專利名稱：穩(wěn)定的凍干哺乳動物細胞及其制備方法
一般地講，本發(fā)明涉及凍干生物學材料的技術，更具體地講涉及凍干哺乳動物細胞以制備可儲存的人體細胞、雜交瘤細胞系、組織細胞以及用于免疫檢測及其它血液學分析之對照細胞的新方法，所有這些凍干細胞均具有良好的穩(wěn)定性和長儲存壽命，而且與新鮮細胞相比，其基本上具有等同的生理學參數(shù)。
凍干儲存含有生物學活性分子的脂質體及細菌培養(yǎng)物的方法是已知的。用凍干方法制作藥物片劑也是已知的。美國專利4678812公開了一種使用海藻糖化賦形劑和穩(wěn)定劑制備診斷用藥片的方法。美國專利4712310則描述了一種制備在診斷檢測中用作試劑和穩(wěn)定劑制備診斷用藥片的方法。美國專利4712310則描述了一種制備在診斷檢測中用作試劑載體的片劑的方法。
現(xiàn)有專利已描述過在脂質體內包裹藥物、核酸、蛋白質、指示分子(reportermolecules)、酶等材料的方法。這類專利有如美國專利4515736和4411894。美國專利3261761、4206200和4246349則介紹了凍干細菌的方法。1988年3月16日公開的歐州專利申請0259739涉及同一研究領域，其題目為“改善凍干培養(yǎng)物的穩(wěn)定性”。
同類現(xiàn)有技術提到糖在凍干應用中具有穩(wěn)定功能。上面提到的海藻糖也具有這種功能。1986年7月17日公開的國際專利申請(PCT)WO86/03938號中公開了在冷凍干燥期間使用海藻糖在脂質體內和脂質體外(溶液中)作為保護劑的方法。在脂質體內或脂質體外使用海藻糖是已引起注意的優(yōu)選方法。
已述及的現(xiàn)有技術均未涉及保存哺乳動物細胞，特別是人體細胞。人細胞如血液細胞的膜結構不同于細菌或脂質體的膜結構。就細菌來說，其細胞壁是很厚的非脂質壁，其作用在于保護細胞的液體內容物免受熱、滲透壓改變及在無保護劑(如糖)存在時進行冷凍干燥所引起的不利影響。因為有很堅實的細胞壁，所以許多細菌菌株都能在沒有某一種儲存保護劑或被包裹的情況下耐受冷凍和干燥的沖擊。
就脂質體來說，其液體內容物被單層或多層脂質囊泡包圍。囊泡的壁是由一種或多種有極性頭部和非極性尾部之脂質成分的一層生物分子形成的。在水溶液中，排成一層的極性頭部朝向周圍介質，而脂質分子的非極性部分則彼此相互聯(lián)接，從而在囊泡的壁中形成了一個極性表面和一種非極性核心。單層脂質體只有一層生物分子，而多層脂質體一般有許多基本上同軸心的生物分子層。因此，當將含有或不含類固醇的磷脂混合物于水溶液中分散時，即可形成一圓形的微球結構?？梢韵胂笥闷浒撤N試劑，就能在體內以識別的方式運送到某一部位。
脂質體囊壁是與人細胞差不多的人造雙脂質膜，不過人細胞膜的組成要復雜得多。除了雙脂質膜結構外，人細胞膜還有許多嵌入其脂質雙層內的額外的蛋白和糖蛋白分子。特別領人感興趣的是這些蛋白質分子提供了人造脂質體所沒有的細胞表面抗原或決定基位點。人細胞表面標志的研究是進行免疫檢測及它與人血液細胞有關之血液學檢測的關鍵課題。在使用雜交瘤細胞系和單克隆抗體時，顯然脂質體也存在同樣差異。另外，還應考慮到哺乳動物細胞的復雜液體內容物與脂質體內容物之間的差異。在人血細胞的例子中，細胞只能存在于等滲透壓液體介質中，而脂質體則可能存在于任何介質，包括非等滲溶液內。
