本發(fā)明屬于微生物農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及川圓芝1號靈芝新菌株及其繁殖方法。
背景技術(shù)：
：靈芝是我國傳統(tǒng)名貴的藥用真菌，素有“仙草”、“瑞草”的美名，具有多種生理活性和藥理作用，能有效增強人體免疫能力，抑制腫瘤發(fā)生。我國人工栽培靈芝已有多年的歷史，目前市場銷售的靈芝產(chǎn)品有野生靈芝和人工栽培靈芝，其中人工栽培靈芝占主要部分。市場調(diào)查顯示，目前市場上靈芝貨源豐富，價格不高。靈芝優(yōu)等品要求菌蓋直徑10cm以上、厚度≧1cm，單個不連朵、菌蓋近圓形、美觀?？蛻魧Ξa(chǎn)品要求嚴(yán)格，優(yōu)等品能賣35-45元/公斤，而菌蓋小、畸形的靈芝每公斤售價僅為十多元。因此，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)靈芝新菌株和品種選育能夠進(jìn)一步提升靈芝的栽培效益。基于以上分析，優(yōu)質(zhì)的農(nóng)藝性狀，高含量的功效成分的新品種能有效拓寬靈芝人工栽培效益，促進(jìn)靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)靈芝新菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種靈芝新菌株ganodermalucidum川圓芝1號。該菌株的保藏號為cgmccno.13174。保藏時間為2016年10月21日，保藏地點為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。具體的，所述靈芝菌株的its序列具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述靈芝菌株的繁殖方法，具體如下：川圓芝1號的菌種擴繁生產(chǎn)需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，母種生產(chǎn)用pda培養(yǎng)基培養(yǎng)，原種和栽培種生產(chǎn)采用以棉籽殼、木屑為主料，麥麩為輔料組成的培養(yǎng)基；培養(yǎng)及栽培條件：菌絲生長溫度15℃～38℃，出芝溫度20℃～35℃。優(yōu)選的，菌絲生長溫度24℃～26℃。優(yōu)選的，出芝溫度為26℃～28℃。本發(fā)明還提供了上述的靈芝菌株在制備藥品或者保健食品中的用途。本發(fā)明的優(yōu)質(zhì)靈芝新菌株川圓芝1號具有以下優(yōu)點：(1)遺傳性狀穩(wěn)定，適應(yīng)性廣，產(chǎn)量高。(2)芝形近圓形，外觀均一度高，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。(3)適應(yīng)性強，可適宜于廣泛的大面積推廣種植。(4)功效成分含量高，氨基酸含量為干重的4.217％，蛋白質(zhì)含量為干重的13.5％，多糖含量1.27％，三萜含量0.87％，是保健品、藥品等生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原材料，具有十分可觀的經(jīng)濟效益。本發(fā)明提供的新菌株鑒定為多孔菌科靈芝屬赤芝種(ganodermalucidum)，命名為川圓芝1號。該菌株保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏號：cgmccno.13174，其生物學(xué)分類命名為：ganodermalucidum。附圖說明圖1、川圓芝1號菌絲形態(tài)(左)、孢子形態(tài)(中)及子實體形態(tài)(右)。圖2、基于its序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3、32個靈芝菌株p2引物電泳圖。圖4、32個靈芝菌株issr聚類圖譜。圖5、川圓芝1號與川芝6號拮抗試驗圖。圖6、川圓芝1號(成都大邑段木生產(chǎn)圖)。具體實施方式本發(fā)明的靈芝菌株為發(fā)明人從福建省尤溪縣研究選育的的菌株，經(jīng)進(jìn)一步系統(tǒng)選育而成的新品系，經(jīng)鑒定為多孔菌科靈芝屬赤芝種(ganodermalucidum)，命名為川圓芝1號。該菌株保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：cgmccno.13174，其生物學(xué)分類命名為：ganodermalucidum。該菌株的形態(tài)特征如下：1、形態(tài)特征菌絲：川圓芝1號菌絲白色、粗壯，在斜面上有時有轉(zhuǎn)色現(xiàn)象；子實體成熟后木質(zhì)化，菌蓋土黃色(孢子粉色澤)，“川圓芝1號”孢子為褐色、卵圓形；菌絲濃白、粗壯；子實體腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm；菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。2、生物學(xué)特性營養(yǎng)成分來源：川圓芝1號品種可pda培養(yǎng)基保存，適宜在4℃冰箱低溫冷藏保存，每3個月轉(zhuǎn)接1次。