本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法。

背景技術(shù)：

1、廣義的繡球花是繡球花科繡球?qū)?hydrangea?l.)植物的統(tǒng)稱，狹義的繡球花則指繡球?qū)僦性耘鄳?yīng)用最多的種，俗稱大花繡球或大葉繡球。狹義的繡球花[hydrangeamacrophylla(thunb)ser.]又名八仙花、紫陽(yáng)花等，在園林造景、家庭園藝、鮮切花和干花等領(lǐng)域均有著廣泛用途；此外，繡球花耐酸、耐鋁性強(qiáng)，在生態(tài)、藥用等方面也有重要作用，發(fā)展前景廣闊。目前，關(guān)于繡球花的研究集中在栽培技術(shù)、生理生化、分子機(jī)制、花色調(diào)控等方面。由于自然條件下繡球花結(jié)實(shí)性能差且種子萌發(fā)率極低，故生產(chǎn)上主要以扦插、壓條、分株等繁殖方式進(jìn)行育苗；但是此類方法受季節(jié)的限制性較高，同時(shí)繁殖系數(shù)較低，難以滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求。因此，通過組織培養(yǎng)的技術(shù)手段快速繁殖繡球花種苗，是目前獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)種苗的最高效的方法之一。同時(shí)，隨著基因工程技術(shù)的深入研究，利用組培基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)進(jìn)行植物性狀改良已成為非常有效的育種手段。

2、‘筑紫之風(fēng)’是從日本引進(jìn)的一個(gè)平頂、重瓣型大葉繡球品種，其株型矮小，株高一般只有40cm左右，盆栽觀賞效果較好；直立性和分枝性優(yōu)秀，無須人工修剪，就能自然成形，呈現(xiàn)枝多葉密的形態(tài)；老枝開花，聚傘狀花序，酸堿度敏感，可調(diào)色成粉、藍(lán)、紫色等?！现L(fēng)’也是典型的晚花型品種，花期較長(zhǎng)，每年春季末始花，能夠一直綻放到秋季，其中夏季是它的盛花期，也是家庭園藝、陽(yáng)臺(tái)造景方面深受歡迎的一個(gè)新品種。因此，亟待采取有效的方法對(duì)繡球花‘筑紫之風(fēng)’進(jìn)行快速繁殖，以滿足種質(zhì)保存、種苗規(guī)?；a(chǎn)和遺傳改良等方面的需要。

3、目前，已有不同的品種和外植體及實(shí)驗(yàn)方法被應(yīng)用于大葉繡球再生體系的研究，現(xiàn)有技術(shù)中公開了利用組培苗葉片快速繁育大花繡球無盡夏的方法，其提供的大花繡球無盡夏組培快繁方法，可以使大花繡球無盡夏育苗期的愈傷誘導(dǎo)率和生根率顯著提高。但是，該方法該誘導(dǎo)過程中黑暗培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20d,極大地延長(zhǎng)了育苗周期；并且該方法中誘導(dǎo)愈傷最佳培養(yǎng)基的分化不定芽效率很低，需要更換不同激素配比的培養(yǎng)基以促進(jìn)不定芽的再生，不僅加大了快繁技術(shù)的難度、降低了育苗效率，還容易發(fā)生污染，降低成活率的同時(shí)增加了生產(chǎn)成本。因此，需要提供一種提高誘導(dǎo)不定芽的效率、縮短育苗周期，操作方法更加簡(jiǎn)單、成本更低、成活率更高的誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些不足，本發(fā)明提供了一種繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法；所述方法包括：步驟1：以‘筑紫之風(fēng)’組培苗無菌葉片為外植體，將所述的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中經(jīng)黑暗培養(yǎng)后誘導(dǎo)出愈傷組織，并分化形成不定芽；步驟2：將形成的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到叢生芽；步驟3：將獲得的從生芽轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生長(zhǎng)，形成幼苗；步驟4：將幼苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出根系得到完整小植株；本發(fā)明通過調(diào)控愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基，使得誘導(dǎo)不定芽的效率提高，縮短育苗周期，操作方法更加簡(jiǎn)單、成本更低、成活率更高，具有很好的實(shí)用性。

2、為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明首先提供了一種愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲(cppu)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)。

4、優(yōu)選地，所述cppu的終濃度為2.5-4.0mg/l，所述2,4-d的終濃度為0.05-0.15mg/l。

5、本發(fā)明提供了一種繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，所述方法包括：

6、步驟1：以繡球花組培苗無菌葉片為外植體，將其在上述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中經(jīng)黑暗+正常光照培養(yǎng)后誘導(dǎo)出愈傷組織，并分化形成不定芽；

7、步驟2：將獲得的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，形成從生芽；

8、步驟3：將獲得的從生芽轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生長(zhǎng)，形成幼苗；

9、步驟4：將獲得的幼苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出根系得到完整小植株。

10、優(yōu)選地，步驟1中，繡球花組培苗的獲得方法包括：剪取繡球花盆栽苗的當(dāng)年生健壯帶芽莖段，通過消毒滅菌、離體萌發(fā)后獲得無菌的繡球花組培苗。