本發(fā)明的凍干方法是獨特的，其中哺乳動物細胞可在沒有對細胞形態(tài)造成不利改變的情況下被冷干，而且當用于檢測試驗，如用作對照細胞時在與探針或標志物結合后不會使細胞膜成為可通透的。另外，所說的凍干可以穩(wěn)定細胞膜的蛋白質結構及其在細胞壁內的定向性質，這樣便不會使膜表面蛋白標志受到破壞?？紤]到哺乳動物細胞的細胞膜的已知的脆弱特性，相信用本發(fā)明凍干方法所獲得的結果是出乎預料的，就凍干的哺乳動物細胞的穩(wěn)定性和儲存壽命來說也是令人意想不到的，而且在其重新水化之后所保留的生理學功能特性可與新鮮細胞相比擬。
在實施本發(fā)明的方法時，作為保藏或保護性被膜包裹，只能是在哺乳動物細胞的外表面上。包裹細胞膜的內表面則是不可能作到的。所能達到的極好穩(wěn)定性及長儲存壽命，使得本發(fā)明的方法有不能應用于制備進行免疫學檢測的對照細胞、在哺乳動物細胞的流式細胞計分析、血細胞計數(shù)、按大小分類及分析血細胞成分的亞群(如紅細胞和白細胞)，以及各種類型細胞的DNA分析中提供適用的樣品制劑。因此，各種類型的細胞均可凍干并在其后重新水化成為適于進行生物學細胞分析的樣品。
StefiWeisburd在“脫水并不造成死亡”(DeathDefyingDehydration)一文(ScienceNews，Vol.133，No.7，pp.97-112，F(xiàn)ebruary13，1988)中描述了使用國際專利申請(PCT)WO86/03938號中所述的海藻糖冷凍干燥脂質體的方法。該文獻所述的研究工作是用微生物進行的，其表明海藻糖(一種低分子量糖)是在這些微生物中當它們脫水后以高濃度產生的。一般認為海藻糖可起脂質穩(wěn)定劑的作用，用以增加人造細胞膜或脂質體的穩(wěn)定性。該文獻提請注意海藻糖并不是在所有情況下都是有用的添加物，并且應該注意海藻糖的毒理學。
必須有精確而可靠的對照物以便在檢測對照和樣品的同時能了解準備樣品的合適技術和實驗室檢測設備的功能，這種要求是持續(xù)的。在流式細胞計分析中，除用于構成流式細胞計工作參數(shù)的熒光素小珠或微球外，并沒有可利用的確定對照組。最適合需要的對照物質應是可作為所用試劑及適當儀器功能有關的樣品準備技術對照者。因此，在進行流式細胞計分析時，保存的表達必要抗原決定基或決定簇的哺乳動物細胞與試驗樣品的細胞一起檢測，將提供一種最適對照物?？蓪⑾惹皽y定的對照細胞的數(shù)值與研究人員測得的試驗結果相比較。
對所有有表面抗原的細胞進行流式細胞計分析的特點需要建立一種制備對照細胞的方法，以便維持細胞的光散射圖型和膜的完整性，使被研究的細胞表面抗原的損傷降至最小程度。最好應是使用具有待研究之已知性質的新鮮細胞的基礎上比較這些因素。然而，從商品供應角度看，在實驗室環(huán)境中運送和儲存新鮮對照細胞是不切實際的。
為此，使用凍干等方法保存的哺乳動物細胞可便于運送，能夠儲存足夠長的時間，并能在使用時重新恢復凍干前狀態(tài)或重新水化，同時保留其必要的特性，這樣即可為進行流式細胞計分析提供合乎需要的對照。
這種凍干的哺乳動物對照細胞也應適于使用血液學分析裝置，如Coulter Electronics公司(Hialeah，F(xiàn)lorida;為Coulter公司的子公司)出售的COULTER COUNTER
血細胞。
申請人確信由于幾方面的原因而一直沒有成功地凍干用作對照物的哺乳動物細胞。例如，冷凍條件會對這些細胞中的蛋白質分子產生有害影響，并可破壞所有膜的完整性。
