本發(fā)明屬于畜禽冷凍精液制作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山羊細(xì)管凍精制作方法。

背景技術(shù)：

山羊精液冷凍保存是人工授精技術(shù)的一個(gè)重大突破，不僅從時(shí)間和空間拓展了種公羊精液利用效率，充分發(fā)揮優(yōu)良種公羊的繁殖性能，而且對(duì)于優(yōu)良種畜禽或特色種畜禽的保種和引種、降低生產(chǎn)成本等方面亦有重要的意義。我國(guó)對(duì)山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過(guò)多年實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)實(shí)踐探索，山羊顆粒凍精和細(xì)管凍精制作都已獲得了關(guān)鍵性的技術(shù)突破，而且一些地區(qū)已經(jīng)建立了羊冷凍精液生產(chǎn)操作規(guī)程。由于山羊顆粒冷凍精液沒(méi)有包裝，長(zhǎng)期保存表皮很容易脫落，解凍過(guò)程都容易污染，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中逐漸被細(xì)管冷凍精液所取代。山羊細(xì)管冷凍精液無(wú)論是制作還是解凍輸精過(guò)程都能很好的規(guī)避污染，凍后精液品質(zhì)和使用效果也都優(yōu)于顆粒凍精。如cn103518706a、cn104705290a分別公開(kāi)了綿羊和奶山羊的細(xì)管凍精制作方法。但細(xì)管冷凍精液制作是仍然一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅需要適宜的稀釋劑、保護(hù)劑、平衡溫度和平衡時(shí)間、降溫速率及解凍速率，而且還需要程序降溫儀、灌裝封口等設(shè)備。如能研發(fā)一種操作簡(jiǎn)便快捷山羊細(xì)管凍精制作方法，將極大限度的促進(jìn)山羊冷凍精液的應(yīng)用和推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種山羊細(xì)管凍精制作方法，所述的細(xì)管凍精制作方法操作簡(jiǎn)便快捷、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種山羊細(xì)管凍精制作方法，該方法具體操作步驟如下：

(1)冷凍稀釋液的準(zhǔn)備：無(wú)菌條件下，將冷凍精液稀釋液預(yù)溫于34-36℃水浴中；

(2)采精和鏡檢：采用電刺激法或假陰道法采集山羊精液，對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)：鮮精活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于10⁸個(gè)/ml；

(3)稀釋?zhuān)喊凑丈窖蛏渚颗c冷凍稀釋液1:1的比例將步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液緩慢倒入步驟(2)檢測(cè)合格的鮮精中，進(jìn)行第一次稀釋?zhuān)u晃均勻，避光放于室溫環(huán)境靜置30-60min，再用步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液進(jìn)行第二次稀釋?zhuān)♂尫椒ㄍ埃搭A(yù)溫的冷凍稀釋液緩慢倒入精液中，并搖晃均勻，稀釋比例通常1:(5至8)，精液稀釋最終密度不低于10⁶個(gè)/ml；

(4)分裝：將步驟(3)稀釋后的精液分多段吸入細(xì)管進(jìn)行精液分裝，即先吸入部分稀釋精液后吸取部分空氣再吸取部分稀釋精液；

(5)平衡：經(jīng)步驟(4)分裝好的細(xì)管精液，平放用6-8層的無(wú)菌紗布包裹，置于2-5℃冰箱中避光平衡2-2.5h；

(6)冷凍：在泡沫箱中加注液氮，并將步驟(5)平衡后的細(xì)管精液平鋪于冷凍架上，液氮面與細(xì)管精液保持2.5-3cm的距離，熏蒸冷凍至少8min，冷凍結(jié)束后將細(xì)管精液快速移入液氮中；

(7)解凍和復(fù)檢：將步驟(6)的細(xì)管凍精從液氮中撈出，快速投入36-37℃的恒溫水浴中解凍15-20s，將細(xì)管中精液充分混勻后對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查，解凍后活力不低于35％、活率不低于50％、密度不低于10⁶個(gè)/ml可用于人工授精或長(zhǎng)期冷凍保存。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)對(duì)鏡檢合格的鮮精采用2次稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)谝淮蜗♂屖前凑丈渚颗c稀釋液等體積1:1稀釋?zhuān)诙蜗♂屖歉鶕?jù)精子密度進(jìn)行定量稀釋?zhuān)覂纱蜗♂尫椒ㄊ嵌紝⑾♂屢壕徛谷刖翰⒒旌暇鶆颉?/p>

