本發(fā)明屬于食品防腐劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素是一種全球范圍多數(shù)國家已批準(zhǔn)使用的高安全性食品防腐劑，中國已批準(zhǔn)使用多年，在各種食品體系中廣泛應(yīng)用。但乳酸鏈球菌素在液體中使用時易發(fā)生降解，使其殺菌效果下降較快，難以滿足液體食品兩周以上貨架期的防腐要求。同時，乳酸鏈球菌素的熱穩(wěn)定性也不夠高，食品的熱滅菌對其活性影響較大。為提高乳酸鏈球菌素應(yīng)用于液體食品及熱滅菌過程中的穩(wěn)定性，國內(nèi)外科技人員開展了大量的研究工作，研制了一系列乳酸鏈球菌素的微囊，明顯提高了其在液體食品及加熱過程中的穩(wěn)定性。但目前國內(nèi)外研制的乳酸鏈球菌素微囊均存在一個嚴(yán)重的缺陷，就是在用于液體食品的前三天，其釋放量較小，殺菌效果不足以防腐，雖然以后殺菌持續(xù)時間達(dá)15天以上，但前期防腐效果欠缺使食品品質(zhì)受影響，難以實(shí)際應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物，所述包合物提高了乳酸鏈球菌素應(yīng)用于液體食品及加熱過程中的穩(wěn)定性，達(dá)到在液體食品中兩周以上有效殺菌，可滿足液體食品冷鏈銷售貨架期的要求。同時，熱穩(wěn)定性提高，降低了食品熱滅菌時對防腐效果的影響。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
一種乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物，所述包合物由以下方法制得：將環(huán)糊精溶解于去離子水中，乳酸鏈球菌素粉末溶解于ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩種溶液混合，將混合液ph調(diào)至6.5~7.5，于50-70℃下，攪拌1-2小時，室溫下繼續(xù)攪拌1-2小時，攪拌完畢后噴霧干燥得到粉末狀包合物。
本發(fā)明同時提供了一種乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物的制備方法，將環(huán)糊精溶解于去離子水中，乳酸鏈球菌素粉末溶解于ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩種溶液混合，將混合液ph調(diào)至6.5~7.5，于50-70℃下，攪拌1-2小時，室溫下繼續(xù)攪拌1-2小時，攪拌完畢后噴霧干燥得到粉末狀包合物。
作為優(yōu)選，所述環(huán)糊精與去離子水的質(zhì)量比為1:5-10。
作為優(yōu)選，所述乳酸鏈球菌素粉末的加入量為33-100g/l鹽酸水溶液。
作為優(yōu)選，所述噴霧干燥的工藝參數(shù)為進(jìn)風(fēng)溫度100~120℃，霧化壓力0.1~0.2mpa，進(jìn)樣速度0.2~0.4l/h，進(jìn)風(fēng)量0.25~0.60m3/min。
雙縮脲法測乳酸鏈球菌素含量：
配制雙縮脲試劑：稱取6gnaoh加入燒杯，量取25ml去離子水加入燒杯中溶解naoh，稀釋至6g/l備用。稱取0.75克硫酸銅（cuso4·5h2o）溶于500ml的去離子水中，加入2.25g酒石酸鉀鈉（knac4h4o6·4h2o），并且加入ki1.5g，等到完全溶解后，邊攪拌邊加入6g/lnaoh溶液25ml，并用去離子水定容至250ml，放置于塑料瓶中密封保存。
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制濃度為30mg/ml的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)液并過濾，取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于試管中，再用去離子水補(bǔ)至1ml，加入4ml雙縮脲試劑混勻，且在靜置30min后，于540nm波長下測試其吸光度值，空白為不加乳酸鏈球菌素的溶液，以吸光度對乳酸鏈球菌素溶液濃度作圖得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。乳酸鏈球菌素溶液的濃度和吸光度的關(guān)系曲線顯示在5-30mg/ml濃度范圍內(nèi)，溶液的吸光度與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為a=0.0142c+0.0033；r2=0.9998(n=5)。
樣品檢測：吸取1ml的乳酸鏈球菌素樣品溶液放入試管中，加入4ml雙縮脲試劑，充分混合均勻，放置30min后在540nm處測其吸光度。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出溶液中乳酸鏈球菌素的含量。
