本申請(qǐng)涉及三七種質(zhì)保存，尤其涉及一種三七種質(zhì)資源的保存方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三七（panax?notoginseng?(burk.)?f.?h.?chen）是五加科人參屬多年生草本植物，主要分布在中國(guó)西南地區(qū)，具有較高經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。三七作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，其在治療心血管病有獨(dú)特效果且療效顯著，又被列入藥食同源目錄，使其需求急劇增加。但是，三七主要以栽培種形式繁殖，連作障礙嚴(yán)重，道地產(chǎn)區(qū)偏移縮小，病蟲害問(wèn)題逐漸突顯，其種質(zhì)資源面臨丟失和退化風(fēng)險(xiǎn)，其種質(zhì)資源需要長(zhǎng)期安全有效的保存方式。三七產(chǎn)生的種子是典型的頑拗性種子，有明顯后熟性，屬于形態(tài)生理休眠類型，對(duì)脫水敏感，因而常規(guī)的保存方式難以長(zhǎng)期保存。

2、目前關(guān)于三七種質(zhì)資源的保存，現(xiàn)有文獻(xiàn)中公開了一種保存方法，該文獻(xiàn)具體為商麗煌.?人參、西洋參、三七超低溫保存研究［d］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.并公開了如下內(nèi)容：三七愈傷組織最佳超低溫保存過(guò)程為：將快速生長(zhǎng)期的三七胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入凍存管后，加入冷凍保護(hù)劑pvs3?溶液（ms+40%甘油+40%蔗糖），室溫下處理30min?后更換新鮮冷凍保護(hù)劑，置于程序降溫儀，放入-80℃冰箱12h?后，投入液氮，保持48h。取出，40℃水浴解凍，洗滌?；謴?fù)培養(yǎng)30d?后統(tǒng)計(jì)存活率為80%。該方法雖然實(shí)現(xiàn)了一定程度上對(duì)于三七種質(zhì)資源的保存，但是其并未進(jìn)行進(jìn)一步再生植株的研究，因而達(dá)不到真正有效的保存三七種質(zhì)資源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決或部分解決相關(guān)技術(shù)中存在的問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N三七種質(zhì)資源的保存方法，通過(guò)篩選收集得到尺寸為0.45-1.5?mm的三七胚性細(xì)胞團(tuán)，作為超低溫保存的外植體，然后經(jīng)過(guò)常規(guī)的裝載處理、玻璃化處理、液氮中保存以及相應(yīng)恢復(fù)培養(yǎng)以后，顯示保存后成活率達(dá)90%，超低溫保存后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)可以快速的分化成三七植株，分化出的三七植株，能在自然條件下移植成活，且移植成活率達(dá)90%，后期生長(zhǎng)良好。從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的三七種質(zhì)資源保存。

2、本申請(qǐng)中的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，包括以下步驟：

3、（1）在超凈工作臺(tái)內(nèi)，挑選在25℃黑暗條件下，增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周的三七胚性愈傷組織，其繼代周期為3周。將挑選的三七胚性愈傷組織在150ml?的三角瓶中與wpm培養(yǎng)基混懸，然后分別通過(guò)1.5mm和0.45mm篩網(wǎng)，篩選收集得到尺寸為0.45-1.5?mm的三七胚性細(xì)胞團(tuán)，作為超低溫保存的外植體。

4、所述增殖培養(yǎng)基的配方為：wpm培養(yǎng)基，2,4-d?2mg/l、聚乙烯吡咯烷酮1g/l、水解酪蛋白1g/l、蔗糖30g/l，1g/l活性炭和植物凝膠3g/l，增殖培養(yǎng)基?ph值為5.8；

5、（2）將步驟（1）中篩選得到的尺寸為0.45-1.5?mm三七胚性細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行玻璃化超低溫保存。

6、具體地：

7、（a）將挑選出尺寸為0.45-1.5?mm的三七胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入2ml?凍存管中，加入2ml裝載溶液室溫進(jìn)行裝載處理20分鐘，得裝載過(guò)的胚性細(xì)胞團(tuán)；所述裝載溶液為：wpm培養(yǎng)基、甘油184g/l和蔗糖0.4mol/l；

8、（b）將所裝載過(guò)的胚性細(xì)胞團(tuán)，在凍存管中與2ml?冰上預(yù)處理的pvs2玻璃化溶液混合在冰上進(jìn)行玻璃化處理，處理時(shí)間為30分鐘，得到玻璃化的三七胚性細(xì)胞團(tuán)；所述玻璃化溶液的配方為：wpm培養(yǎng)基、甘油300g/l、乙二醇150g/l、二甲基亞砜150g/l和蔗糖0.4mol/l；

