTTTGCTCA AGCTGGATTT GAGCAAGATC AAGGAAAAGA1450AGTCCTTGAC TTGGGAAACA TCCAGCTATC ATCTAGAATA AAAGTGGCTC1500ATACTACTCT AAGTAGTATT TGTCAACTTG CTTATCCTTT ATGTTGTTTA1550TTTCTTTTAA ATCTAAAGTA AGTTAGATTC AAGTAGTTTA GTATGCTATA1600GCATTATTAC AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAAATACA AAAAATATAA1650AAAACCCAAA AAGATCCCAA AAGGGACGAT TTGGTTGATT TACTCTGTTT1700TAGGCTTATC TAAGCTGCTT TTGTTTGAGC AAAATAACAT TGTAACATGC1750AATAACTGGA ATTTAAAGTC CTAAAAGAAG TTTCAAAGGA CAGCTTAGCC1800AAAATTGGTT TTTGTTTTTG TTTTTTTGTT TTTTGTTTTT TTGTTTTATT 1850TTTATTTTTA GTTTATTTTT TGTTTTTGTT ATTTTTATTT TTATTTTATT 1900TTCTTTTATT TTATTTATAT ATATATCAAA CACAATCCAC ACAAATAATT 1950TTAATTTCAA ACATTCTACT GATTTAACAC ACTTAGCCTG ACTTTATCAC 2000ACTTAACACG CTTAGTTAGG CTTTAACACA CTGAACTGAA TTAAAACACA 2050CTTAGTATTA TGCATCTCTT AATTAACACA CTTTAATAAT ATGCATCTCT 2100GAATCAGCCT TAAAGAAGCT TTTATGCAAC ACCAGCAATC TTGGCCTCTT 2150TCTTAACTCC AAACATTTCA TAGAATTTGT CAAGATTATC ACTGTAATAG 2200TCCATAGCAA TGCTTCCCTT AGCATTGGGA TTGCAAGAAC TAAGTATCTT 2250GGCATATTCT TTCCCTTTGT TTATCTGTGC ATCATCCATT GTAAATCCTT 2300TGCTTTTAAG CACTGTGCAA ACCTTCCCCA GAGCTTCCTT AGTGTTGTAC 2350TTAGTTGGTT CAATCCCTAA CTCCTTGTAC TTTGCATCTT GATATATGGC 2400AAGAACAACA CTGATCATCT CGAAGCTGTC AACAGAAGCA ATGAGAGGGA 2450TACTACCTCC AAGCATTATA GCAAGTCTCA CAGATTTTGC ATCTGCCAGA 2500GGCAGCCCGT AAGCTTGGAC CAAAGGGTGG GAGGCAATTT TTGCTTTGAT 2550AATAGCAAGA TTCTCATTGT TTGCAGTCTC TTCTATGAGC TTCACTCTTA 2600TCATGCTATC AAGCCTCCTG AAAGTCATAT CCTTAGCTCC AACTCTTTCA 2650GAATTTTTCT TTATCGTGAC CTTACCAAAA GTAAAATCAC TTTGGTTCAC 2700AACTTTCATA ATGCCTTGGC GATTCTTCAA GAAAGTCAAA CATGAAGTGA 2750TACTCATTTT CTTAATCAGG TCAAGATTTT CCTGACAGAA AGTCTTAAAG 2800TTGAATGCGA CCTGGTTCTG GTCTTCTTCA AACTCAACAT CTGCAGATTG 2850AGTTAAAAGA GAGACAATGT TTTCTTTTGT GAGCTTGACC TTAGACATGG 2900TGGCAGTTTA GATCTAGACC TTTCTCGAGA GATAAGATTC AAGGTGAGAA 2950AGTGCAACAC TGTAGACCGC GGTCGTTACT TATCCTGTTA ATGTGATGAT 3000TTGTATTGCT GAGTATTAGG TTTTTGAATA AAATTGACAC AATTGCTCT 3049
2.易于被Tospoviruses感染的植物，它有轉(zhuǎn)基因插入到其基因組中，使其具有對Tospoviruses感染的抗性，所述轉(zhuǎn)基因選自TSWV-BL，TSWV-10W，INSV-LI，TSWV-B、Tospovirus的核蛋白基因，所述轉(zhuǎn)基因由TSWV-BL，TSWV-10W，TSWV-B，INSV-Beg和INSV-IL的部分或全長核蛋白基因序列、所述核蛋白基因序列的可翻譯或不可翻譯序列、和所述核蛋白基因序列的有義或反義基因序列組成。
3.一種使宿主植物具有Tospoviruses感染抗性的方法，包括在宿主植物中插入一轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因選自TSWV-BL，TSWV-10W，INSV-Beg，INSV-LI，TSWV-B的核蛋白基因、或來自核蛋白基因的核苷酸序列的混合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了西紅柿斑點枯萎病毒(TSWV)核蛋白殼的核苷酸序列，和含有TSMV分離株的核蛋白殼核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對不同血清型的Tospoviruses具有抗性。另外，生產(chǎn)出含有源自萵苣的TSWV分離株核蛋白殼核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，該植物(產(chǎn)生少量的核蛋白殼蛋白)表現(xiàn)出對同源和親緣關(guān)系密切的病毒分離株的抗性；而當植物產(chǎn)生大量核蛋白殼蛋白時，該植物對同源分離株和親緣關(guān)系遠的無耐性壞死性斑點病毒(INSV)分離株具有適當水平的保護能力。
文檔編號A01H5/00GK1118983SQ94191418
公開日1996年3月20日 申請日期1994年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月29日
發(fā)明者D·貢薩維斯, S-Z·彭 申請人:康乃爾研究基金會有限公司