本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種以胚珠為外植體的仙客來(lái)組培繁殖方法。

背景技術(shù)：

1、仙客來(lái)（cyclamen?persicum）為報(bào)春花科仙客來(lái)屬球根花卉，原產(chǎn)地在歐洲南部希臘等地中海地區(qū)。因其花形奇特、品種繁多、花期長(zhǎng)且冬季盛開(kāi)等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成為國(guó)內(nèi)外商品盆花中最重要的種類(lèi)之一。商品仙客來(lái)大多是雜種f1一代，用種子繼續(xù)繁殖會(huì)出現(xiàn)性狀分離，難以保存?f1代的原有性狀和雜種優(yōu)勢(shì)。目前，我國(guó)仙客來(lái)的栽培技術(shù)水平已接近國(guó)外水平，但是還沒(méi)有成熟和完善的育種技術(shù)體系，仍然需要花費(fèi)巨額資金購(gòu)買(mǎi)國(guó)外的f1代種子，成為我國(guó)仙客來(lái)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約瓶頸。

2、隨著國(guó)內(nèi)仙客來(lái)育種研究的不斷深入，出現(xiàn)了一些非常優(yōu)良的新種質(zhì)單株，然而，新的優(yōu)良種質(zhì)經(jīng)過(guò)種子繁殖后性狀容易出現(xiàn)分離，優(yōu)良性狀無(wú)法保存下來(lái)，加之多數(shù)具有特異花形的新種質(zhì)雄蕊或雌蕊敗育，只能無(wú)性繁殖。而仙客來(lái)無(wú)法用扦插、嫁接、分根等常規(guī)方法無(wú)性繁殖，因此，組織培養(yǎng)成為仙客來(lái)無(wú)性繁殖的唯一途徑。

3、國(guó)外在仙客來(lái)組培方面最成功的是日本，日本自上世紀(jì)80年代就開(kāi)始進(jìn)行仙客來(lái)組培繁殖技術(shù)研究，目前仙客來(lái)組培快繁技術(shù)已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，但其繁殖技術(shù)屬商業(yè)機(jī)密從未公開(kāi)。德國(guó)、美國(guó)、比利時(shí)等國(guó)也先后有關(guān)于仙客來(lái)野生種與雜交種組織培養(yǎng)的研究報(bào)道，但組培技術(shù)均是作為科研手段，未進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用。

4、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者在仙客來(lái)組培接種材料、培養(yǎng)基篩選、愈傷組織誘導(dǎo)、器官再生誘導(dǎo)、體胚誘導(dǎo)等方面均進(jìn)行了大量研究。然而，已有的仙客來(lái)組培技術(shù)多采用葉片、塊莖做外植體，如中國(guó)專(zhuān)利cn101112179a公開(kāi)了一種仙客來(lái)組織培養(yǎng)快速繁殖方法，其是以葉片為外植體進(jìn)行仙客來(lái)器官再生組培繁殖的途徑；中國(guó)專(zhuān)利cn103238526a公開(kāi)了一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖仙客來(lái)的方法，該技術(shù)是以仙客來(lái)球莖為外植體進(jìn)行組培繁殖的整套技術(shù)；中國(guó)專(zhuān)利cn104982331a公開(kāi)了一種仙客來(lái)組培快繁方法，該技術(shù)是以花莖為外植體進(jìn)行仙客來(lái)組培繁殖的方法。

5、對(duì)于新優(yōu)單株來(lái)說(shuō)，葉片、塊莖等外植體不但取材數(shù)量有限，而且存在由于材料消毒困難，導(dǎo)致接種成活率較低，器官再生過(guò)程中存在芽分化率低、成苗率低等問(wèn)題，成為制約仙客來(lái)新優(yōu)單株組培無(wú)性系成功的重要因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中，仙客來(lái)組培存在的接種材料少、污染率高、分化增殖困難，出苗成活率低等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種以胚珠為外植體的仙客來(lái)組培繁殖方法。該方法以未受精的胚珠為外植體，具有對(duì)植株無(wú)傷害、易于消毒、數(shù)量多、取材方便的優(yōu)點(diǎn)，依次經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)和優(yōu)選、芽誘導(dǎo)及分化增殖、壯苗培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)、煉苗移栽等環(huán)節(jié)，最終建立一種易于接種成功、成苗率高且株型好、葉片數(shù)較多的組培技術(shù)新體系，有利于加速仙客來(lái)無(wú)性繁殖進(jìn)程，促進(jìn)國(guó)內(nèi)仙客來(lái)育種及產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種以胚珠為外植體的仙客來(lái)組培繁殖方法，包括如下步驟：