包合率的計算：在包合攪拌完畢噴霧干燥前，取攪拌完畢的樣液10ml，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取離心管上層清液5ml，檢測上層清液中乳酸鏈球菌素的含量。
包合率=(w-v*c)/w*100%，w為包合時投入的乳酸鏈球菌素量，v為包合工藝噴霧干燥前的總體積，c為濾液中乳酸鏈球菌素的濃度。
乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物殺菌效果的檢測：試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大腸桿菌(escherichiacoli)，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)）在250ml錐形瓶中搖瓶培養(yǎng)，控制細(xì)胞數(shù)在4.5×106cfu/ml左右，作為殺菌試驗(yàn)菌液。
殺菌試驗(yàn)：取包合物溶于去離子水中，配制成乳酸鏈球菌素達(dá)10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml濃度的殺菌液，取0.2ml殺菌液與稀釋100倍的9.8ml菌液混合均勻，乳酸鏈球菌素濃度為200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml。調(diào)ph為5.5，取出0.1ml涂布平板，每個濃度殺菌液涂3個平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中恒溫30℃培養(yǎng)24h。觀察并記錄各平板的菌落個數(shù)，同一濃度的平板菌落個數(shù)取平均值。
乳酸鏈球菌素殺菌效果對比試驗(yàn)：取乳酸鏈球菌素配制成10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml濃度的殺菌液，取0.2ml與稀釋100倍的9.8ml菌液混合均勻，調(diào)ph為5.5，取出0.1ml涂布平板，每個濃度均涂布3個平板，在培養(yǎng)箱中恒溫30℃倒置培養(yǎng)24h。觀察并記錄各平板的菌落個數(shù)，同一濃度平板的菌落個數(shù)取平均值。
空白對照試驗(yàn)：在9.8ml稀釋100倍的菌液中加入0.2ml去離子水，混合后調(diào)ph為5.5，從中取0.1ml涂布于相應(yīng)的固體平板上，涂布均勻后，在培養(yǎng)箱中恒溫30℃倒置培養(yǎng)24h。觀察并記錄各平板的菌落個數(shù)，同一濃度平板的菌落個數(shù)取平均值。
根據(jù)殺菌率公式計算不同濃度殺菌液的殺菌率：
殺菌率=（空白試驗(yàn)菌落數(shù)-加殺菌液試驗(yàn)菌落數(shù)）/空白試驗(yàn)菌落數(shù)*100%
乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物持續(xù)殺菌效果試驗(yàn)：
①制備50ml濃度控制在4.5×106cfu/ml的菌液。
②包合物配制成乳酸鏈球菌素濃度達(dá)10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的殺菌液，將1ml殺菌液加入49ml菌液，則乳酸鏈球菌素濃度為200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml。進(jìn)行30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后取1ml，進(jìn)行倒平板培養(yǎng)。以后每天從中取1ml進(jìn)行倒平板培養(yǎng)，連續(xù)取樣培養(yǎng)20天，觀察包合物殺菌液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的持續(xù)殺菌效果。
設(shè)置對比實(shí)驗(yàn)，將同濃度的環(huán)糊精與乳酸鏈球菌素混合物進(jìn)行同上操作，對比觀察持續(xù)殺菌效果。以不添加任何殺菌液的為空白對照。
根據(jù)殺菌率計算方法計算殺菌率，根據(jù)殺菌率的變化情況判斷包合物的持續(xù)殺菌作用。
乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物熱穩(wěn)定性檢測：將包合物配制成乳酸鏈球菌素濃度為1.0mg/ml和5.0mg/ml的溶液，游離乳酸鏈球菌素配制成相同濃度溶液，分別進(jìn)行121℃高溫高壓滅菌5min、10min。然后考察經(jīng)121℃高溫高壓滅菌過后的包合物和游離乳酸鏈球菌素的殺菌效果。
本發(fā)明的有益效果為：
