技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于貯存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)期貯存昆蟲病原線蟲的方法。
背景技術(shù)：
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昆蟲病原線蟲是國(guó)際上新型的生物殺蟲劑，具有易于大量生產(chǎn)，宿主范圍廣，致死昆蟲速度快的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于地下害蟲的生物防治(georgis&manweiler,1994；shapiro-ilanetal.,2002；grewaletal.,2005；georgisetal.,2006；yanetal.,2012；shapiro-ilanetal.,2016)。廣東省生物資源應(yīng)用研究所(原廣東省昆蟲研究所)在華南高爾夫球場(chǎng)分離一種昆蟲病原線蟲——steinernemalongicaudumx-7品系對(duì)多種蠐螬，如華北暗黑鰓金龜(holotrichiaparallelamotschulsky)、華北大黑鰓金龜(holotrichiaoblitafaldermann)幼蟲等田間防治效果可達(dá)90％以上(guoetal.,2013,2015,2016)，應(yīng)用前景廣闊。在昆蟲病原線蟲的商品化過(guò)程中，延長(zhǎng)線蟲有效貨架時(shí)間，以便于長(zhǎng)距離運(yùn)輸和最佳時(shí)間的田間應(yīng)用，是線蟲產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)s.longicaudumx-7線蟲的貨架貯存做了一系列參數(shù)研究，最終得到一種s.longicaudumx-7線蟲的長(zhǎng)期貯存方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種貯存期長(zhǎng)、存活率高的長(zhǎng)期貯存昆蟲病原線蟲的方法。
本發(fā)明的長(zhǎng)期貯存昆蟲病原線蟲的方法，包括以下步驟：將線蟲泥與腐殖土按照質(zhì)量比1:0.8～1.2混合均勻得到混合物，然后將混合物裝入容器中，用透氣封口膜封口后進(jìn)行貯存；所述的線蟲泥由昆蟲病原線蟲感染期線蟲和水組成。
所述的線蟲泥中線蟲密度優(yōu)選為60萬(wàn)條/g。
所述的昆蟲病原線蟲優(yōu)選為steinernemalongicaudumx-7。
所述的用透氣封口膜封口后進(jìn)行貯存，其貯存溫度優(yōu)選為5℃～25℃。所述的貯存溫度進(jìn)一步優(yōu)選為5℃～15℃。
所述的腐殖土的粒徑優(yōu)選為24目。
優(yōu)選，所述的透氣封口膜包括pp膜和設(shè)置在pp膜中部的透氣膜。
本發(fā)明的方法具有原料易得、容易操作、成本低、占用空間小、貯存時(shí)間長(zhǎng)、存活率高等的優(yōu)點(diǎn)。s.longicaudumx-7線蟲與腐殖土按1:0.8～1:1.2混配后于5℃穩(wěn)定貯存長(zhǎng)達(dá)180d，存活率仍大于90％。貯存的昆蟲病原線蟲可以直接撒施到田間用于防治田間害蟲，同時(shí)也可以作為肥料提高田地肥力。
附圖說(shuō)明：
圖1是昆蟲病原線蟲steinernemalongicaudumx-7分別與硅藻土、蛭石、腐殖土按照質(zhì)量比1:1或與碎海綿按照質(zhì)量比3:1混配在5℃、15℃、25℃條件下的貯存效果；其中，*表明同一取樣時(shí)間不同處理線蟲存活率之間顯著差異(p<0.05，tukey’stest)。
具體實(shí)施方式：
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：
一、實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.s.longicaudumx-7線蟲的培養(yǎng)：s.longicaudumx-7線蟲感染期線蟲(ijs，infectivejuveniles)，按照韓日疇(1996)的固體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。收獲感染期線蟲將線蟲裝于紗網(wǎng)袋中置于洗衣機(jī)中按照常規(guī)程序清洗，收集洗衣機(jī)排水液于沉降槽(2.0m×1.0m×0.5m)中，加水清洗3次后收集線蟲沉淀于棉布袋中收集線蟲泥。
