本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于提高白芷劣變種子活力的復(fù)合引發(fā)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：白芷為傘形科植物白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f或杭白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.var.formosana(boiss.)shanetyuan的干燥根，以根入藥，其性溫，氣芳香，味辛、微苦，歸胃、結(jié)腸、肺經(jīng)，具有散風(fēng)除濕、通竅鎮(zhèn)痛、消腫排膿等功效。白芷為川產(chǎn)道地藥材，主產(chǎn)于四川遂寧，在資陽、南充、瀘州、達(dá)州等地零散分布，其產(chǎn)量高，占全國白芷總產(chǎn)量70％以上，除供應(yīng)國內(nèi)市場外，還遠(yuǎn)銷香港、東南亞、日本及歐美等地。白芷藥材主要來源于栽培，生產(chǎn)上以種子繁殖為主，多采用自繁自育。通常種子成熟后在收獲加工與儲藏存放期間會發(fā)生活力下降的不可逆的變化，即種子劣變或老化。該過程表現(xiàn)為種子發(fā)芽率和生活力降低，內(nèi)部相應(yīng)酶系統(tǒng)發(fā)生改變，細(xì)胞膜的通透性增強等特點，進而影響種子質(zhì)量，對生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。白芷種子在常規(guī)保存手段下，劣變速度較快，隔年陳種子發(fā)芽率不高，而制約種子發(fā)芽率的原因尚不清楚。種子劣變在種子貯藏過程中不可避免，直接影響種子的質(zhì)量和種子的播種特性。種子劣變是一個涉及許多復(fù)雜生理生化反應(yīng)的過程，包括脂質(zhì)的過氧化、膜的變化與滲出物、酶活性、呼吸作用與atp含量、生物合成能力、內(nèi)源激素及有毒物質(zhì)含量等方面的變化，主要體現(xiàn)在種子發(fā)芽率、生活力、質(zhì)膜完整性降低，內(nèi)部保護酶系統(tǒng)活性減弱，有毒有害物質(zhì)積累等特點。種子引發(fā)可看做是種子發(fā)芽的預(yù)準(zhǔn)備，引發(fā)期間，種子內(nèi)部進行復(fù)雜的生理生化變化和物質(zhì)代謝，對劣變種子進行生化修補，包括各種酶和蛋白與膜的重新結(jié)合和恢復(fù)，提高膜的完整性，降低種子內(nèi)有機物質(zhì)的外滲，提高種子活力。種子引發(fā)技術(shù)是一項控制種子緩慢吸水和后期逐步回干的種子處理技術(shù)，使種子充分吸水到一定水平，保證種子有一定的預(yù)發(fā)芽代謝作用，又防止胚根伸長，是修復(fù)和提高種子活力的一種有效途徑。目前，種子引發(fā)技術(shù)已用于許多植物中的研究，包括糧食、蔬菜、花卉、牧草等，尤其近20年來已作為一些蔬菜和花卉種子的播前常用處理技術(shù)，但在中藥材種植方面的研究與應(yīng)用較少。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種種子引發(fā)劑。本發(fā)明提供的種子引發(fā)劑包括氯化鈉、硝酸鉀和聚乙二醇。上述種子引發(fā)劑中，所述氯化鈉、所述硝酸鉀和所述聚乙二醇的質(zhì)量比為3：3：175。上述種子引發(fā)劑中，所述種子引發(fā)劑由氯化鈉、硝酸鉀、聚乙二醇和水組成；所述氯化鈉在所述種子引發(fā)劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60％；所述硝酸鉀在所述種子引發(fā)劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60％；所述聚乙二醇在所述種子引發(fā)劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35％。本發(fā)明的第二個目的是提供上述種子引發(fā)劑的新用途。本發(fā)明提供了上述種子引發(fā)劑在如下1)-10)中任一種中的應(yīng)用：1)提高種子活力；2)制備提高種子活力的產(chǎn)品；3)提高種子發(fā)芽率和/或發(fā)芽勢和/或發(fā)芽指數(shù)和/或活力指數(shù)；4)制備提高種子發(fā)芽率和/或發(fā)芽勢和/或發(fā)芽指數(shù)和/或活力指數(shù)的產(chǎn)品；5)降低種子浸出液電導(dǎo)率；6)制備降低種子浸出液電導(dǎo)率的產(chǎn)品；7)提高種子過氧化物酶活性；8)制備提高種子過氧化物酶活性的產(chǎn)品；9)提高種子可溶性蛋白質(zhì)含量；10)制備提高種子可溶性蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品。