1、本發(fā)明所研制的乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物，可溶解于自然ph的水中，溶解后即可達(dá)到較強(qiáng)的殺菌效果，當(dāng)乳酸鏈球菌素的濃度達(dá)到200μg/ml及以上時，包合物溶液的殺菌效果與同樣濃度的游離乳酸鏈球菌素相同。當(dāng)乳酸鏈球菌素的濃度達(dá)到400μg/ml及以上時，包合物在液體食品中殺菌效果持續(xù)時間可達(dá)16~18天，較游離乳酸鏈球菌素在液體食品中的殺菌時間明顯延長。
2、經(jīng)121℃加熱滅菌10min，游離乳酸鏈球菌素的5.0mg/ml溶液已無殺菌效果，本發(fā)明所研制的乳酸鏈球菌素環(huán)糊精包合物包合物的熱穩(wěn)定性提高，包合物配制的乳酸鏈球菌素濃度為1.0mg/ml溶液，經(jīng)121℃加熱滅菌10min，仍具有60%左右的殺菌效果。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不能將方案中所涉及的技術(shù)參數(shù)理解為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
稱取600克淄博千匯生物科技有限公司生產(chǎn)的食品級環(huán)糊精溶解于5升去離子水中，稱取300克天津康益生物有限公司生產(chǎn)的乳酸鏈球菌素（純度90%）溶解于3升ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩者混合，攪拌均勻，用2摩爾/升濃度的氫氧化鈉水溶液調(diào)混合液ph至7.0，再保持70℃，攪拌2小時，在室溫下繼續(xù)攪拌2小時。攪拌完畢，以進(jìn)風(fēng)溫度110℃，霧化壓力0.15mpa，進(jìn)樣速度0.25l/l，進(jìn)風(fēng)量0.50m3/min的工藝條件噴霧干燥產(chǎn)品，得到包合物854克。
取攪拌完畢的樣液10ml，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取離心管上層清液5ml，以雙縮脲分光光度法測定清液中乳酸鏈球菌素的量，計算出未包合的總量，根據(jù)加入的乳酸鏈球菌素質(zhì)量，計算出包合率為65%。
包合物按擬定的殺菌效果測定方法，持續(xù)殺菌效果檢測方法，熱穩(wěn)定性檢測方法，與游離乳酸鏈球菌素作比較。經(jīng)測定，當(dāng)包合物溶于水，其乳酸鏈球菌素達(dá)200μg/ml濃度時，與相同濃度游離乳酸鏈球菌素具有相同的殺菌率；游離乳酸鏈球菌素濃度400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)7天，包合物溶液乳酸鏈球菌素濃度達(dá)400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)16天；將包合物配成乳酸鏈球菌素濃度1.0mg/ml和5.0mg/ml的樣液，游離乳酸鏈球菌素配制相同濃度的兩種樣液，經(jīng)121℃熱滅菌5分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了65%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了93%的殺菌率；經(jīng)121℃熱滅菌10分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了60%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了92%的殺菌率。
實(shí)施例2
600克海鹽六和淀粉化工有限公司生產(chǎn)的食品級環(huán)糊精溶解于4升去離子水中，200克武漢市鮮保生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的nisin（純度80%）溶解于3升ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩者混合，攪拌均勻，用2摩爾/升濃度的氫氧化鈉水溶液調(diào)混合液ph至7.5，在保持60℃下，攪拌1.5小時，在室溫下繼續(xù)攪拌1.5小時。攪拌完畢，以進(jìn)風(fēng)溫度115℃，霧化壓力0.2mpa，進(jìn)樣速度0.3l/h，進(jìn)風(fēng)量0.40m3/min的工藝條件噴霧干燥產(chǎn)品，得到包合物751克。
取攪拌完畢的樣液10ml，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取離心管上層清液5ml，以雙縮脲分光光度法測定清液中乳酸鏈球菌素的量，計算出未包合的總量，根據(jù)加入的乳酸鏈球菌素質(zhì)量，計算出包合率為66%。