它使用各種糖類結合DMSO或甘油進行了抵削細胞內冷凍之不利影響的實驗工作。另外還作了在凍干過程單獨使用糖的實驗，其中在對懸浮細胞進行冷凍和凍干時將糖加至凍干載體溶液，如標準的正常羊血清中。試驗了含有或不含DMSO、磷酸鹽緩沖的白蛋白(PBA)、胎牛血清，人AB型血清及正常羊血清的糖的各種濃度的溶液。
使用蔗糖、?；撬岷推咸烟?，以及DMSO與糖作為載體進行實驗，所得結果均不能令人滿意。例如當使用果糖時，相對于新鮮細胞之某些抗原的特異性熒光的減少，超過允許范圍的光散射及特異的熒光特性等情況都會出現(xiàn)。使用這些糖處理細胞仍不能得到令人滿意的凍干細胞，即不能制得冷凍期間免受明顯損傷的細胞。所說的損傷可表現(xiàn)于細胞膜蛋白分子水平的改變，如能影響抗原表達的構象改變。一般須使用低溫保護劑(cryoprotectorants)來防止細胞冷凍期間因增加了鹽濃度和結晶形成所造成的這類損傷。但申請人發(fā)現(xiàn)這些冷凍保護劑，如DMSO和甘油以及其它血清，均不能成功地用于凍干哺乳動物細胞。
冷凍和凍干期間，加入正常羊血清作為懸浮細胞的基質或載體并不能有效地保護細胞表面標志的活性，即血清中的蛋白質并不能使細胞膜免遭氧化作用或其它破壞。只使用海藻糖與正常羊血清及白蛋白的混合物也不能成功地解決上述問題。
此后，又使用海藻糖作為與正常羊血清和白蛋白之混合物的一部分，也未能制得適用的凍干對照細胞的介質。從而證明在凍干期間使用糖，包括海藻糖穩(wěn)定膜細胞的膜脂質是不成功的。
本發(fā)明的方法已被證明可成功地制得適用的凍干哺乳動物細胞，該方法包括在等滲溶液中利用海藻糖制備冷凍和凍干的細胞。用本發(fā)明方法制得的凍干的對照細胞包括雜交瘤細胞或細胞系以及保留了便于流式細胞計分析之最適特性的外周血單核細胞。還確定了等滲溶液中海藻糖(其為最適用于本發(fā)明之方法的糖)的最佳濃度。本發(fā)明包括凍干的哺乳動物細胞及其他能用上述凍干方法制備的人體細胞。
本發(fā)明的方法可用于制備在免疫學檢測、流式細胞計分析及顯微鏡檢驗中用作生物學對照的凍干的哺乳動物細胞，并用于保藏可保留其所需抗原性的人細胞系。凍干的細胞在使用時可重新恢復其含水狀態(tài)或重新水化，同時使其細胞膜蛋白構象或形態(tài)學不受損傷或有害影響。據(jù)信本發(fā)明的方法能夠凍干哺乳動物生理體液和組織中的所有細胞?？墒褂媚承藴实闹苽浞椒ǎ缬纱龣z測的全血、培養(yǎng)的細胞系或組織中收集欲進一步處理的所需數(shù)目的細胞，用于一般的檢測過程并經離心使之成為細胞團塊。首先，將該細胞團塊懸浮于磷酸鹽緩沖的白蛋白中達一定時間，然后再重新使之成為細胞團塊形式。凍干前，將細胞團塊懸浮于含特定最適濃度之海藻糖的等滲溶液中，并于室溫下保溫一定時間。室溫下用含一定比例海藻糖的等滲溶液重復處理該細胞懸液一定時間，然后將細胞懸液置于小瓶內，冷凍并凍干一定時間。
可用其量等于小瓶全容積的蒸餾水使如此制得的凍干細胞重新恢復其含水狀態(tài)，該小瓶是特制用于原位水化冷凍細胞的。重新恢復其含水狀態(tài)的細胞保留了它們用作分析對照的最適生理學特性。


圖1A和1B分別是用TII-FITC和MsIgGl-FITC標記染色的按本發(fā)明凍干之T細胞系及與之完全相同的新鮮細胞系的流式細胞計直方圖。
圖2A和2B分別是用B1-FITC和MsIgGZa-FITC標記染色的按本發(fā)明方法凍干的B細胞系及與之完全相同的新鮮B細胞系的流式細胞計直方圖。