進(jìn)一步的，分裝完成后用封口粉標(biāo)記。

進(jìn)一步的，所述步驟(6)細(xì)管精液位于液氮面上方2.5-3cm處進(jìn)行熏蒸冷凍，冷凍時(shí)間8min-10min，通過(guò)超低溫溫度計(jì)測(cè)定熏蒸1min時(shí)細(xì)管精液溫度降至-60℃以下，熏蒸2min時(shí)細(xì)管精液溫度可降至-80℃以下，熏蒸4min時(shí)細(xì)管精液溫度可降至-96℃以下，熏蒸8min時(shí)細(xì)管精液溫度-130℃以下。

采用上述技術(shù)方案后，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的山羊細(xì)管凍精制作方法操作簡(jiǎn)便快捷、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備，在鮮精品質(zhì)滿足要求的情況下，經(jīng)冷凍解凍的細(xì)管凍精活率不低于0.35，不僅能滿足人工授精對(duì)凍精的活率要求，還能充分提高公羊的利用率，突破動(dòng)物壽命的限制，實(shí)現(xiàn)公羊精液的長(zhǎng)期保存，極大限度的促進(jìn)山羊冷凍精液的應(yīng)用和推廣。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明實(shí)施方式不局限于此。

實(shí)施例1

一種山羊細(xì)管凍精制作方法，包括有冷凍稀釋液的準(zhǔn)備、采精和鏡檢、精液稀釋、精液分裝和平衡、精液冷凍、解凍和復(fù)檢。具體操作步驟如下：

(1)冷凍稀釋液的準(zhǔn)備：無(wú)菌條件下，將購(gòu)買(mǎi)的卡蘇ovixcell羊用精液稀釋液(貨號(hào)：020997)無(wú)菌條件分裝至50ml離心管并預(yù)溫于34℃水浴中；

(2)采精和鏡檢：采用電刺激法采集5只海南黑山羊種公羊精液，對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查，選擇活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于10⁸個(gè)/ml鮮精用于后續(xù)凍精制作；

(3)稀釋?zhuān)喊凑丈窖蛏渚颗c冷凍稀釋液1:1的比例將步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液緩慢倒入步驟(2)檢測(cè)合格的鮮精中，進(jìn)行第一次稀釋?zhuān)u晃均勻，避光放于室溫環(huán)境(17℃)靜置1h，再用步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液進(jìn)行第二次稀釋?zhuān)合♂屪罱K密度不低于10⁶個(gè)/ml；

(4)分裝：將步驟(3)稀釋后的精液分多段吸入細(xì)管進(jìn)行精液分裝，即先吸入部分稀釋精液后吸取部分空氣再吸取部分稀釋精液，空氣間隔有利于緩沖冷凍后體積膨脹壓力和快速解凍后的混合均勻，分裝完成后末端蘸取少量封口粉封口并作標(biāo)記；

(5)平衡：經(jīng)步驟(4)分裝好的細(xì)管精液，平放(勿堆疊)用6-8層的無(wú)菌紗布包裹，置于4℃冰箱中避光平衡2.5h；

(6)冷凍：在泡沫箱中加注液氮，并將步驟(5)平衡后的細(xì)管精液平鋪于冷凍架上，液氮面與細(xì)管精液保持2.5-3cm的距離，熏蒸冷凍8min，冷凍結(jié)束后將細(xì)管精液快速移入液氮中；

(7)解凍和復(fù)檢：將步驟(6)的細(xì)管凍精從液氮中撈出，快速投入37℃的恒溫水浴中解凍15s，將細(xì)管中精液充分混勻后對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查。