上述應(yīng)用中，所述種子為劣變種子；所述劣變種子具體為白芷劣變種子。本發(fā)明的第三個目的是提供一種提高種子活力的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的提高種子活力的產(chǎn)品的活性成分為上述種子引發(fā)劑。本發(fā)明的第四個目的是提供一種提高種子活力的方法。本發(fā)明提供的提高種子活力的方法包括用上述種子引發(fā)劑對種子進行引發(fā)處理的步驟。上述方法中，所述種子引發(fā)劑與所述種子的配比為1g：5ml。本發(fā)明的第五個目的是提供上述產(chǎn)品或上述方法的新用途。本發(fā)明提供了上述產(chǎn)品或上述方法在如下(1)-(8)中任一種中的應(yīng)用：(1)提高種子發(fā)芽率和/或發(fā)芽勢和/或發(fā)芽指數(shù)和/或活力指數(shù)；(2)制備提高種子發(fā)芽率和/或發(fā)芽勢和/或發(fā)芽指數(shù)和/或活力指數(shù)的產(chǎn)品；(3)降低種子浸出液電導(dǎo)率；(4)制備降低種子浸出液電導(dǎo)率的產(chǎn)品；(5)提高種子過氧化物酶活性；(6)制備提高種子過氧化物酶活性的產(chǎn)品；(7)提高種子可溶性蛋白質(zhì)含量；(8)制備提高種子可溶性蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品。上述產(chǎn)品或上述方法或上述應(yīng)用中，所述種子為劣變種子；所述劣變種子具體為白芷劣變種子。在本發(fā)明的具體實施例中，所述白芷劣變種子來源于四川遂寧市永興鎮(zhèn)中脊村，2015年采收，種子含水量為9.92％，千粒重為2.64g，發(fā)芽率為53.7％，種子常溫條件下貯藏約245天后用于試驗。本發(fā)明采用常用的引發(fā)劑nacl、kno3和peg以不同配比對白芷種子進行引發(fā)處理，引發(fā)處理后進行種子發(fā)芽試驗，通過測定不同處理種子的發(fā)芽指標(biāo)和生理指標(biāo)及種子發(fā)芽力和活力，分析不同引發(fā)處理對白芷劣變種子活力的影響，并比較不同引發(fā)劑配比間的引發(fā)效果，發(fā)掘最適宜的引發(fā)劑配比。實驗結(jié)果表明，三因素復(fù)合引發(fā)對種子萌發(fā)影響的主次順序是：peg>kno3>nacl，n2k1p3(0.60％nacl+0.60％kno3+35％peg)是最佳處理組合，引發(fā)處理后的白芷種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、可溶性蛋白、pod活性均得到不同程度提高，電導(dǎo)率降低。本發(fā)明的復(fù)合引發(fā)劑的使用不僅能改善和修復(fù)劣變種子已受損的膜系統(tǒng)，降低劣變種浸出液電導(dǎo)率、提高可溶性蛋白含量、增強pod酶活性，提高種子活力，而且為白芷種子的大田播種及藥材生產(chǎn)提供依據(jù)。附圖說明圖1為復(fù)合引發(fā)劑處理對種子浸出液電導(dǎo)率的影響。圖2為復(fù)合引發(fā)劑處理對種子可溶性蛋白含量的影響。圖3為復(fù)合引發(fā)劑處理對種子pod活性的影響。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中的供試白芷種子來源于四川遂寧市永興鎮(zhèn)中脊村，2015年采收，種子含水量為9.92％，千粒重為2.64g，發(fā)芽率為53.7％，種子常溫條件下貯藏約245天后用于試驗。下述實施例中所使用的化學(xué)引發(fā)劑聚乙二醇(peg6000)、nacl和kno3均為分析純，均為鵬世達(dá)生物試劑有限公司的產(chǎn)品。下述實施例中的數(shù)據(jù)分析處理采用dps統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用新復(fù)極差法進行顯著性分析。實施例1、復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子活力的影響一、試驗分組及試驗方法1、試驗分組試驗選擇nacl、kno3和peg作為復(fù)合引發(fā)劑，采用正交試驗設(shè)計nacl、kno3和peg的配比，得到不同的復(fù)合引發(fā)劑處理組。