本發(fā)明涉及的是作物遺傳育種的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系及其選育方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花青素是植物中合成的一種水溶性天然色素，花青素是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑，能為人體帶來多種益處，如，能夠保護(hù)人體免受自由基的損傷，增強(qiáng)血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)等等。已在多種糧食作物中發(fā)現(xiàn)了花青素的存在，如玉米、水稻、高粱、紫薯等等。
鮮食紫、黑等彩色玉米富含花青素，因其花青素的含量高，脂肪、蛋白質(zhì)、鐵、鈣、氨基酸等營養(yǎng)元素的含量豐富，被認(rèn)為是鮮食玉米中的保健黃金食品。糊粉層富含花青素是彩色鮮食玉米的一種，因其f1代果實(shí)顏色分離，種子色彩豐富而備受青睞。然而，現(xiàn)有的大多紫色鮮食玉米品種存在上色遲緩的問題，適宜采收期色素含量低，完全上色時(shí)籽粒成熟發(fā)硬又不宜食用，導(dǎo)致正常采收期感官與營養(yǎng)品質(zhì)差。另外，前人在定向培育鮮食玉米自交系時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)糊粉層無花青素合成的親本自交系，經(jīng)雜交后產(chǎn)生果實(shí)顏色分離的f1代，對(duì)育種者造成了很大的困惑。目前，國內(nèi)的彩色玉米種質(zhì)資源十分有限，通過鑒定糊粉層無色的鮮食玉米自交系花青素合成的基因型，可望彌補(bǔ)彩色玉米種質(zhì)資源匱乏的短板，充分發(fā)揮現(xiàn)有玉米種質(zhì)資源的優(yōu)勢，提高彩色玉米品種的選育效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系及其選育方法和應(yīng)用，旨在解決彩色玉米種質(zhì)資源匱乏的短板，提高彩色玉米品種的選育效率。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供了一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系，所述參考系包括r基因型玉米自交系和b基因型玉米自交系，所述r基因型玉米自交系為含如seqidno.1所示核苷酸序列的r基因的糊粉層無色的玉米自交系，所述b基因型玉米自交系為含如seqidno.2所示核苷酸序列的b基因的糊粉層無色的玉米自交系。
本發(fā)明還提供了上述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系的選育方法，包括以下步驟：
(1)在常規(guī)玉米種質(zhì)中選擇糊粉層富含花青素的玉米自交系與糊粉層無色的玉米自交系為親本進(jìn)行雜交，再連續(xù)自交七代，獲得糊粉層無色的玉米自交系；
(2)利用r、b基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，對(duì)步驟(2)經(jīng)雜交和多次自交獲得的糊粉層無色的玉米自交系進(jìn)行r/b基因表達(dá)量的測定，篩選獲得僅攜帶r基因的r基因型玉米自交系和僅攜帶b基因的b基因型玉米自交系，即為所述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系。
進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，鑒定r基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物為：
seqidno.3：r-f：agcgacgagagaagctcaac
seqidno.4：r-r：taggctatcgtttcggcgag。
進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，鑒定b基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物為：
seqidno.5：b-f：ccatcctcgccgaaacgata
seqidno.6：b-r：tggagcccacacagactttc。
本發(fā)明還提供了一種利用上述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系鑒定玉米自交系基因型的方法，步驟包括：
將r基因型玉米自交系和b基因型玉米自交系分別與待鑒定的玉米自交系進(jìn)行雜交，若：
①與r基因型玉米自交系雜交的f0代種子為紫色，與b基因型玉米自交系雜交的f0代種子為無色，則該玉米自交系為b基因型自交系；
②與r基因型玉米自交系雜交的f0代種子為無色，與b基因型玉米自交系雜交的f0代種子為紫色，則該玉米自交系為r基因型自交系；
③與r、b基因型玉米自交系雜交的f0代種子均為無色，則不屬于r、b任一基因型自交系。
本發(fā)明還提供了一種利用上述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系定向培育彩色玉米品種的方法，包括以下步驟：
(i)將參考系中的兩種基因型自交系分別與常規(guī)玉米種質(zhì)中的糊粉層無色的玉米自交系進(jìn)行測配，根據(jù)f0代玉米籽粒糊粉層顏色的呈現(xiàn)，判定測配玉米自交系的基因型，篩選得到基因型為r型和b型的自交系品種；
(ⅱ)將r型和b型的自交系品種進(jìn)行雜交，即可得到糊粉層富含花青素的f0代種子，以及色素分離的f1代種子。
本發(fā)明還提供了一種鮮食玉米糊粉層花青素合成基因的篩選方法，包括以下步驟：
①從常規(guī)玉米種質(zhì)庫中選擇糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系為親本進(jìn)行雜交，構(gòu)建重組自交系，從重組自交系中選擇糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系作為后續(xù)試驗(yàn)材料，并互為對(duì)照，分別提取重組自交系中糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系的授粉后30天種子糊粉層rna；
②對(duì)步驟①的rna進(jìn)行高通量測序，構(gòu)建重組自交系授粉后30天種子糊粉層的轉(zhuǎn)錄組測序文庫；