圖3是以四個編號的方框顯示的復合流式細胞計直方圖，其中比較了用TII和B1單克隆體雙染色的新鮮外周血淋巴細胞及凍干的外周血淋巴細胞。
圖4是以四個編號的方框顯示的復合流式細胞計直方圖，其中比較了用T4和T8單克隆抗體雙染色的新鮮及凍干的外周血淋巴細胞。
圖5是圖解說明本發(fā)明制備凍干之對照細胞、細胞系及外周血淋巴細胞的方法。
使用某些術語來解釋
圖1至4中各直方圖所顯示的比較試驗的結果。本文使用的這些術語定義如下1.“本底熒光”是指由樣品中并非從被研究的特異性熒光標記細胞，而是從任何其它的材料發(fā)出的熒光。
2.“自身熒光”是本底熒光的一種，其中由細胞發(fā)出的熒光不是由熒光化學物質如染料誘導的。
3.“非特異性結合”是指熒光化學物質附著于細胞表面的現(xiàn)象不是借助特異結合方式產生的。
4.“光散射”是指入射光束如由激光光源發(fā)出的光束對著細胞照射的發(fā)生在流式細胞計儀器內的現(xiàn)象，此時有些光束向許多不同方向反射，有的光束則穿過細胞。對散射的光，包括及由復蓋于細胞外的熒光化學物質產生的熒光及其反射角度均可被測定，并用以確定細胞的特征，如細胞大小或體積，細胞表面光滑度，以及細胞漿質中的顆粒的數(shù)目和其他結構。這些特征可以與正常細胞的特征相比較。
5.“平均頻道(MeanChannel[MC])”是指對被分析的細胞發(fā)出的平均相對熒光量。
6.“百分陽性率”是指其熒光高于本底的被分析細胞的百分比。
用于完成本發(fā)明之凍干方法的成分如下A.磷酸鹽緩沖的白蛋白溶液(PBA)，為1gPBA溶于100ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)內。
B.海藻糖溶液，10g海藻糖溶于100ml等滲溶液。最好使用Coulter Electronics公司注冊商標為ISOTONⅢ的等滲溶液，其特點是絕對純。
C.“FITC”，即熒光素異硫氰酸鹽。
D.“RDI”，即Coulter公司使用的藻膽蛋白熒光素標記物。
下面參照圖5全面地描述實施本發(fā)明方法的方法學。首先由全血或培養(yǎng)的細胞系，或組織中收集作為待檢測細胞的哺乳動物細胞。對于一次一般的檢測工作，收集30×106個細胞并懸浮于4-8℃的1%PBS溶液中。室溫下將懸浮的細胞以1500rpm離心約10分鐘。棄去上清，將細胞團塊懸浮于在等滲液(如ISOTON
)中制得的10%海藻糖溶液中，并于室溫下保溫10分鐘，或最好于2-8℃保溫10分鐘。然后于4-8℃以1500rpm離心10分鐘。再將所得細胞沉淀團塊重新懸浮于用ISOTON
制備的10%海藻糖(如4-8℃)中。將海藻糖處理的細胞懸液置于每瓶含300μl溶液的凍干小瓶內，小瓶擰上蓋并于4℃冷卻，然后振蕩小瓶使細胞散布均勻，再于-70℃冷凍機中至少放置1小時。到時間后將小瓶立即放入凍干機內約凍干15小時。
到時間后由凍干機內取出凍干的小瓶并保存于2-8℃下。為了使凍干品重新恢復含水狀態(tài)，向小瓶內加入蒸餾水或去離子水，使其體積達到300μl。作為流式細胞光度計分析中的對照細胞，將重新懸浮的細胞染色，然后按標準的流式細胞計分析法分析。當然，這些對照細胞也可用于其他類型的檢測法或其他適當?shù)脑\斷試驗。
下面將參考附
圖1至4的流式細胞計直方圖對本發(fā)明的凍干方法作更詳細的討論，以從中了解按本發(fā)明方法制得的凍干細胞的實用有效性