9、（c）將裝有玻璃化的三七胚性細(xì)胞團(tuán)的凍存管置于液氮中保存24小時(shí)以上；

10、保存后，對(duì)三七胚性細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。具體地：

11、（a）將液氮凍存裝有三七胚性細(xì)胞團(tuán)的凍存管在40℃水浴解凍2分鐘；

12、（b）超凈工作臺(tái)內(nèi)將解凍后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)與卸載溶液混合后，進(jìn)行室溫卸載處理20分鐘，得卸載后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)；

13、所述卸載溶液的配方為：wpm培養(yǎng)基，蔗糖410.4g/l，卸載溶液的ph值為5.8；

14、（c）卸載后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)，用wpm液體培養(yǎng)基清洗2次，并轉(zhuǎn)至濾紙上得清洗后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)。

15、（d）所述清洗后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)連濾紙轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)4周。

16、每?jī)芍芾^代一次，培養(yǎng)條件為25℃黑暗條件下培養(yǎng)；

17、本實(shí)施例中還提供了基于上述保存方法再生三七植株的方法。具體為：

18、（a）將恢復(fù)培養(yǎng)的三七胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次，得重新建立的三七胚性愈傷組織；

19、（b）將重新建立的三七胚性愈傷組織，以薄層的形式均勻涂于分化培養(yǎng)基上，得分化的三七體細(xì)胞胚；

20、分化培養(yǎng)基的配方為：wpm培養(yǎng)基，蔗糖30g/l，植物凝膠3g/l，活性炭1g/l，分化培養(yǎng)基的ph值為5.8；

21、（c）將分化的三七體細(xì)胞胚獨(dú)立挑出在wpm培養(yǎng)基+蔗糖30g/l?+植物凝膠?3g/l上培養(yǎng)得成熟三七體細(xì)胞胚；

22、（d）將成熟三七體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)到組培瓶中培養(yǎng)，得三七再生組培苗；

23、（e）將三七再生組培苗在溫室移植馴化后，即得三七再生植株。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本申請(qǐng)的有益效果是：

25、1、三七胚性愈傷組織可以通過(guò)玻璃化法超低溫保存技術(shù)促進(jìn)其種質(zhì)資源的長(zhǎng)期安全有效的保存，且保存后成活率達(dá)90%。相比較現(xiàn)有技術(shù)中的保存方法，本方法超低溫保存后再生的胚性細(xì)胞團(tuán)恢復(fù)能力強(qiáng)（圖3），恢復(fù)周期短（圖3），可以實(shí)現(xiàn)短期大量增殖。

26、2、超低溫保存后的三七胚性細(xì)胞團(tuán)可以快速的分化成三七植株，分化出的三七植株，能在自然條件下移植成活，且移植成活率達(dá)90%，后期生長(zhǎng)良好。從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的三七種質(zhì)資源保存。

技術(shù)特征：

1.一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，

3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，所述步驟（2）中裝載處理時(shí)，裝載液體積為2ml，三七胚性細(xì)胞團(tuán)團(tuán)數(shù)為10-40團(tuán)，裝載處理的溫度為20-25?℃，裝載處理的時(shí)間為20-40min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，所述步驟（3）中玻璃化處理的溫度為0℃，玻璃化處理的時(shí)間為5-40min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，所述液氮中保存的時(shí)間至少為24h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法，其特征在于，所述步驟（4）中的恢復(fù)培養(yǎng)具體操作為：

7.根據(jù)權(quán)利要求1或6中所述的一種三七種質(zhì)資源的保存方法在三七植株再生中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)是關(guān)于一種三七種質(zhì)資源的保存方法及其應(yīng)用，涉及三七種質(zhì)保存技術(shù)領(lǐng)域。該保存方法，包括以下步驟：（1）將三七胚性愈傷組織與WPM培養(yǎng)基混懸，篩選收集得到尺寸為0.45?1.5?mm的三七胚性細(xì)胞團(tuán)；（2）將三七胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入凍存管中，加入裝載溶液進(jìn)行裝載處理，得裝載過(guò)的胚性細(xì)胞團(tuán)；（3）將裝載過(guò)的三七胚性細(xì)胞團(tuán)，在凍存管中與玻璃化溶液進(jìn)行玻璃化處理，得到玻璃化的三七胚性細(xì)胞團(tuán)；（4）將裝有玻璃化的三七胚性細(xì)胞團(tuán)的凍存管置于液氮中保存；保存后，對(duì)三七胚性細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。該方法保存后成活率達(dá)90%，且可以快速的分化成三七植株，分化出的三七植株，在自然條件下移植成活，移植成活率達(dá)90%，后期生長(zhǎng)良好。

技術(shù)研發(fā)人員：林亮,馬俊超,徐倩,張利紅,楊湘云,陳虹穎,胡梟劍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26