③根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序文庫篩選重組自交系中糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系之間的差異表達(dá)基因，并對(duì)表達(dá)有差異變化的基因的趨勢進(jìn)行歸類，選擇趨勢最大的基因，利用生物信息學(xué)進(jìn)行功能分析，篩選參與花青素合成調(diào)控的基因，得到r基因和b基因，所述r基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述b基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
進(jìn)一步地，所述步驟②中，利用illuminahiseq2500測序平臺(tái)對(duì)步驟①的rna進(jìn)行高通量測序。
進(jìn)一步地，所述步驟③中，對(duì)趨勢最大的基因進(jìn)行g(shù)eneontology功能分析，篩選參與花青素合成調(diào)控的基因。
本發(fā)明的原理為：通過轉(zhuǎn)錄組測序、分析方法和生物信息學(xué)方法相結(jié)合，分離、鑒定出調(diào)控玉米糊粉層花青素合成的基因r與b，并通過進(jìn)一步的雜交鑒定發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)兩個(gè)基因同時(shí)在糊粉層表達(dá)時(shí)，花青素才進(jìn)行合成，否則，花青素不合成，為定向選育彩色玉米品種奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系選育方法和應(yīng)用，本發(fā)明基于轉(zhuǎn)錄組測序、分析，分離、鑒定出調(diào)控玉米糊粉層花青素合成的基因r與b，結(jié)合傳統(tǒng)雜交手段，分離出花青素?zé)o色的r基因型與b基因型玉米自交系，并以此作為參考系，對(duì)糊粉層無色的鮮食玉米自交系進(jìn)行測配、鑒定。試驗(yàn)驗(yàn)證表明，利用r基因型與b基因型自交系，結(jié)合傳統(tǒng)雜交方法，根據(jù)f0代種子花青素合成的有無，即可有效篩選、鑒定出糊粉層無色玉米自交系的花青素合成基因型，準(zhǔn)確率達(dá)100％，可以應(yīng)用于彩色鮮食玉米自交系的精準(zhǔn)選擇與新品種的培育。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系的選育方法，包括以下步驟：
(1)糊粉層花青素合成調(diào)控基因的篩選
①從常規(guī)玉米種質(zhì)庫中選擇糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系為親本進(jìn)行雜交，構(gòu)建重組自交系，從重組自交系中選擇糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系作為后續(xù)試驗(yàn)材料，并互為對(duì)照，分別提取重組自交系中糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系的授粉后30天種子糊粉層提取rna，所述rna的提取方法包括ctab法、tizol法等，均為常規(guī)提取方法，在此不做詳細(xì)闡述。
②利用illuminahiseq2500測序平臺(tái)對(duì)步驟①的rna進(jìn)行高通量測序，構(gòu)建重組自交系授粉后30天種子糊粉層的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。
③根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序文庫篩選重組自交系中糊粉層紫色的玉米自交系和糊粉層無色的玉米自交系之間的差異表達(dá)基因，并對(duì)表達(dá)有差異變化的基因的趨勢進(jìn)行歸類，通過曲線擬合的方法，得到趨勢最大的20個(gè)基因，對(duì)該20個(gè)基因進(jìn)行g(shù)eneontology功能分析，得到參與花青素合成調(diào)控的r與b基因，所述r與b基因具有如seqidno.1、seqidno.2所示的核苷酸序列。
(2)糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系的構(gòu)建
從安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所的玉米種子庫中選擇糊粉層紫色的玉米自交系6130與糊粉層無色的玉米自交系5520，作為雜交親本，進(jìn)行雜交，雜交后代再連續(xù)自交7代，獲得40份糊粉層無色的玉米自交系，該40份自交系包含r基因型自交系、b基因型自交系和非r/b基因型自交系。
將該40份糊粉層無色的玉米自交系進(jìn)行兩兩雜交，得到2份呈紫色的f0種子，進(jìn)一步證明了玉米糊粉層花青素的合成不是單因素調(diào)控結(jié)果，而是兩個(gè)基因共同作用的結(jié)果。
(3)糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系的篩選
利用r、b基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物：
鑒定r基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物為：
seqidno.3：r-f：agcgacgagagaagctcaac
seqidno.4：r-r：taggctatcgtttcggcgag。
鑒定b基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物為：
seqidno.5：b-f：ccatcctcgccgaaacgata
seqidno.6：b-r：tggagcccacacagactttc。
對(duì)步驟(2)的40份自交系進(jìn)行r/b基因表達(dá)量的測定，篩選獲得2份攜帶r基因的r基因型自交系，命名為自交系6572、6591，以及1份攜帶b基因的b基因型自交系，命名為自交系6533，r基因型自交系和b基因型自交系共同構(gòu)成鮮食玉米糊粉層花青素合成基因型參考系，該結(jié)果與步驟(2)兩兩雜交的結(jié)果相吻合。
(4)驗(yàn)證試驗(yàn)
