本發(fā)明屬于人精子保存
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種不含卵黃的人精子冷凍保護液及保存方法。
背景技術(shù)：
：精液冷凍技術(shù)是人類精子庫保存精子，得以保持其生命力和受精能力的一項技術(shù)。冷凍技術(shù)中向精液樣本中添加的冷凍保護劑是使精子在降溫和低溫儲存過程中免受冷凍損傷的關(guān)鍵性物質(zhì)。目前使用的冷凍保護劑中卵黃是主要的成分之一。但是，卵黃來源于雞蛋，具備有生物源性。卵黃由卵黃顆粒、磷脂和蛋白等生物活性物質(zhì)組成，難以通過過濾、高溫或其它方法達到完全的除菌或滅菌。其中的蛋白質(zhì)對于人體而言是一種異種蛋白，可能在使用中進入人體引起過敏性反應(yīng)。再者溶液中混有卵黃顆粒增加了顯微鏡觀察精子時背景存在雜質(zhì)干擾，且不易去除。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種不含卵黃的人精子冷凍保護液及保存方法，可有效解決現(xiàn)有的冷凍保護劑會引起不良反應(yīng)，無法達到完全滅菌以及增加觀察的干擾等問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀5～6mmol/l、硫酸鎂0.2～0.5mmol/l、氯化鈣2～4mmol/l、磷酸二氫鈉0.2～0.5mmol/l、碳酸氫鈉28～35mmol/l、甘氨酸110～150mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸18～25mmol/l、葡萄糖5～8mmol/l、蔗糖30～60mmol/l、乳酸鈉12～15mmol/l、甘油50～100ml/l，余量為超純水。進一步地，一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀5.365mmol/l、硫酸鎂0.49mmol/l、氯化鈣2.72mmol/l、磷酸二氫鈉0.31mmol/l、碳酸氫鈉30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸鈉12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量為超純水。人精子冷凍保存方法，包括以下步驟：(1)將上述精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10～15min，然后按照分段降溫方式靜置15～20min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。進一步地，步驟(1)中精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3。進一步地，步驟(2)中，在室溫下平衡10min。進一步地，步驟(2)中分段降溫方式為在-20℃靜置5min，接著在-125～-130℃靜置10min，使之盡快通過液體的冰晶形成期，進而不會對精子造成傷害。本發(fā)明提供的一種不含卵黃的人精子冷凍保護液及保存方法，具有以下有益效果：(1)本發(fā)明通過特定的物質(zhì)組合成精子冷凍保護液，全為可溶性成分，易過濾除菌；不含異種或同種異體蛋白致敏原，也不會引起過敏反應(yīng)；復(fù)蘇后鏡檢，背景清晰，無雜質(zhì)，不會出現(xiàn)干擾情況；復(fù)蘇后容易通過稀釋或離心去除保護液溶質(zhì)。(2)本發(fā)明產(chǎn)品ph為7.2～7.4，其中，磷酸二氫鈉、乳酸鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸和4-羥乙基哌嗪乙磺酸提供強大的酸堿緩沖作用，能夠為精子運動提供最適ph范圍；此外，甘氨酸的抗氧化作用為精子提供保護作用，葡萄糖和甘氨酸結(jié)合，其抗氧化作用加強；葡萄糖、甘氨酸和甘油作為滲透性物質(zhì)進入到精子細胞內(nèi)增加細胞內(nèi)液的晶體滲透壓，而分子量大的蔗糖作為非滲透性物質(zhì)可以增加細胞外液的滲透壓同時外吸細胞內(nèi)水分，可以有效的減少精子凍結(jié)時的冰晶形成和損傷；葡萄糖還為精子提供其營養(yǎng)物質(zhì)；氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鈣為精子的生存提供必須的無機鹽離子。(3)本發(fā)明制備的精子冷凍保護液，能明顯增加精子的活動能力，并且對精子生理功能無明顯的影響，冷凍復(fù)蘇率高，復(fù)蘇后的精液在國家法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用，其臨床妊娠率高于20％。具體實施方式實施例1一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉90mmol/l、氯化鉀5mmol/l、硫酸鎂0.2mmol/l、氯化鈣2mmol/l、磷酸二氫鈉0.2mmol/l、碳酸氫鈉28mmol/l、甘氨酸110mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸18mmol/l、葡萄糖5mmol/l、蔗糖30mmol/l、乳酸鈉12mmol/l、甘油50ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護液的制備過程：用分析天平準確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，同時要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達到衛(wèi)生部精液參數(shù)標準前提下，當精液中精子濃度大于等于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1混勻；當精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:2混勻；當精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實施例2一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉110mmol/l、氯化鉀6mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣4mmol/l、磷酸二氫鈉0.5mmol/l、碳酸氫鈉35mmol/l、甘氨酸150mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸25mmol/l、葡萄糖8mmol/l、蔗糖60mmol/l、乳酸鈉15mmol/l、甘油100ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護液的制備過程：用分析天平準確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，同時要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達到衛(wèi)生部精液參數(shù)標準前提下，當精液中精子濃度大于等于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1混勻；當精