2.線蟲泥密度統(tǒng)計(jì)：取線蟲泥0.1g分別溶于1000ml水中，用玻璃棒攪拌均勻，取1ml于計(jì)數(shù)板中。每種線蟲泥與每一線蟲懸浮液中均重復(fù)取樣3個(gè)，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算收獲的線蟲泥中的線蟲密度為60萬(wàn)條/g。
3.線蟲與不同載體按比例配制劑型：將線蟲泥與硅藻土(150目)分別按照質(zhì)量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲硅藻土劑型。將線蟲泥與蛭石(200目)分別按照質(zhì)量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲蛭石劑型。將線蟲泥與腐殖土(24目)分別按照質(zhì)量比1:0.8、1:1、1:1.2混合均勻，得到線蟲腐殖土劑型。將線蟲泥與碎海綿(d＝1cm)按照質(zhì)量比3:1混合均勻，得到線蟲碎海綿劑型。
4.線蟲劑型分裝：將混合均勻后的線蟲劑型按照40g/瓶(硅藻土與蛭石劑型)、23g/瓶(腐殖土劑型)、13g/瓶(碎海綿劑型)裝入塑料杯(pp材質(zhì)，200ml，上口徑為4.5cm，底部直徑為7cm，高度為7.5cm)中，所有劑型在塑料杯中的高度均為5.5±0.5cm。將塑料杯用透氣封口膜(透氣封口膜包括pp膜和設(shè)置在pp膜中間的一透氣膜，透氣膜的直徑為1cm，透氣膜的膜孔徑為5μm)進(jìn)行熱封。
5.線蟲劑型的貯存溫度設(shè)置：將各種載體不同比例的劑型處理分別置于5℃、15℃、25℃貯存室中進(jìn)行貯存，每一處理為30個(gè)重復(fù)(30個(gè)塑料杯)。
6.線蟲貯存效果測(cè)定：每隔一定時(shí)間即0、20、40、60、80、100、120、140、160、180天時(shí)取樣檢測(cè)線蟲的存活率，每次每個(gè)處理取樣3個(gè)重復(fù)，每一重復(fù)取3個(gè)樣品計(jì)數(shù)。取樣方法為：將每個(gè)處理每一杯子內(nèi)所有線蟲全部溶于水中，攪拌均勻后取樣10ml于滅菌培養(yǎng)皿中，置于25℃條件下恢復(fù)24h后計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)線蟲的存活數(shù)量及死亡數(shù)量，計(jì)算線蟲的存活率。
7.數(shù)據(jù)分析：線蟲死亡率的百分?jǐn)?shù)值均經(jīng)反正弦arcsin(x1/2)轉(zhuǎn)換后，以spss軟件(版本為spss16.0forwindows)進(jìn)行方差分析，多重比較采用tukey檢驗(yàn)各處理之間的差異顯著性，顯著水平p<0.05(spss16.0，spssinc.，chicago，il，usa)。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
線蟲與同一載體三種混配比例1:0.8、1:1、1:1.2在同一溫度下的線蟲存活率之間無(wú)顯著影響(f≤4.650；df＝2,6；p≥0.06)。線蟲與各載體按照質(zhì)量比1:1以及線蟲與碎海綿混配在5℃、15℃、25℃下的貯存效果詳見(jiàn)圖1。在同一溫度下，各線蟲硅藻土劑型的存活率顯著低于蛭石劑型和腐殖土劑型(f≥10.368；df＝3，8；p≤0.004)。s.longicaudumx-7在5℃、15℃、25℃與蛭石、腐殖土或碎海綿混配對(duì)線蟲的貯存無(wú)顯著差異。s.longicaudumx-7線蟲在5℃180天、15℃80天、25℃20天時(shí)線蟲的存活率仍大于90％。
因此，s.longicaudumx-7線蟲可與蛭石、腐殖土按質(zhì)量比1:0.8～1.2混配或與碎海綿按照質(zhì)量比3:1混配后于5℃穩(wěn)定貯存長(zhǎng)達(dá)180d，存活率仍大于90％。
但是由于海綿比較難操作，而腐殖土可以作為肥料使用，因此將線蟲與腐殖土混合，即可以很好的貯存好線蟲，又可以作為肥料使用，一舉兩得，且腐殖土價(jià)格便宜，比蛭石價(jià)格便宜一半，因此最優(yōu)劑型還是腐殖土劑型的。