本發(fā)明涉及一種林木根部快捷菌劑接種方法。

背景技術(shù)：

根瘤菌、菌根菌、木霉菌、解磷解鉀菌、根際促生菌pgpr等一批微生物菌劑在提高農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病和林木育苗質(zhì)量、造林成活率等方面發(fā)揮了重要作用。采用合適的接種方法使菌劑在短時(shí)間內(nèi)成功侵染植物根部是發(fā)揮其功能的重要前提條件。目前常見的接種方法有拌種、灌根、蘸根。對(duì)于在苗床培育的扦插苗或?qū)嵣?，還可以采用苗木截根菌液浸根和打孔注菌接種等方法，從而加速菌根形成。但總體而言，目前微生物肥料普遍面臨的共性問(wèn)題是試驗(yàn)效果不穩(wěn)定、不理想。除了菌種資源本身質(zhì)量?jī)?yōu)劣外，常規(guī)的接種方法也導(dǎo)致了菌劑侵染植物根部的隨機(jī)性和不確定性，特別對(duì)某些林木樹種，如松科、櫟類樹種苗木根系堅(jiān)硬、木質(zhì)化程度較高，給共生菌(如內(nèi)生菌、菌根真菌等)的侵染定殖設(shè)立了一道物理屏障。因此探索一套高效、快捷的林木根部菌劑接種技術(shù)就顯得尤為迫切，對(duì)今后更好地推廣應(yīng)用微生物肥料產(chǎn)品也具有重要的示范效應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種接種效果佳的林木根部快捷菌劑接種方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一林木根部快捷菌劑接種方法，在接種前對(duì)林木根部(帶有根系的林木根部，包括主根、側(cè)根等所有根系)進(jìn)行超聲波預(yù)處理；所述超聲波預(yù)處理為：超聲5±1s、間隔5～10s為一次，重復(fù)10～20次；超聲功率為80～100w。

作為本發(fā)明的林木根部快捷菌劑接種方法的改進(jìn)：所述接種為蘸根接菌處理，所述菌包括真菌孢子或菌絲體。

作為本發(fā)明的林木根部快捷菌劑接種方法的進(jìn)一步改進(jìn)：林木包括楊樹、楓香和櫟樹。

作為本發(fā)明的林木根部快捷菌劑接種方法的進(jìn)一步改進(jìn)：林木為毛白楊無(wú)性系幼苗、麻櫟幼苗和北美楓香幼苗時(shí)，所述超聲波預(yù)處理為：超聲5±1s、間隔5～10s為一次，重復(fù)10次；超聲功率為80w。

在本發(fā)明中，超聲波處理時(shí)，將林木根部(帶有根系的林木根部)浸入常規(guī)的生理鹽水或植物營(yíng)養(yǎng)液即可，即，使根系懸浮在上述溶液中；將超聲破碎儀的探頭放入至溶液中。設(shè)置超聲破碎儀的功率為80～100w。所述生理鹽水即0.85％(質(zhì)量％)的氯化鈉水溶液。

本發(fā)明采用超聲波預(yù)處理，經(jīng)優(yōu)化處理頻率和時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在林木(以楊樹、楓香和櫟樹為材料)根表可形成密集的微創(chuàng)，然后進(jìn)行蘸根接菌處理(真菌孢子或菌絲體)，結(jié)果表明該接種方法操作快捷，超聲波低強(qiáng)度處理根系后對(duì)苗木生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響；真菌菌絲體或孢子在短時(shí)間內(nèi)(一周左右)可進(jìn)入根系皮層細(xì)胞形成明顯的侵染結(jié)構(gòu)與特征，而且能提高苗木生長(zhǎng)或耐鹽性能。同時(shí)，本發(fā)明設(shè)置了未經(jīng)超聲波處理的苗木，在相同條件下蘸根接菌處理，發(fā)現(xiàn)上述供試菌株對(duì)苗木生長(zhǎng)或耐鹽性無(wú)明顯影響。

苗木截根化接種菌劑的基本原理與本發(fā)明類似，其目的是人為在根部制造傷口，利于菌劑侵染。但該技術(shù)主要對(duì)主根根段的橫截面進(jìn)行傷根處理，菌劑有效侵染的傷口仍十分有限，因此效果不佳。而本發(fā)明的最大技術(shù)優(yōu)勢(shì)：可以在不截取根段的情況下，在苗木主根、側(cè)根等所有根系系統(tǒng)形成密集的機(jī)械微創(chuàng)，可保證細(xì)菌菌體細(xì)胞、真菌孢子或菌絲、生長(zhǎng)速度快或者慢的菌株都可以短時(shí)間內(nèi)侵入根部組織，操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)，為今后成功開發(fā)、應(yīng)用微生物制劑提供了重要的配套技術(shù)。