圖1A和1B的流式細胞計直方圖中，對同種新鮮的和凍干的T細胞系(定名為PB 44細胞)進行染色并使用Coulter公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)出售的EPICS
流式細胞計進行比較。隔兩周分別制備兩份PB 44 T細胞并按本發(fā)明的方法凍干。使用去離子水使細胞重新恢復含水狀態(tài)或水化，并用Coulter公司出售、注冊商標為COULTER CLONE
的帶色的單克隆抗體MsIgGI-FITC和帶色的單克隆抗體TII-TITC著染細胞表面標記。所使用的免疫熒光細胞表面染色方法詳見Coulter公司分發(fā)的“Coulter Proceduces Book”一書第4頁。染色后，在EPICS
流式細胞計中分析這些重新恢復含水狀態(tài)的凍干細胞，以測定百分陽性率及各抗體之平均頻道熒光的相對量。在進行檢測分析的同一天制得新鮮培養(yǎng)的PB 44 T細胞，并用相似方法進行分析，以與分析染色的凍干細胞所得結果相比較。直方圖所示的結果如下PB44T細胞新鮮細胞凍干細胞MC%陽性率MC%陽性率TII-TITC849992100MsIgGI-TITC-0165對凍干T細胞的百分反應活性等于被分析的新鮮T細胞的百分反應活性。各例中平均細胞熒光也基上相等，84與92的少許差異并不足以影響檢測結果。由
圖1A和
圖1B的直方圖可以看出，用新鮮T細胞和凍干T細胞測得的結果十分相似。很顯然，本發(fā)明的凍干方法具有許多應歸功于本發(fā)明的優(yōu)點。
還使用一系列COULTER CLONE
單克隆抗體，在EPICS
流式細胞計上對PB44細胞系的新鮮和凍干T細胞進行了進一步的檢測。其中制備染色細胞的方法同前所述。進一步的檢測的結果如下PB44T細胞分析結果Coulter clone
新鮮 PB 44 凍干PB 44抗體實驗序號MC＊百分陽性率MC百分陽性率IgG1-FITC11001913(同型對照)2120165IgG1-RD113041(同型對照)26050TII-FITC1841008699210310010899
T8-FITC1869796982113100116100T4-FITC1407150842699367954B4-FITC1407951922751007099TII-RD119810077952120100105100T8-RD111109110998214110012699對于試驗各種抗體來說，對凍干PB44細胞的百分反應活性基本上等于新鮮細胞的百分反應活性。另外，用于度量染色細胞之相對熒光強度的平均頻道值在凍干和新鮮細胞也大致相似。用IgG1-FITC同型對照染色證明，在某些情況下凍干細胞確實顯現(xiàn)出較大程度的非特異性熒光。但這部分熒光因其強度不大，故不會影響對檢測結果的解釋。
圖2A和2B所示的流式細胞計直方圖中，使用B1-FITC染色并在EPICS 流式細胞計中比較了定名為PB 11的同種新鮮和凍干的B細胞系。按本發(fā)明的方法凍干相隔兩周分別制備的兩份PB 11B細胞。用去離子水使細胞重新水化，并用Coulter公司商標為“COULTER CLONE”的B1-FITC和B4-FITC細胞標記染色。染色方法與
圖1A和1B所述者相同。染色后在EPICS 儀器中分析水化的凍干細胞，以測定對各種抗體的百分陽性率及平均頻道熒光相對量。在進行上述檢測時也對同同一天由培養(yǎng)瓶中得到的新鮮PB 11 B細胞作了相似的檢測和分析。對B1-FITC和B4-FITC染色之新鮮和凍干細胞的檢測結果如下所示PB11B細胞新鮮細胞凍干細胞MC%陽性率MC%陽性率