實(shí)施例2

一種山羊細(xì)管凍精制作方法，包括有冷凍稀釋液的準(zhǔn)備、采精和鏡檢、精液稀釋、精液分裝和平衡、精液冷凍、解凍和復(fù)檢。具體操作步驟如下：

(1)冷凍稀釋液的準(zhǔn)備：無(wú)菌條件下，按照下述方法配制冷凍稀釋液，準(zhǔn)確稱(chēng)取tris3.07g、果糖1.26g、檸檬酸1.64g、青霉素100000iu、鏈霉素0.1g、甘油5ml、磷脂酰膽堿1.6g和膽固醇0.4g加入85ml雙蒸水中，調(diào)節(jié)ph6.8-7.0，加入雙蒸水定容至100ml，經(jīng)0.22μm孔徑的無(wú)菌濾器過(guò)濾，無(wú)菌條件分裝至50ml離心管并預(yù)溫于34℃水浴中；

(2)采精和鏡檢：采用電刺激法采集5只海南黑山羊種公羊精液，對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查，選擇活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于10⁸個(gè)/ml鮮精用于后續(xù)凍精制作；

(3)稀釋?zhuān)喊凑丈窖蛏渚颗c冷凍稀釋液1:1的比例將步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液緩慢倒入步驟(2)檢測(cè)合格的鮮精中，進(jìn)行第一次稀釋?zhuān)u晃均勻，避光放于室溫環(huán)境(17℃)靜置1h，再用步驟(1)預(yù)溫的冷凍稀釋液進(jìn)行第二次稀釋?zhuān)合♂屪罱K密度不低于10⁶個(gè)/ml；

(4)分裝：將步驟(3)稀釋后的精液分多段吸入細(xì)管進(jìn)行精液分裝，即先吸入部分稀釋精液后吸取部分空氣再吸取部分稀釋精液，空氣間隔有利于緩沖冷凍后體積膨脹壓力和快速解凍后的混合均勻，分裝完成后末端蘸取少量封口粉封口并作標(biāo)記；

(5)平衡：經(jīng)步驟(4)分裝好的細(xì)管精液，平放(勿堆疊)用6-8層的無(wú)菌紗布包裹，置于4℃冰箱中避光平衡2.5h；

(6)冷凍：在泡沫箱中加注液氮，并將步驟(5)平衡后的細(xì)管精液平鋪于冷凍架上，液氮面與細(xì)管精液保持2.5-3cm的距離，熏蒸冷凍8min，冷凍結(jié)束后將細(xì)管精液快速移入液氮中；

(7)解凍和復(fù)檢：將步驟(6)的細(xì)管凍精從液氮中撈出，快速投入37℃的恒溫水浴中解凍15s，將細(xì)管中精液充分混勻后對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)檢查。

檢測(cè)步驟如下：

(1)活力的測(cè)定：

分別取稀釋后的鮮精、平衡后精液和解凍后的細(xì)管凍精5ul滴于37℃預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，10×20倍顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)；每份精子活力在5個(gè)不同視野中進(jìn)行評(píng)估，5個(gè)連續(xù)評(píng)估值的平均值作為最后的精子活力值，計(jì)算公式如下：

精子活力＝(直線前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/精子總數(shù))×100％。

(2)頂體完整率的測(cè)定：

取解凍后的精液50μl制作精子涂片，自然風(fēng)干，水平擺放于染色架上，用4％的多聚甲醛固定15min→蒸餾水洗5次×3min/次→晾干→滴加吉姆薩染色液2ml/片染色90min后→水洗蒸餾水洗5次×5min/次→晾干→10×100倍顯微鏡鏡檢，精子頂體呈紫色，且包圍精子頭前部的為頂體完整的精子，計(jì)算公式如下：

頂體完整率＝(體完整的精子數(shù)/精子總數(shù))×100％；

實(shí)施例1和2凍前凍后精子活力和頂體完整率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1本發(fā)明所述細(xì)管凍精制作效果分析

由表1可知，無(wú)論是采用購(gòu)置的羊用商品冷凍稀釋液或自行配制冷凍稀釋液，通過(guò)本發(fā)明所述的細(xì)管凍精制作方法，解凍后精子活力均達(dá)到35％以上，可用于人工授精。

實(shí)施例涉及的主要試劑和耗材：法國(guó)卡蘇公司ovixcell羊用精液稀釋液(貨號(hào)：020997)，法國(guó)卡蘇公司0.25ml細(xì)管，超低溫溫度計(jì)，生物顯微鏡，恒溫水浴鍋，泡沫箱，液氮等。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。