川圓芝1號的菌種擴繁生產(chǎn)需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，母種生產(chǎn)適宜用pda培養(yǎng)基培養(yǎng)；原種和栽培種生產(chǎn)適宜用以棉籽殼、木屑為主料，麥麩為輔料組成的培養(yǎng)基。培養(yǎng)及栽培條件：菌絲生長溫度15℃～38℃，最適24℃～26℃；出芝溫度20℃～35℃，最適26℃～28℃。實施例1菌株的篩選與鑒定(1)親本的來源：為了豐富四川省靈芝種質(zhì)資源，選育出優(yōu)良的靈芝品種，解決生產(chǎn)上的用種問題，2013年發(fā)明人從福建省引育了靈芝菌株，通過獲得的菌株多次分離純化進(jìn)行系統(tǒng)栽培選育研究。(2)初篩：將獲得的菌株進(jìn)行小規(guī)模栽培，了解菌株的子實體形態(tài)。篩選農(nóng)藝性狀較好(子實體近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm；菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤)的菌株進(jìn)行復(fù)篩。(3)復(fù)篩：擴大栽培規(guī)模，了解初篩的菌株產(chǎn)量、抗雜性和穩(wěn)定性等。表132個靈芝菌株產(chǎn)量及多糖數(shù)據(jù)(表1的32個菌株是對應(yīng)表2的32個菌株。結(jié)合多糖含量高及農(nóng)藝性狀篩選出31號菌株)(4)菌株真實性鑒定：依據(jù)《ny/t1730-2009食用菌菌種真實性鑒定issr法》，一共32株菌株(表2)，進(jìn)行菌株(菌種)真實性鑒定，鑒定所用的引物見表3。表232個靈芝菌株編號編號菌株名稱菌株來源編號菌株名稱菌株來源1slz177攀枝花野生分離17slz194攀枝花野生分離2slz178攀枝花野生分離18slz195攀枝花野生分離3slz179攀枝花野生分離19slz196攀枝花野生分離4slz180攀枝花野生分離20slz197攀枝花野生分離5slz181攀枝花野生分離21slz198攀枝花野生分離6slz183攀枝花野生分離22slz199攀枝花野生分離7slz184攀枝花野生分離23slz200攀枝花野生分離8slz185攀枝花野生分離24slz201攀枝花野生分離9slz186攀枝花野生分離25slz202攀枝花野生分離10slz187攀枝花野生分離26slz203攀枝花野生分離11slz188攀枝花野生分離27slz204攀枝花野生分離12slz189攀枝花野生分離28slz205攀枝花野生分離13slz190攀枝花野生分離29zzmy綿陽梓潼14slz191攀枝花野生分離30pzno.1攀枝花野生分離15slz192攀枝花野生分離31cyzno.1川圓芝1號16slz193攀枝花野生分離32czno.6四川主栽川芝6號表310個引物序列編號引物名稱引物序列復(fù)性溫度1issr807agagagagagagagagt(seqidno.4)49℃2issr810gagagagagagagagat(seqidno.5)47℃3issr811gagagagagagagagac(seqidno.6)49℃4issr816cacacacacacacacat(seqidno.7)47℃5issr861accaccaccaccaccacc(seqidno.8)54℃6issr866ctcctcctcctcctcctc(seqidno.9)49℃7issr873gacagacagacagaca(seqidno.10)49℃8issr878ggatggatggatggat(seqidno.11)49℃9e45846acttccccacaggttaacaca(seqidno.12)54℃10e26637agagagagagagagagg(seqidno.13)54℃指紋圖譜(圖3)結(jié)果顯示，川圓芝1號與現(xiàn)有品種及其他對照菌株在分子生物學(xué)水平上均存在著差異性。用its序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2、圖4)鑒定出川圓芝1號為赤芝，且與現(xiàn)有品種及其他對照菌株在分子生物學(xué)水平上均存在一定的差異性。為了進(jìn)一步驗證菌種真實性，設(shè)置并完成了相關(guān)拮抗實驗。依據(jù)《ny/t1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)》，32株菌株，進(jìn)行菌株(菌種)區(qū)別性鑒定結(jié)果顯示，川圓芝1號與現(xiàn)有品種及其他野生靈芝菌株均存在著差異性，這就進(jìn)一步證實了川圓芝1號菌株區(qū)別于現(xiàn)有的靈芝菌株(圖5)。對鑒定的川圓芝1號進(jìn)行培養(yǎng)，其菌絲形態(tài)(圖1左)、孢子形態(tài)(圖1中)及子實體形態(tài)(圖1右)。經(jīng)觀察，形態(tài)如下：菌絲：濃白、粗壯，直徑4.0～6.0μm。孢子：褐色、卵圓形，直徑8～11.5μm。子實體腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。