11、優(yōu)選地，所述繡球花包括筑紫之風(fēng)。

12、優(yōu)選地，步驟1中，所述黑暗+正常光照培養(yǎng)的條件為：在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7～14天，然后轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)出愈傷組織。

13、優(yōu)選地，所述黑暗環(huán)境下的培養(yǎng)溫度為25±2℃；正常光照培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為1800-2000lux，光照時(shí)間為14h/d。

14、優(yōu)選地，步驟2中，所述增殖培養(yǎng)基包括：ms+1.0-3.0mg/l?6-ba+0.01-0.05mg/liba+0.01-0.05mg/l?2,4-d。

15、優(yōu)選地，步驟3中，所述壯苗培養(yǎng)基包括：ms+0.5-1.5mg/l?6-ba+0.1?-0.2mg/l?2,4-d。

16、優(yōu)選地，步驟4中，所述生根培養(yǎng)基包括：ms+0.1-0.5mg/l?iba+0.1-0.2mg/l?2,4-d。

17、優(yōu)選地，步驟2～4中，在增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為1800-2000lux，光照時(shí)間為14h/d。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

19、本發(fā)明以大葉繡球‘筑紫之風(fēng)’組培苗無菌葉片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生并能促進(jìn)不定芽再生，保持不斷增殖和成苗的特性，可以為規(guī)?；a(chǎn)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，同時(shí)也可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大葉繡球穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)提供支撐，為繡球花新優(yōu)品種培育奠定基礎(chǔ)。

20、本發(fā)明采用‘筑紫之風(fēng)’組培苗無菌葉片為材料，取材方便，同時(shí)避免了組織培養(yǎng)過程中外植體需要消毒、培養(yǎng)過程污染率高等問題。育苗周期短、生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單、繁殖系數(shù)高，便于工廠化種苗的繁育。

21、現(xiàn)有技術(shù)中，繡球花組織培養(yǎng)技術(shù)是以扦插得到的帶芽莖段為外植體材料，n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲誘導(dǎo)愈傷后轉(zhuǎn)接到含有6-芐基氨基嘌呤bap的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，不定芽誘導(dǎo)率為74.3％，平均不定芽個(gè)數(shù)為5個(gè)；其誘導(dǎo)愈傷的周期為20d黑暗培養(yǎng)和40天光照培養(yǎng)，增殖系數(shù)為3-5。而本發(fā)明選用n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲從繡球花無菌苗葉片中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷并再生出不定芽，再生率可達(dá)93.3％，平均不定芽個(gè)數(shù)可達(dá)6.9個(gè)；愈傷誘導(dǎo)并再生不定芽的周期僅為40d(包括10d黑暗培養(yǎng))，實(shí)現(xiàn)不定芽的高頻率誘導(dǎo)；含6-芐基氨基嘌呤bap的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，增殖系數(shù)可達(dá)8.7；極大的縮短了育苗周期，減少污染，達(dá)到實(shí)用化程度，為開展繡球花試管苗工廠化生產(chǎn)提供新技術(shù)。

技術(shù)特征：

1.一種愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括：ms培養(yǎng)基、n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲cppu和2,4-二氯苯氧乙酸2,4-d。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述cppu的終濃度為2.5-4.0mg/l，所述2,4-d的終濃度為0.05-0.15mg/l。

3.一種繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，步驟1中，繡球花組培苗的獲得方法包括：剪取繡球花盆栽苗的當(dāng)年生健壯帶芽莖段，通過消毒滅菌、離體萌發(fā)后獲得無菌的繡球花組培苗。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，所述繡球花包括筑紫之風(fēng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，步驟1中，所述黑暗+正常光照培養(yǎng)的條件為：在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7～14天，然后轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)出愈傷組織。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，所述黑暗環(huán)境下的培養(yǎng)溫度為25±2℃；正常光照培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為1800-2000lux，光照時(shí)間為14h/d。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，步驟2中，所述增殖培養(yǎng)基包括：ms+1.0-3.0mg/l?6-ba+0.01-0.05mg/l?iba+0.01-0.05mg/l?2,4-d。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，步驟3中，所述壯苗培養(yǎng)基包括：ms+0.5-1.5mg/l?6-ba+0.1-0.2mg/l?2,4-d；

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，其特征在于，步驟2～4中，在增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為1800-2000lux，光照時(shí)間為14h/d。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種繡球花組培苗葉片高頻率誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域；所述方法包括：步驟1：以‘筑紫之風(fēng)’組培苗無菌葉片為外植體，將所述的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中經(jīng)黑暗培養(yǎng)后誘導(dǎo)出愈傷組織，并分化形成不定芽；步驟2：將形成的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到叢生芽；步驟3：將獲得的從生芽轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生長(zhǎng)，形成幼苗；步驟4：將幼苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出根系得到完整小植株；本發(fā)明通過調(diào)控愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基，使得誘導(dǎo)不定芽的效率提高，縮短育苗周期，操作方法更加簡(jiǎn)單、成本更低、成活率更高，具有很好的實(shí)用性。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧衍明,金玉妍,齊香玉,陳雙雙,馮景,陳慧杰,劉欣童
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26