B1-FITC8299118100B4-FITC92100699970997199凍干B細胞的百分反應活性和平均頻道熒光與新鮮細胞相當。在同型對照中，凍干細胞出現(xiàn)了較大程度的非特異性熒光，但這是由于該細胞系在不同時間出現(xiàn)的非特異性本底染色造成的。這一程度的非特異性熒光，因其強度很低，故不會影響分析結果。
圖3是以分別標明為1)、2)、3)和4)的四個方框顯示的復合流式細胞計直方圖，使用雙色TII和B1 COULTER CLONE
單克隆抗體對新鮮外周血淋巴細胞(PBLS)和凍干的外周血淋巴細胞進行比較。用Ficoll-Hypaque
標準方法分離細胞。按上述方法凍干細胞并染色，然后作細胞分析。所得結果是新鮮細胞凍干細胞MC%陽性率MC%陽性率B1-FITC70125919TII-RDI64775767就試驗的各抗體來說，外周血淋巴細胞凍干制品的百分反應活性與新鮮PBLS基本相同。兩者的平均頻道熒光也大致相當。
圖4是以四個編號的方框顯示的復合流式細胞計直方圖，其中使用雙染色的T4和T8 COULTER CLONE
單克隆抗體對新鮮和凍干的外周血淋巴細胞(PBLS)進行分析比較。所用的制備方法與上述者相同。分析的結果是新鮮細胞凍干細胞MC%陽性率MC%陽性率T4RD11024710558T8-FITC119319932對試驗的各單克隆抗體來說，凍干PBLS的百分陽性率基本上與新鮮PBLS相同。兩種形式PBLS的平均頻道熒光也大致相同，雖然凍干PBLS上用T8染色的單克隆抗體MC稍低，但這并不影響總體分析或比較試驗結果。
將凍干的哺乳動物細胞存放于2-8℃冰箱內進行保存壽命試驗。所獲結果表明，凍干產品的穩(wěn)定性可維持5個月以上。
在EPICS 流式細胞計中測定按本發(fā)明方法凍干的兩種穩(wěn)定化人T和B細胞制劑，與新鮮的人T和B細胞制備相比較，以證實其結構保護作用的程度。第一份混合物由80%T細胞和20%B細胞組成;第二份混合物由各50%的T和B細胞組成。用去離子水使凍干細胞恢復含水狀態(tài)并在流式細胞計上記錄它們的光散射圖形，即前方位角光散射(FALS)和90°光散射。同時使用EPICS 流式細胞計記錄了相應新鮮T和B細胞制劑的光散射試驗圖形。記錄的試驗結果表明凍干之細胞混合物的光散射圖形與相應的新鮮細胞混合物者相似，從而證實了凍干細胞的極好結構保護作用。
試驗還表明細胞的細胞表示抗原性沒有受到損害。使用了適當?shù)厝旧腃OULTER CLONE 單克隆抗體，包括T4、T8、TII、B1、B4、I2和4B4單克隆抗體。
對陽性染色的凍干細胞進行了一系列試驗，并且是，將其作為DNA分析的生物學對照在EPICS 流式細胞計中進行的。染色并試驗了新鮮和凍干的細胞，以分析新鮮和凍干的細胞制劑中細胞群體周期的進度。
在不同的日期并由不同供體(即PBL供體)和定名為PB11和PB44的不同培養(yǎng)物中得到新鮮和凍干的細胞。這些試驗記錄的結果證實凍干的細胞適于用作細胞周期分析的對照細胞。新鮮和凍干細胞在細胞周期分析中出現(xiàn)的某些差異可能是因為收集被試細胞的時間不同而導致的。
由上述對按本發(fā)明方法凍干的細胞及相應新鮮細胞所作比較分析，可以得出下列結論1.這些凍干的細胞可在流式細胞計分析法的質量控制中，用于體外診斷分析。