川圓芝1號經(jīng)特異性引物its1(seqidno.2)：tccgtaggtgaacctgcgg，its4(seqidno.3)：tcctccgcttattgatatgc的pcr擴增，通過構(gòu)建進(jìn)化樹，鑒定川圓芝1號為赤芝ganodermalucidum。seqidno.1川圓芝1號的its序列如下(seqidno.1)：ggctttcgaagctacgacgtggatgtagcaggccttccgaggcatgtgcacgccctgctcatccactctacacctgtgcacttactgtgggcttcagattgcgaggcacgctctttaccgggcttgcggagcatatctgtgcctgcgtttatcacaaactctataaagtaacagaatgtgtattgcgatgtaacacatctatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacctacaagcttttgtggtttgtaggcttggacttggaggcttgtcggccgttatcggtcggctcctcttaaatgcattagcttggttccttgcggatcggctctcggtgtgataatgtctacgccgtgaccgtgaagcgtttggcgagcttctaaccgtcttataagacagctttatgacctctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa。實施例2栽培區(qū)域?qū)Ρ仍囼灋槊鞔_新菌株“川圓芝1號”的栽培推廣價值，按照四川省農(nóng)作物品種審定委員會《食用菌品種審定標(biāo)準(zhǔn)》，連續(xù)二季(即2年)開展了川圓芝1號袋栽試驗的不公開區(qū)域試驗(以下簡稱區(qū)試)。供試參比品種：以目前四川省生產(chǎn)上大面積栽培的品種川芝6號，并作為川圓芝1號的對照。同批制作川圓芝1號和川芝6號的栽培種備用。栽培料配方：棉籽殼60％，木屑30％，玉米粉4％，麩皮5％，石膏1％。含水量65％，ph自然。供試栽培料干燥、不霉變。裝料筒袋：使用聚乙烯塑料袋塑料筒袋作為供試品種栽培料基質(zhì)的盛裝容器。筒袋規(guī)格(長度×折徑×厚度)為33cm×17cm×0.025cm。(1)第一年區(qū)域試驗用袋栽進(jìn)行區(qū)域試驗，每個品種栽培350袋，共設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)100袋，在室內(nèi)床架上進(jìn)行栽培出芝管理。結(jié)果表明(表4)：川圓芝1號平均每袋產(chǎn)鮮靈芝158.3g，較川芝6號增產(chǎn)10.1％。產(chǎn)品質(zhì)量高于國家藥典標(biāo)準(zhǔn)，川圓芝1號子實體菌蓋直徑10～25cm，蓋厚1.5～2.0cm，菌柄長2～4cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。表4川圓芝1號的區(qū)域試驗(金堂趙家鎮(zhèn))(2)第二年區(qū)域試驗用袋栽進(jìn)行區(qū)域試驗，每個品種栽培350袋，共設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)100袋，在室內(nèi)床架上栽培，按常規(guī)方法進(jìn)行管理。結(jié)果表明(表5)：川圓芝1號平均每袋產(chǎn)鮮靈芝157.7g，比川芝6號增產(chǎn)11.0％。川圓芝1號產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到同類品種標(biāo)準(zhǔn)。子實體呈腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。表5川圓芝1號的區(qū)域試驗(成都大邑)“川圓芝1號”品種子實體的成熟期、形態(tài)特征和產(chǎn)量等綜合農(nóng)藝性狀在同一地區(qū)相同栽培環(huán)境條件下表現(xiàn)較為一致；在不同地區(qū)(兩個區(qū)域點)表現(xiàn)出的總體效果較為一致。這表明，“川圓芝1號”的遺傳性狀穩(wěn)定并具有適應(yīng)性廣的特點。比對照增產(chǎn)幅度較大，豐產(chǎn)性好。具有在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的價值。實施例3段木生產(chǎn)試驗為探究“川圓芝1號”菌種用于段木生產(chǎn)的栽培情況，在四川金堂、大邑等地進(jìn)行了不公開段木生產(chǎn)試驗(圖6)，“川圓芝1號”抗性強于川芝6號，污染率為5％，低于對照川芝6號。“川圓芝1號”在金堂的產(chǎn)量為553kg/畝，較對照增產(chǎn)10.5％；“川圓芝1號”在大邑的產(chǎn)量為556kg/畝，較對照增產(chǎn)11.2％。子實體呈腎形至近圓形，直徑10～25cm，厚1.5～2.0cm，菌蓋平展，表面初期白黃色，成熟時赤褐色，具環(huán)狀棱紋和輻射狀皺紋，背面金黃至淡黃色，菌肉黃白色；菌柄深褐色，有光澤。試驗結(jié)果見表6。通過段木生產(chǎn)試驗可以看出：“川圓芝1號”在菌絲長勢，污染率上明顯優(yōu)于川芝6號，同時“川圓芝1號”具有更整齊的芝體，同時具有更高的產(chǎn)量。