正交試驗的各因素及其水平見表1。根據(jù)正交試驗設(shè)計，共進行9次試驗。不同配比的復(fù)合引發(fā)劑處理組分別如下：處理組1：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑1；復(fù)合引發(fā)劑1中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20％、0.60％和15％；處理組2：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑2；復(fù)合引發(fā)劑2中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20％、1.80％和25％；處理組3：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑3；復(fù)合引發(fā)劑3中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20％、3％和35％；處理組4：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑4；復(fù)合引發(fā)劑4中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.60％、1.80％和25％；處理組5：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑5；復(fù)合引發(fā)劑5中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.60％、3％和25％；處理組6：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑6；復(fù)合引發(fā)劑6中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.60％、0.60％和35％；處理組7：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑7；復(fù)合引發(fā)劑7中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1％、3％和15％；處理組8：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑8；復(fù)合引發(fā)劑8中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1％、0.60％和25％；處理組9：將nacl、kno3、peg和水混勻，得到復(fù)合引發(fā)劑9；復(fù)合引發(fā)劑9中的nacl、kno3和peg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1％、1.80％和35％。表1、正交試驗因素與水平l9(33)設(shè)計水平naclkno3peg10.20％0.60％15％20.60％1.80％25％31％3％35％表2正交試驗表l9(33)2、種子引發(fā)處理選擇大小和飽滿度較為一致的白芷種子置于錐形瓶中，每個錐形瓶中放入10g種子，然后分別浸于50ml步驟1制備的不同的復(fù)合引發(fā)劑中進行種子引發(fā)處理，密封，20℃恒溫培養(yǎng)箱處理24h，得到引發(fā)處理后種子，同時以蒸餾水為對照。引發(fā)結(jié)束后，取出種子，洗凈，吸干種子表面水分后置于兩層吸水紙間自然回干至原含水量后進行種子發(fā)芽試驗。3、種子發(fā)芽試驗及發(fā)芽情況統(tǒng)計將引發(fā)處理后種子進行種子發(fā)芽試驗。具體步驟如下：將種子按10*10擺放種子發(fā)芽盒內(nèi)濕潤的發(fā)芽紙上。發(fā)芽溫度設(shè)置為25℃/18℃晝夜變溫，光照12h，每種處理隨機選取100粒種子，3次重復(fù)。每日觀察種子發(fā)芽情況，第15天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第40天統(tǒng)計發(fā)芽率，并計算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)(gi)＝σgt/dt(gt為在t天的發(fā)芽種子數(shù)，dt為相應(yīng)種子發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)(ⅵ)＝σgi×s(s為苗鮮重)。