4、步驟1：胚珠接種

5、步驟1-1：取欲繁殖的仙客來(lái)優(yōu)良單株未開(kāi)放或半開(kāi)放（未受精）的花蕾，摘除花瓣留下子房；用流動(dòng)的自來(lái)水將子房沖洗2小時(shí)以上，在超凈工作臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行清洗消毒后置于解剖鏡下，用解剖刀將胚珠剝離胎座；

6、步驟1-2：用解剖刀或鑷子沾取胚珠，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，密封；

7、所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2ms培養(yǎng)基+2,4d?2.0mg/l+2-異戊烯腺嘌呤（2ip）0.8mg/l+水解酪蛋白500mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l，ph值為5.8-6.0；

8、步驟2：愈傷組織誘導(dǎo)及篩選

9、將接有胚珠的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于22-25℃完全黑暗的環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)3-5個(gè)月誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織；其中，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，每4周篩選致密、乳黃色或乳白色愈傷組織轉(zhuǎn)接種一次；

10、步驟3：芽誘導(dǎo)及增殖

11、步驟3-1：待連續(xù)黑暗培養(yǎng)愈傷組織3-5個(gè)月后，篩選致密、乳黃色或乳白色的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到不定芽；

12、步驟3-2：在不定芽增殖初期，篩選致密、出不定芽球多的愈傷組織作為增殖器官轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)；

13、步驟3-3：在不定芽增殖過(guò)程中，篩選至少含有3個(gè)芽點(diǎn)的芽叢進(jìn)行繼代培養(yǎng)；所述芽叢基部根據(jù)增殖培養(yǎng)基空間留有愈傷組織；

14、步驟3-4：根據(jù)芽叢以及芽叢基部留有的愈傷組織的發(fā)育情況，不斷重復(fù)步驟3-2和3-3，獲得更多基部帶有愈傷組織的芽叢；

15、所述分化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的配方相同，為：1/2ms培養(yǎng)基+6-芐基嘌呤?(6-ba)0.5～2.0mg/l+萘乙酸(naa)?0.05～0.2mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l；

16、步驟4：壯苗培養(yǎng)

17、對(duì)步驟3分化增殖得到的芽叢進(jìn)行修剪，使芽叢保留6個(gè)以上均勻分布的葉柄，并且基部留有愈傷組織，之后將芽叢轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行1~2代的壯苗培養(yǎng)，得到無(wú)根試管苗；

18、所述壯苗培養(yǎng)基配方：1/2ms培養(yǎng)基+6-芐基嘌呤?(6-ba)?0.05~0.2mg/l+萘乙酸(naa)?0.01mg/l+水解酪蛋白100mg/l+糖30g/l+瓊脂6g/l；

19、步驟5：生根誘導(dǎo)

20、壯苗培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)健壯的無(wú)根試管苗進(jìn)行修剪，使芽叢上的芽點(diǎn)分布均勻，芽叢基部留有愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-45天，得到生根瓶苗；

21、步驟6：煉苗移栽

22、步驟6-1：將已生根的瓶苗，置于強(qiáng)自然光下煉苗5-7天之后進(jìn)行移栽；同時(shí)，于移栽前2-3天，將裝有已生根瓶苗的瓶蓋旋松并露出縫隙，使瓶苗透氣進(jìn)行煉苗；

23、步驟6-2：瓶?jī)?nèi)煉苗完成后，取出已生根的瓶苗，將其基部培養(yǎng)基洗凈，并移栽至鋪有移栽基質(zhì)的穴盤(pán)或泡沫培養(yǎng)箱中；移栽初期15天內(nèi)，用塑料薄膜覆蓋保持濕度85%以上，并控制光照強(qiáng)度小于6000lux，之后逐漸撤去塑料薄膜直至置于自然條件下；

24、步驟6-3：待苗木鋪滿穴盤(pán)或長(zhǎng)滿泡沫箱后，將其移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，進(jìn)行常規(guī)管理。

25、進(jìn)一步的，步驟1所述優(yōu)良單株指的是符合育種目標(biāo)且生長(zhǎng)健壯、無(wú)病、無(wú)蟲(chóng)害的植株。

26、進(jìn)一步的，步驟1-1所述在超凈工作臺(tái)上對(duì)子房進(jìn)行的清洗消毒是指：先將子房置于70%的酒精中浸泡消毒30秒，浸泡完成后取出子房，用無(wú)菌水沖洗一遍；再置于2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15-20分鐘，浸泡完成后取出子房，用無(wú)菌水沖洗三遍，每次5分鐘；上述每次浸泡消毒時(shí)，不斷振蕩裝有酒精或氯酸鈉溶液的容器。