2.在用流式細胞計進行細胞表面標志分析時，這些凍干的細胞在功能上可作為陽性染色的生物學對照。從而可用于判定試劑的可靠性、樣品制備技術，以及流式細胞計的正常功能。它們可作為細胞對照物，用于鑒定抗細胞活化抗原和白血病抗原的單克隆抗體。在對細胞表面抗原密度進行定量分析時，可用作標準對照。
3.進行DNA分析時，這些凍干的細胞可起陽性染色的生物學對照物的作用，以估價試劑可靠性、樣品制備技術，以及流式細胞計的正常功能。另外還可在細胞群體的細胞周期分析中用作標準品。
據(jù)信，由于這些凍干的細胞保留了形態(tài)學和細胞表面抗原的完整性，故也可作為對照細胞被用于其他類型的分析檢測，如用于ELISA和顯微鏡檢驗中。用本發(fā)明的凍干方法制備的細胞可用于免疫檢測所有的正常或異常哺乳動物細胞(如腫瘤細胞)。只要能夠得到檢測介質，如單克隆抗體，是能夠完成檢測目的。本發(fā)明的凍干方法也可產生適于血液學顆粒分析儀使用的凍干的對照細胞。也可用本發(fā)明方法保存組織細胞。
與目前普遍使用的熒光小珠或微球相比，在流式細胞計中使用凍干的對照細胞可具有多種優(yōu)點。熒光微球不適于作為對照用于樣品制備，不能用于將流式或細胞計調試合適以進行細胞光散射分析，而且它們的熒光是細胞內的而不是細胞表面的。此外，用流式細胞計分析時，凍干的細胞在結構上更相似于新鮮細胞。
還應提到的是，用本發(fā)明方法凍干的儲存細胞不需要絕對的儲藏條件，重新水化時也不需復雜的操作程序，這與使用冷凍保護劑并在液氮溫度下儲存以保藏正常外周血細胞(PBL)時所遇到的情況完全不同。
值得注意的是，在不背離待批權利要求中所限定的本發(fā)明基本內容的前題下，本領域內熟練技術人員在實施本發(fā)明的方法時，可以對若干技術細節(jié)如試劑量或保溫時間等作某些小的改動。
權利要求
1.能夠在水中重新水化的凍干的哺乳動物細胞，用流式細胞計光散射分析法可證實其保留了與相應新鮮細胞相似的結構完整性及細胞表面抗原性，而且作為凍干細胞在其于2至8攝氏度儲存幾個月后仍顯示其長時間的穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其進一步的特征在于能夠被陽性染色而用作流式細胞計方法學的生物學對照。
3.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其進一步的特征在于能夠被陽性染色，在流式細胞計方法學中用作DNA分析的生物學對照。
4.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其進一步的特征在于能夠用作細胞群體之細胞周期分析的標準對照。
5.根據(jù)權利要求1、2和3的凍干細胞，其中所說的細胞可得自人外周血細胞或培養(yǎng)的細胞。
6.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其中所說的細胞可得自其生理狀態(tài)為正?；虍惓５娜私M織細胞。
7.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其能夠被染色，因而能在免疫分析法中用作生物學對照細胞。
8.于冰凍溫度下儲存5個月或更長時間后能夠在蒸餾水中恢復其含水狀態(tài)的凍干的人細胞和培養(yǎng)細胞，其進一步的特征在于保留了它們原來的膜結構及細胞表面抗原性，適于繼后在流式細胞計分析中用作陽性染色的生物學對照。