4、電導(dǎo)率測定隨機選取50粒步驟2得到的引發(fā)處理結(jié)束后回干至原含水量的種子，3次重復(fù)。用離子水沖洗3遍，再用濾紙吸干表面水分，然后將種子放入250ml燒杯中，加入100ml去離子水，測定初始電導(dǎo)率；用保鮮膜將燒杯封口，室溫條件下靜置24h后測定種子浸出液電導(dǎo)率。種子浸出液電導(dǎo)率[μs/(cm*g)]＝(種子浸出液電導(dǎo)率-初始電導(dǎo)率)/種子樣品質(zhì)量。5、過氧化物酶(pod)活性測定參照文獻(xiàn)“張志良.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[m].北京：高等教育出版社，1990:123-124”中的方法測定步驟2得到的引發(fā)處理結(jié)束后回干至原含水量的種子的過氧化物酶活性，3次重復(fù)。具體步驟如下：取白芷種子0.5g，置于研缽中，加入5ml0.02mol/lkh2po4研磨成勻漿，4000r/min離心15min，收集上清液保存在冰上。所得殘渣再用5ml0.02mol/lkh2po4提取一次，合并兩次上清液，酶提取液10ml冰浴研磨，在4℃，1200r/min離心15min，上清液為酶粗提液，在0～4℃下保存。取酶提取液0.5ml(視酶活性大小稀釋原液)，加3mlpod反應(yīng)液，內(nèi)含0.08％h2o2，0.1％愈創(chuàng)木酚的pbs(ph7.0)，立即于470nm處比色，每30s記錄一次讀數(shù)，記錄讀數(shù)3min，取呈線部分計算od值變化，酶活性單位以△od470/min·g表示。反應(yīng)混合液配置100mmol/lph6.0磷酸緩沖液50ml，加入愈創(chuàng)木酚28ul，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30％過氧化氫19ul，混合均勻，保存于冰箱中，備用。6、可溶性蛋白質(zhì)含量測定參照文獻(xiàn)“高俊鳳.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[m].北京：高等教育出版社，2006:142.”中的方法測定步驟2得到的引發(fā)處理結(jié)束后回干至原含水量的種子的可溶性蛋白質(zhì)含量，3次重復(fù)。具體步驟如下：取白芷種子0.5g，置于研缽中用ph7.0磷酸緩沖液研磨成勻漿后，定容25ml，10000r/min離心10min，取上清液1ml(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)于試管中，備用。吸取樣品提取液0.1ml，放入具塞刻度試管中(設(shè)兩個重復(fù)管)，加入5ml考馬斯亮藍(lán)g-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y＝0.0608x+0.2218(r2＝0.9073)查得蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量(％)＝c×v2×v0×100/(m×v1)，式中：c代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)濃度(g/ml)；v0代表樣品溶液的總體積(ml)；v1代表測定時加樣量(ml)；v2代表測定時定容體積(ml)；m代表樣品的質(zhì)量(g)。二、復(fù)合引發(fā)劑引發(fā)處理對種子的影響(一)復(fù)合引發(fā)劑引發(fā)處理對種子活力的影響復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子活力的影響如表3所示。從各處理組的發(fā)芽率數(shù)值可以看出，處理組6的種子發(fā)芽率最高，處理組7的發(fā)芽率最小，復(fù)合引發(fā)劑處理的最佳組合為處理組6中的復(fù)合引發(fā)劑6；從極差來看，三因素復(fù)合對發(fā)芽率影響的主次順序是：peg>nacl>kno3；處理組3和處理組6與其他處理間差異顯著，處理組4、處理組7和ck組間差異不顯著。從各處理組的發(fā)芽勢數(shù)值可以看出，處理組9的種子發(fā)芽勢最高，ck組的發(fā)芽勢最小，復(fù)合引發(fā)劑處理的最佳組合為處理組9中的復(fù)合引發(fā)劑9；從極差來看，三因素復(fù)合對發(fā)芽勢影響的主次順序是：peg>kno3>nacl；處理組6、處理組9與其他處理組間差異顯著，處理組6與處理組9間差異不顯著。