本發(fā)明具體包括如下內(nèi)容：

實(shí)驗(yàn)材料

一、苗木培育

1、楊樹幼苗無(wú)性系組培擴(kuò)繁。毛白楊(populustomentosa)無(wú)菌苗在1/2ms+iba(吲哚乙酸，0.3mg/l)生根培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁。練苗。準(zhǔn)備土壤基質(zhì)：將黃泥土、有機(jī)肥、珍珠巖、蛭石按照3:1:1:1(體積比)的比例混合，攪拌均勻后121℃高壓滅菌15min。滅菌冷卻后，加水拌土倒入育苗床中。用鑷子將生根培養(yǎng)后根系較發(fā)達(dá)的完整無(wú)菌幼苗輕輕取出，清洗根部后移栽至育苗床的基質(zhì)中，放置于光照培養(yǎng)架上，薄膜覆蓋，25℃下生長(zhǎng)10天后逐步揭開薄膜，完成練苗。

2、北美楓香(liquidambarstyraciflua)實(shí)生苗培育。使用0.1％(v/v)的升汞對(duì)北美楓香鐘子進(jìn)行表面消毒5min，無(wú)菌水沖洗5次，播種到滅菌土壤基質(zhì)(配比同上)中，在25℃、12h光照條件下培養(yǎng)一個(gè)月左右。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行接種試驗(yàn)。

3、麻櫟(quercusacutissima)實(shí)生苗培育，方法同北美楓香。

二、真菌菌株

彎孢霉(curvulariasp.)：

孢子懸浮液制備方法：首先取真菌平板，倒入少量0.85％無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌毛刷輕輕刮取菌絲，菌懸液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得起始孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板，在蔡司光學(xué)顯微鏡(zeiss,axioscopea1)下進(jìn)行計(jì)數(shù)；最后用生理鹽水稀釋至濃度為1×10⁶ml^-1的孢子懸浮液。

鏈格孢菌(alternariasp.)：

由于該菌株產(chǎn)孢量較少，故采用菌絲體懸浮液接種。首先，接種菌塊至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(pdb)，在25℃，180rpm/min的條件下振蕩培養(yǎng)5天，過(guò)濾收獲菌絲，稱取3克濕菌絲放入50ml無(wú)菌離心管，加入20ml左右0.85％無(wú)菌生理鹽水，用電動(dòng)研磨儀打碎菌絲，稀釋到200ml，制備菌絲懸浮液。

假禾谷鐮刀菌(fusariumpseudograminearum)：孢子制備方法同彎孢霉。

三、超聲波處理后楊樹根系表面創(chuàng)傷觀察

掃描電鏡樣品制備和觀察的主要步驟：

(1)抽氣固定：在無(wú)菌50ml離心管中加入2.5％戊二醛固定液約10ml，取少量毛白楊幼苗根系(超聲波處理后的幼苗根系)放入固定液中。使用抽氣泵真空抽氣30min，隨后更換固定液一次，4℃過(guò)夜保存。

2.5％戊二醛固定液的配方為：25％(體積％)戊二醛1ml，雙蒸水4m，0.2mol/l磷酸緩沖液(ph＝7.4)5ml。

(2)梯度脫水：提前制備好濃度依次為30％、50％、70％、80％、90％和100％(v/v)的適量乙醇水溶液，從固定液中取出樣品，依次放入各梯度酒精溶液中進(jìn)行脫水，每個(gè)梯度依次浸泡40min，最后用濾紙吸去表面乙醇。

(3)干燥：使用k850co2臨界點(diǎn)干燥儀(quorum/emitech，英國(guó))對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理。加熱升溫過(guò)程中，使腔室內(nèi)的co2升溫至約35℃和1250psi(壓力單位)的穩(wěn)定狀態(tài)。放氣減壓時(shí)，保持排氣速率在100psi/min。

(4)噴金：接下來(lái)將樣品黏貼于sem專用黑膠表面，放置于載物架上，使用sbc-12小型離子濺射儀(kykytechnologyco，北京)在樣品表面噴金，電流設(shè)置為50ma，時(shí)間約20s。