27、進(jìn)一步的，步驟3所述增殖培養(yǎng)基中6-ba的濃度根據(jù)芽叢增殖情況及葉柄、葉片生長(zhǎng)情況在其原有基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，當(dāng)芽叢幼嫩芽過(guò)多，愈傷組織出現(xiàn)透明現(xiàn)象時(shí)，降低6-ba濃度；當(dāng)芽叢基部留有的愈傷組織分化芽點(diǎn)過(guò)少、愈傷組織出現(xiàn)褐化時(shí)，升高6-ba濃度。

28、進(jìn)一步的，步驟5所述生根培養(yǎng)基配方：1/2ms培養(yǎng)基+naa?0.5～1.0mg/l+iba?0.5～1.0mg/l。

29、進(jìn)一步的，步驟6-2所述穴盤(pán)為50穴穴盤(pán)。

30、進(jìn)一步的，步驟6-2所述移栽基質(zhì)優(yōu)選椰糠和蛭石以1：1質(zhì)量比復(fù)配的混合基質(zhì)，并且移栽基質(zhì)內(nèi)加入有0.1~0.5%敵磺鈉。

31、進(jìn)一步的，上述步驟3芽誘導(dǎo)及增殖、步驟4壯苗培養(yǎng)以及步驟5生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件相同，為溫度18-25℃，光照周期12h/d，光強(qiáng)度1500-4000lux。

32、本發(fā)明公開(kāi)了一種以未受精胚珠為外植體進(jìn)行仙客來(lái)組培繁殖的整套技術(shù)方案，提供了仙客來(lái)組培繁殖“胚珠外植體啟動(dòng)、水解酪蛋白營(yíng)養(yǎng)支撐、動(dòng)態(tài)激素調(diào)控、芽叢狀增殖、壯苗態(tài)生根及瓶?jī)?nèi)、瓶外煉苗移栽”的整體思路和具體方法，為提高仙客來(lái)組培接種成活率和出苗成活率及株型塑造提供了有效的新途徑。具體的：

33、（1）本發(fā)明以未受精的胚珠為外植體材料，具有對(duì)植株無(wú)傷害、數(shù)量多、取材方便的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得較多的外植體接種材料；因仙客來(lái)胚珠在子房?jī)?nèi)處于一種無(wú)菌狀態(tài)，故以胚珠為外植體，易于獲得無(wú)菌的外植體材料，污染率極低，克服了采用葉片、球莖等其他外植體易污染的缺陷；并且探索在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入水解酪蛋白，不僅降低了愈傷組織的褐化率，而且使得胚珠接種成功率達(dá)95%以上；

34、（2）在不定芽繼代培養(yǎng)及生根過(guò)程中，采用了根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)情況，進(jìn)行激素動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的方案，有效抑制了愈傷組織的玻璃化或褐變，愈傷組織誘導(dǎo)芽分化率達(dá)96%~100%；

35、（3）本發(fā)明在不定芽增殖、壯苗以及生根培養(yǎng)中，均以芽叢狀或叢生苗的形態(tài)進(jìn)行，并保證芽叢基部留有適量的愈傷組織，使仙客來(lái)出苗率和生根率最高可達(dá)到100%；同時(shí)，本發(fā)明在不定芽增殖過(guò)程中，就有選擇性的對(duì)芽點(diǎn)數(shù)較多的芽叢進(jìn)行篩選，并且在后期壯苗培養(yǎng)和煉苗培養(yǎng)時(shí)，均對(duì)芽叢的形態(tài)進(jìn)行了適當(dāng)修剪，加快了組培苗成型速度，使得組培苗株型緊湊、豐滿、勻稱(chēng)，葉片數(shù)較多；

36、（4）本發(fā)明采用瓶?jī)?nèi)煉苗與瓶外煉苗相結(jié)合的方式進(jìn)行煉苗，并采用特有的移栽基質(zhì)，使得仙客來(lái)瓶苗更加健壯，更易于適應(yīng)后期的移栽環(huán)境，成活率達(dá)95%~100%。

37、本發(fā)明技術(shù)方案的應(yīng)用，將會(huì)顯著提高仙客來(lái)組培苗生產(chǎn)效益，為仙客來(lái)組培苗商業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。