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:2混勻；當精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實施例3一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉95mmol/l、氯化鉀5.2mmol/l、硫酸鎂0.3mmol/l、氯化鈣2.5mmol/l、磷酸二氫鈉0.3mmol/l、碳酸氫鈉30mmol/l、甘氨酸120mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖6mmol/l、蔗糖40mmol/l、乳酸鈉13mmol/l、甘油60ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護液的制備過程：用分析天平準確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，同時要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達到衛(wèi)生部精液參數(shù)標準前提下，當精液中精子濃度大于等于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1混勻；當精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:2混勻；當精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實施例4一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉105mmol/l、氯化鉀5.5mmol/l、硫酸鎂0.4mmol/l、氯化鈣3.2mmol/l、磷酸二氫鈉0.4mmol/l、碳酸氫鈉32mmol/l、甘氨酸140mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸23mmol/l、葡萄糖7mmol/l、蔗糖55mmol/l、乳酸鈉14mmol/l、甘油90ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護液的制備過程：用分析天平準確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，同時要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達到衛(wèi)生部精液參數(shù)標準前提下，當精液中精子濃度大于等于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1混勻；當精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:2混勻；當精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實施例5一種不含卵黃的人精子冷凍保護液，包括以下組分且在保存人精子時各組分的終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀5.365mmol/l、硫酸鎂0.49mmol/l、氯化鈣2.72mmol/l、磷酸二氫鈉0.31mmol/l、碳酸氫鈉30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸鈉12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量為超純水。上述不含卵黃的人精子冷凍保護液的制備過程：用分析天平準確稱取各組分即氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸鈉和甘油，然后將各組分溶于超純水中，制成各組分的母液，其母液濃度的配制主要是根據(jù)所要保存的人精子濃度情況而定，然后將各組分混合，用磁力攪拌器充分攪拌均勻，同時要保證溶液ph值為7.4，最后采用孔徑為0.22μm的過濾器過濾除菌，無菌保存。采用上述冷凍保護液保存人精子的方法，包括以下步驟：(1)將精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1～3混勻，精子冷凍保護液和精液的體積比取決于精液樣品中精子濃度，在精液樣品達到衛(wèi)生部精液參數(shù)標準前提下，當精液中精子濃度大于等于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:1混勻；當精液中精子濃度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:2混勻；當精液中精子濃度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml時，精子冷凍保護液和精液按體積比為1:3混勻；(2)將步驟(1)所得混合物在室溫下平衡10min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min；(3)將步驟(2)所得物轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中保存。實驗例1生物毒性實驗選用健康男性精液作為樣品，用本品(試驗組)及市售含卵黃的精子冷凍保護液(對照組)在相同條件下稀釋(此處的稀釋為精液和冷凍保護液混合)，稀釋后0min、60min、120min、180min以及240min，分別觀察比較其前向運動精子百分比(平均值)，結(jié)果見表1：表1不同時間點前向運動精子百分比(％)0小時1小時2小時3小時4小時對照組63.862.353.849.345.1試驗組64.763.558.756.550.7實驗例2復(fù)蘇實驗檢測方法：選取健康男性精液作為樣品，按照精子冷凍保護液(本發(fā)明實施例5制備的產(chǎn)品)和精液的比例關(guān)系將精子冷凍保護液和精液充分混勻，以市售的含卵黃的冷凍保護液作為對比例?；靹蚝笤谑覝叵缕胶?0min，然后在-20℃靜置5min，接著在-125℃靜置10min，再直接投于-196℃液氮中，當混合液溫度穩(wěn)定后，從液氮中取出冷凍精液，在37℃水浴搖床中解凍。解凍后，顯微鏡下觀察比較前向運動精子百分比，計算其冷凍復(fù)蘇率。冷凍復(fù)蘇率＝凍后前向運動的精子數(shù)量/凍前前向運動的精子數(shù)量×100％。實驗例和對比例分別設(shè)置10個平行，平均冷凍復(fù)蘇率分別為71.24％和62.1％。本發(fā)明所采用的精子冷凍保護液不含卵黃，不存在致病菌感染的風(fēng)險，且配方合理科學(xué)，所得到的冷凍效果與現(xiàn)有含卵黃的冷凍保護液相比，其精子冷凍復(fù)蘇率高。通過觀察其精子形態(tài)、頂體完整性等，其形態(tài)完整率和頂體完整率明顯比現(xiàn)有的冷凍保護液保護的精子完整率高，說明本發(fā)明精子冷凍保護液對精子不會產(chǎn)生破壞。采用本發(fā)明精子冷凍保護液冷凍保存的精子在國家法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用后，臨床妊娠率高于20％，說明本發(fā)明精子冷凍保護液不會對精子生理功能產(chǎn)生明顯影響。當前第1頁12