(5)觀察：使用phenomprox飛納臺(tái)式掃描電子顯微鏡(phenom-world，荷蘭)，加速電壓5kv，觀察超聲波處理后楊樹根系結(jié)構(gòu)變化。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為三種不同超聲波處理強(qiáng)度對(duì)毛白楊分析物理結(jié)構(gòu)的影響。

a：對(duì)照組(未經(jīng)超聲波處理)；b～d：不同超聲波處理強(qiáng)度(同表1)。

圖2為超聲波處理后接種彎孢霉(curvulariasp.)的孢子懸浮液在毛白楊根系形成的侵染結(jié)構(gòu)；

a：在根毛細(xì)胞內(nèi)形成的“微菌核”結(jié)構(gòu)；b-h：在根系皮層細(xì)胞形成的念珠狀或膨大的菌絲細(xì)胞。

圖3為超聲波處理(a)和未超聲波處理(b)接種彎孢霉(curvulariasp.)孢子懸浮液對(duì)北美楓香耐鹽能力的影響。

圖4為超聲波接種處理苗木根系后接種3個(gè)菌株提高毛白楊、麻櫟的生長(zhǎng)和耐鹽能力；

上圖中的左為在鹽脅迫條件下，接種彎孢霉提高毛白楊的耐鹽能力及生物量(苗木鮮重)，上圖中的右為彎孢霉接種毛白楊盆栽試驗(yàn)；

中圖中的左為在鹽脅迫條件下，接種假禾谷鐮刀菌提高麻櫟的耐鹽能力及生物量(苗木鮮重)，中圖中的右為假禾谷鐮刀菌接種麻櫟的盆栽試驗(yàn)；

下圖中的左為在鹽脅迫條件下，接種鏈格孢菌提高麻櫟的耐鹽能力及生物量(苗木鮮重)，下圖中的右為鏈格孢菌接種麻櫟的盆栽試驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1、一種林木根部快捷菌劑接種方法，毛白楊在接種前對(duì)根部進(jìn)行超聲波預(yù)處理；將根部浸入常規(guī)的生理鹽水中，即，使根系懸浮在生理鹽水中；將超聲破碎儀的探頭放入至生理鹽水中。

超聲波預(yù)處理強(qiáng)度(即，超聲破碎儀的功率)設(shè)置成3種，具體如表1所述。

表1毛白楊根系不同超聲波處理強(qiáng)度參數(shù)設(shè)置

1、超聲波處理對(duì)苗木根系物理結(jié)構(gòu)的影響及真菌侵染結(jié)構(gòu)觀察。

用三種超聲波強(qiáng)度處理毛白楊根系(表1)，發(fā)現(xiàn)處理后根系物理結(jié)構(gòu)被破壞，在根表形成較密集的微創(chuàng)；隨著處理強(qiáng)度的增強(qiáng)，傷口逐漸變大。處理組b和c對(duì)根系結(jié)構(gòu)的損傷程度差不多；而處理組d形成較明顯的裂痕，最寬處達(dá)100μm左右，長(zhǎng)度達(dá)到500μm以上(見圖1)。因此在本發(fā)明中，為了即保持苗木正常生長(zhǎng)，又利于孢子、菌絲體侵染根系，選擇強(qiáng)度比較適中的處理組b。

2、將超聲波處理后的根系浸泡在彎孢霉的孢子懸浮液30s，隨后移栽至滅菌培養(yǎng)基質(zhì)。經(jīng)染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)接種后5天，在根部皮層細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)均形成明顯的侵染結(jié)構(gòu)，主要包括念珠狀的菌絲細(xì)胞和膨大的菌絲，侵染率較高。而未經(jīng)超聲波處理的根系，在相同接種劑量和培養(yǎng)時(shí)間下，幾乎觀察不到侵染結(jié)構(gòu)。具體如圖2所述。

實(shí)施例2、比較超聲波處理、未經(jīng)超聲波處理的北美楓香幼苗接種彎孢霉(curvulariasp.)孢子液

共挑選80余株幼苗，40株較大的、根系發(fā)達(dá)的幼苗一組(每株重約8g)，作為超聲波處理組；40株較小的幼嫩的幼苗一組(每株重約4g)，作為未經(jīng)超聲波處理組。

未經(jīng)超聲波處理的幼苗分成對(duì)照組和接種組，每組20株，接種組根系在孢子懸浮液中浸泡10min，4株/盆，移栽后每株補(bǔ)加100μl孢子液(移栽至土壤基質(zhì)后，用移液槍吸取100μl孢子液接種至幼苗根部周圍。)。對(duì)照組在無(wú)菌水中浸泡，補(bǔ)加相應(yīng)無(wú)菌水。