9.根據(jù)權利要求1的凍干細胞，其中所說的細胞攜帶溶于等滲液中之海藻糖的保護性衣殼，該溶液是在其凍干前加入的。
10.根據(jù)權利要求8或9的凍干細胞，其進一步的特征在于適于作為DNA分析的生物學對照。
11.根據(jù)權利要求8或9的凍干細胞，其進一步的特征在于能夠用作T和B細胞群體之細胞周期分析的標準對照。
12.一種制備凍干的哺乳動物細胞的方法，該凍干細胞在重新恢復其含水狀態(tài)后仍保留細胞膜結構完整性及細胞表面抗原性，所說的方法包括下列步驟A.收集預定數(shù)目懸浮于選定體積之磷酸鹽緩沖的白蛋白中的樣品細胞;B.離心細胞懸液得到細胞沉淀團塊;C.于室溫下，在含海藻糖的等滲溶液中將細胞懸液保溫一定時間，得到細胞懸液;D.將細胞懸液加入容器內，冷卻到預定的低溫并于約-70℃下冷凍約1小時;E.將容器移入凍干裝置，凍干預定的時間;然后，F(xiàn).將含有凍干細胞的容器儲存于2-8攝氏度的冷凍溫度下，以備繼后于原位在蒸餾水中恢復原含水狀態(tài)。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中得自步驟B的細胞懸液是首先按步驟B處理以產生細胞沉淀團塊，并再次按步驟C的方法處理細胞團塊，然后按步驟D處理所得到的細胞懸液。
14.根據(jù)權利要求12或13的方法，其中保溫是在溶于等滲液的10%海藻糖中進行的。
15.根據(jù)權利要求12或13的方法，其中細胞沉淀團塊于4℃下在磷酸鹽緩沖的白蛋白中懸浮1小時。
16.根據(jù)權利要求14的方法，其中細胞沉淀團塊于室溫下在10%海藻糖等滲溶液中保溫約30分鐘。
17.根據(jù)權利要求12或13的方法，其中凍干周期約為15小時。
18.一種哺乳動物生理細胞的檢驗方法，其中為實現(xiàn)檢驗試劑和檢驗儀器的標準化而使用了對照介質，其改進包括用能夠在水中重新恢復含水狀態(tài)的凍干細胞作為生物學對照細胞，特征在于其保留了與相應的正常新鮮哺乳動物細胞相似的細胞膜結構完整性和細胞表面抗原性。
19.根據(jù)權利要求18的檢驗方法，其中所說的哺乳動物細胞選自于外周血細胞、培養(yǎng)的細胞、雜交瘤細胞系或組織細胞。
20.根據(jù)權利要求18所述的檢驗方法，其中檢驗方法是檢驗外周血細胞的分離的細胞群體。
21.于2至8攝氏度的低溫度下儲存幾個月后能夠在蒸餾水中重新恢復其含水狀態(tài)的凍干的哺乳動物細胞，其特征在于保留了基本上與新鮮細胞相同的生理學參數(shù)。
22.根據(jù)權利要求21的凍干細胞，其進一步的特征在于功能上適于用作進行哺乳動物細胞分析的對照。
全文摘要
一種凍干哺乳動物細胞，以產生保藏的人細胞、雜交瘤細胞、組織細胞及免疫檢測和其它血液學檢驗所需之對照細胞的方法。在冷凍和凍干之前，將已制備的哺乳動物細胞沉淀團塊懸浮于以特定最適濃度制成的海藻糖等滲溶液內，并于室溫下保溫一定時間。當重新水化后，凍干的細胞保留了其適于用作分析對照的最佳生理學特性，并可在于2-8℃下儲存超過5個月之后仍然保留上述特性。
文檔編號A01N1/02GK1041974SQ8910798
公開日1990年5月9日 申請日期1989年10月20日 優(yōu)先權日1988年10月20日
發(fā)明者羅伯特·H·雷納, 史蒂文·F·小希利, 肯尼思·H·科特萊特 申請人:庫爾特公司