從各處理組的發(fā)芽指數(shù)數(shù)值可以看出，處理組6的種子發(fā)芽指數(shù)最高，處理組7、ck組的發(fā)芽指數(shù)最小，復(fù)合引發(fā)劑處理的最佳組合為處理組6中的復(fù)合引發(fā)劑6；從極差來看，三因素復(fù)合對發(fā)芽指數(shù)影響的主次順序是：peg>kno3>nacl；處理組3、處理組6、處理組9與其他處理間差異顯著，處理組1、處理組4、處理組7、ck組間差異不顯著。從各處理組的活力指數(shù)數(shù)值可以看出，處理組6的種子活力指數(shù)最高，處理組7的活力指數(shù)最小，復(fù)合引發(fā)劑處理的最佳組合為處理組6中的復(fù)合引發(fā)劑6；從極差來看，三因素復(fù)合對活力指數(shù)影響的主次順序是：peg>kno3>nacl；處理組6與其他處理間差異顯著，處理組1、處理組4、處理組7間差異不顯著。由此可知，三因素復(fù)合引發(fā)對種子萌發(fā)影響的主次順序是：peg>kno3>nacl；最佳復(fù)合引發(fā)劑為處理組6中的復(fù)合引發(fā)劑6(0.60％nacl+0.60％kno3+35％peg)。3因素中peg對白芷種子萌發(fā)及生理生化指標(biāo)的影響最大，其次是nacl與kno3，且在復(fù)合引發(fā)劑中peg比例越高，引發(fā)效果越好，越低則效果越差，可能是因為peg為大分子化合物，主要是通過滲透調(diào)節(jié)控制種子的吸水量，不易滲入種子內(nèi)部，對種子不造成傷害，nacl與kno3是屬于無機鹽類，其離子可以在處理過程中滲入種子內(nèi)部并在種子中積累，從而降低種子滲透勢，導(dǎo)致種子吸收更多水分反而降低引發(fā)效果，當(dāng)三者達(dá)到一定平衡比例時，種子的吸水量正好處于吸脹吸水的第二階段，即通過萌發(fā)初始階段但胚根尚未突破種皮，期間種子進行貯藏物質(zhì)和酶的活化，以及細(xì)胞膜、細(xì)胞器和dna的修復(fù)，提高種子活力，為萌芽做好生理準(zhǔn)備。表3、復(fù)合引發(fā)劑引發(fā)處理對種子活力的影響正交設(shè)計方差分析注：m為均值，r為均值極差，表中同列小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上的差異顯著。(二)復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子內(nèi)部生理生化的影響1、復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子電導(dǎo)率的影響細(xì)胞膜系統(tǒng)在細(xì)胞代謝活動中起著重要作用，不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的交流和運輸，而且可以影響代謝過程中酶的活性。劣變后種子細(xì)胞膜的透性增加，細(xì)胞浸泡液濃度升高，電導(dǎo)率也隨之增加。復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子電導(dǎo)率的影響見圖1。從圖中可以看出：處理組6的種子電導(dǎo)率最小，處理組7的電導(dǎo)率最大。處理組1、2、3、6、8與處理組5、7、9、ck間差異顯著。由此可知，復(fù)合引發(fā)劑6是最佳的復(fù)合引發(fā)劑，可降低白芷劣變種子電導(dǎo)率。2、復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子可溶性蛋白含量的影響不同復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子可溶性蛋白含量的影響如圖2所示。從圖2可以看出：處理組6的種子可溶性蛋白含量最高，處理組7的種子可溶性蛋白含量最低。處理組3、6與其他處理間差異顯著，處理組1、4、7、ck間差異不著。由此可知，復(fù)合引發(fā)劑6是最佳的復(fù)合引發(fā)劑，可提高白芷劣變種子可溶性蛋白含量。3、復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子pod活性的影響不同復(fù)合引發(fā)劑處理對白芷劣變種子pod活性的影響如圖3所示。從圖3可以看出：處理組6的種子pod活性最高，處理組7的種子pod活性最低。處理組3、6與處理組1、4、5、7、8、ck間差異顯著，處理組1、4、7、ck間差異不顯著。由此可知，復(fù)合引發(fā)劑6是最佳的復(fù)合引發(fā)劑，可提高白芷劣變種子pod活性。當(dāng)前第1頁12