在農(nóng)藝性狀及栽培效益上都超過了川芝6號。表6川圓芝1號生產(chǎn)試驗實施例4品質(zhì)分析及藥用成分委托中國測試技術(shù)研究院對子實體成分含量測定的結(jié)果顯示川圓芝1號的氨基酸含量為干重的4.217％，蛋白質(zhì)含量為干重的13.5％，多糖含量1.27％，三萜含量0.87％。(《中國藥典》2015年版，多糖含量不得少于0.90％；三萜及甾醇以齊墩果酸，不得少于0.50％)。因此，川圓芝1號完全符合國家藥典的標(biāo)準(zhǔn)，且功效成分含量較高，具有較高的藥用價值。表7川圓芝1號的成分含量測定結(jié)果sequencelisting<110>四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所<120>川圓芝1號靈芝新菌株及其繁殖方法<130>a170156k<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>613<212>dna<213>ganodermalucidum<400>1ggctttcgaagctacgacgtggatgtagcaggccttccgaggcatgtgcacgccctgctc60atccactctacacctgtgcacttactgtgggcttcagattgcgaggcacgctctttaccg120ggcttgcggagcatatctgtgcctgcgtttatcacaaactctataaagtaacagaatgtg180tattgcgatgtaacacatctatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatc240gatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcg300aatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtca360tgaaatcttcaacctacaagcttttgtggtttgtaggcttggacttggaggcttgtcggc420cgttatcggtcggctcctcttaaatgcattagcttggttccttgcggatcggctctcggt480gtgataatgtctacgccgtgaccgtgaagcgtttggcgagcttctaaccgtcttataaga540cagctttatgacctctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatca600ataagcggaggaa613<210>2<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>引物its1<400>2tccgtaggtgaacctgcgg19<210>3<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>引物its4<400>3tcctccgcttattgatatgc20<210>4<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr807<400>4agagagagagagagagt17<210>5<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr810<400>5gagagagagagagagat17<210>6<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr811<400>6gagagagagagagagac17<210>7<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr816<400>7cacacacacacacacat17<210>8<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr861<400>8accaccaccaccaccacc18<210>9<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr866<400>9ctcctcctcctcctcctc18<210>10<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr873<400>10gacagacagacagaca16<210>11<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>引物issr878<400>11ggatggatggatggat16<210>12<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>引物e45846<400>12acttccccacaggttaacaca21<210>13<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>引物e26637<400>13agagagagagagagagg17當(dāng)前第1頁12