將上述2份r基因型自交系與1份b基因型自交系進(jìn)行雜交，獲得糊粉層富含花青素的f0代種子，以及色素分離的f1代種子，進(jìn)一步證實(shí)花青素合成是受r和b基因同時(shí)調(diào)控的。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種利用糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系鑒定玉米自交系基因型的方法，其中：
1、材料來源
供試材料的來源為安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所的玉米種質(zhì)庫的鮮食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012與7004，其糊粉層無色。
2、方法
分別以實(shí)施例1培育的r基因型自交系6572與b基因型自交系6533為母本，以鮮食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012與7004為父本進(jìn)行雜交，觀察、記載f0代種子顏色；
選取鮮食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012與7004授粉后30天的種子，剝離胚與胚乳，提取皮組織的rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用r、b基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測r、b基因的表達(dá)情況。
3、結(jié)果
f0代種子顏色觀察結(jié)果：
自交系7101與r基因型自交系的f0代種子紫色，與b基因型自交系的f0代無色，屬于b基因型自交系；
自交系7094與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代紫色，屬于r基因型自交系；
自交系7088與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代紫色，屬于r基因型自交系；
自交系7062與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代無色，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7056與r基因型自交系的f0代種子紫色，與b基因型自交系的f0代無色，屬于b基因型自交系；
自交系7044與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代無色，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7033與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代無色，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7012與r基因型自交系的f0代種子無色，與b基因型自交系的f0代無色，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7004與r基因型自交系的f0代種子紫色，與b基因型自交系的f0代無色，屬于b基因型自交系；
實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證結(jié)果：
自交系7101中有b基因的表達(dá)，屬于b基因型自交系
自交系7094中有r基因的表達(dá)，屬于r基因型自交系；
自交系7088中有r基因的表達(dá)，屬于r基因型自交系；
自交系7062中無r、b基因的表達(dá)，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7056中有b基因的表達(dá)，屬于b基因型自交系；
自交系7044中無r、b基因的表達(dá)，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7033中無r、b基因的表達(dá)，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7012中無r、b基因的表達(dá)，不屬于r、b基因型自交系；
自交系7004中有b基因的表達(dá)，屬于b基因型自交系。
結(jié)論：參考系與待測品種測配結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證結(jié)果完全一致，測配檢測準(zhǔn)確率為100％。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種利用所述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系定向培育彩色玉米品種的方法，包括以下步驟：
(i)按照實(shí)施例2所述方法驗(yàn)證鮮食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012與7004的基因型，得出：自交系7101、7056、7004為b基因型自交系，自交系7094、7088為r基因型自交系。
(ⅱ)將自交系7101、7056或7004與自交系7094或7088進(jìn)行雜交，得到糊粉層富含花青素的f0代種子，以及色素分離的f1代種子。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供了另一種利用所述糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系系定向培育彩色玉米品種的方法，包括以下步驟：
(i)在常規(guī)玉米種質(zhì)庫中選擇糊粉層紫色的玉米自交系糊粉層無色的玉米自交系作為親本進(jìn)行雜交，雜交后代再連續(xù)自交6-7代，獲得糊粉層無色的玉米自交系。
(ⅱ)按照實(shí)施例2所述方法驗(yàn)證步驟(i)獲得的糊粉層無色的玉米自交系的基因型，篩選r基因型自交系品種和b基因型自交系品種。
(ⅲ)將r基因型自交系品種和b基因型自交系品種進(jìn)行雜交，得到糊粉層富含花青素的f0代種子，以及色素分離的f1代種子。
以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。
sequencelisting
<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
<120>一種糊粉層花青素合成型鮮食玉米參考系及其選育方法和應(yīng)用
<130>/
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