超聲波處理組共40株幼苗，也分為對(duì)照組和接種組，具體參數(shù)見表2。接種方法同上(參照實(shí)施例1)。接種組將根系在孢子懸浮液中浸泡5min后移栽，每盆4株，每株補(bǔ)加100μl菌液，最后每盆再整體加5ml菌液。對(duì)照組根系在生理鹽水中浸泡5min，并補(bǔ)加相應(yīng)生理鹽水。將所有盆栽放置于25℃光照培養(yǎng)室中，一周后每盆添加2％海鹽溶液50ml進(jìn)行鹽脅迫處理。一周后觀察幼苗生長(zhǎng)和萎蔫情況，并拍照記錄。

表2苗木根系超聲波處理參數(shù)

結(jié)果如圖3所示，表明：經(jīng)過(guò)超聲波處理后的楓香幼苗，和對(duì)照組相比，處理組楓香長(zhǎng)勢(shì)較好，并未出現(xiàn)明顯的萎蔫癥狀；未經(jīng)過(guò)超聲波處理的楓香幼苗，對(duì)照組和處理組幼苗的葉片均有萎蔫現(xiàn)象，對(duì)照組生長(zhǎng)稍弱于處理組。說(shuō)明超聲波處理對(duì)植物根部造成的傷口可能更利于真菌侵染，并且該菌可提高北美楓香的耐鹽能力。

實(shí)施例3、超聲波處理毛白楊、麻櫟根系后接種三株功能菌株的效應(yīng)。

將練苗后的毛白楊和麻櫟實(shí)生幼苗為材料(每株的重量分別約為3g、6g)，彎孢霉和假禾谷鐮刀菌的分生孢子懸浮液濃度為1×10⁴ml^-1；鏈格孢菌的菌絲懸浮液配置方法見上。土壤基質(zhì)同上。經(jīng)超聲波預(yù)處理(處理方式同表2，每組共計(jì)8-10株)，用孢子(或菌絲)懸浮液進(jìn)行蘸根接種。對(duì)照組根系超聲波處理后浸泡于生理鹽水，10min后移栽，每盆1-2株，每個(gè)處理設(shè)置8-10個(gè)重復(fù)。接種后放置于25℃光照培養(yǎng)室中。10天后，每隔一周進(jìn)行鹽脅迫處理，每株苗添加2％海鹽溶液50ml。觀察幼苗生長(zhǎng)及萎蔫癥狀，稱量并記錄生物量。

具體如圖4所示，根據(jù)圖4可知：經(jīng)超聲波處理后，根系接種三株真菌菌株后，兩種苗木均表現(xiàn)促生和耐鹽效應(yīng)，其中鹽脅迫處理后，彎孢霉和鏈格孢菌接種后的苗木生物量差異達(dá)到顯著水平。

本發(fā)明采用低強(qiáng)度超聲波處理苗木根系，在根表面形成密集的微創(chuàng)，為微生物菌體或孢子的快速侵染提供了有利條件，同時(shí)該處理強(qiáng)度對(duì)苗木生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。當(dāng)然，不同苗木或苗木的不同生長(zhǎng)階段，根系質(zhì)地和結(jié)構(gòu)仍有差異，因此超聲波處理強(qiáng)度可以在本發(fā)明的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)增減。總之，本發(fā)明在現(xiàn)有微生物肥料常用接種方法基礎(chǔ)之上，進(jìn)行提升和優(yōu)化，對(duì)今后充分發(fā)揮微生物肥料的功效具有重要的指導(dǎo)意義。

對(duì)比例1～對(duì)比例5、將實(shí)施例3中的苗木根系超聲波處理參數(shù)改成如下表3所述，其余等同于實(shí)施例3。所得結(jié)果如下表4所述。

對(duì)比例6、將實(shí)施例3中的“超聲波預(yù)處理”改成常規(guī)的“苗木截根”，苗木截根的具體方式為用尖刀將毛白楊的主根系頂端3cm長(zhǎng)的根段切除，隨后將根系浸泡在孢子或菌絲懸浮液中；其余等同于實(shí)施例3。所得結(jié)果如表4所述。

表3、苗木根系超聲波處理參數(shù)

表4、鹽脅迫下不同根系處理方法彎孢霉對(duì)苗木(毛白楊)生長(zhǎng)的影響

備注說(shuō)明：上述表4中，對(duì)照組苗木生物量(鮮重，單位g)為1.93±0.20。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。