包合物按擬定的殺菌效果測定方法，持續(xù)殺菌效果檢測方法，熱穩(wěn)定性檢測方法，與游離乳酸鏈球菌素作比較。經(jīng)測定，當(dāng)包合物溶于水，其乳酸鏈球菌素達(dá)200μg/ml濃度時，與相同濃度游離乳酸鏈球菌素具有相同的殺菌率；游離乳酸鏈球菌素濃度400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)7天，包合物溶液乳酸鏈球菌素濃度達(dá)400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)17天；將包合物配成乳酸鏈球菌素濃度1.0mg/ml和5.0mg/ml的樣液，游離乳酸鏈球菌素配制相同濃度的兩種樣液，經(jīng)121℃熱滅菌5分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了64%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了94%的殺菌率；經(jīng)121℃熱滅菌10分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了61%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了93%的殺菌率。
實(shí)施例3
600克無錫市潤興淀粉制品有限公司生產(chǎn)的食品級環(huán)糊精溶解于3升去離子水中，100克鄭州誠旺化工食品添加劑有限公司生產(chǎn)的nisin（純度95%）溶解于3升ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩者混合，攪拌均勻，用2摩爾/升濃度的氫氧化鈉水溶液調(diào)混合液ph至6.5，在保持50℃下，攪拌1小時，在室溫下繼續(xù)攪拌1小時。攪拌完畢，以進(jìn)風(fēng)溫度100℃，霧化壓力0.1mpa，進(jìn)樣速度0.2l/h，進(jìn)風(fēng)量0.25m3/min的工藝條件噴霧干燥產(chǎn)品，得到包合物653克。
取攪拌完畢的樣液10ml，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取離心管上層清液5ml，以雙縮脲分光光度法測定清液中乳酸鏈球菌素的量，計算出未包合的總量，根據(jù)加入的乳酸鏈球菌素質(zhì)量，計算出包合率為67%。
包合物按擬定的殺菌效果測定方法，持續(xù)殺菌效果檢測方法，熱穩(wěn)定性檢測方法，與游離乳酸鏈球菌素作比較。經(jīng)測定，當(dāng)包合物溶于水，其乳酸鏈球菌素達(dá)200μg/ml濃度時，與相同濃度游離乳酸鏈球菌素具有相同的殺菌率；游離乳酸鏈球菌素濃度400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)7天，包合物溶液乳酸鏈球菌素濃度達(dá)400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)18天；將包合物配成乳酸鏈球菌素濃度1.0mg/ml和5.0mg/ml的樣液，游離乳酸鏈球菌素配制相同濃度的兩種樣液，經(jīng)121℃熱滅菌5分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了66%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了95%的殺菌率；經(jīng)121℃熱滅菌10分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了59%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了93%的殺菌率。
實(shí)施例4
600克成都凱華食品有限公司生產(chǎn)的食品級環(huán)糊精溶解于6升去離子水中，300克天津康益生物工程有限公司生產(chǎn)的nisin（純度80%）溶解于3升ph3.0的鹽酸水溶液中，將兩者混合，攪拌均勻，用2摩爾/升濃度的氫氧化鈉水溶液調(diào)混合液ph至7.0，在保持70℃下，攪拌2小時，在室溫下繼續(xù)攪拌2小時。攪拌完畢，以進(jìn)風(fēng)溫度120℃，霧化壓力0.15mpa，進(jìn)樣速度0.4l/h，進(jìn)風(fēng)量0.60m3/min的工藝條件噴霧干燥產(chǎn)品，得到包合物856克。
取攪拌完畢的樣液10ml，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取離心管上層清液5ml，以雙縮脲分光光度法測定清液中乳酸鏈球菌素的量，計算出未包合的總量，根據(jù)加入的乳酸鏈球菌素質(zhì)量，計算出包合率為66%。
包合物按擬定的殺菌效果測定方法，持續(xù)殺菌效果檢測方法，熱穩(wěn)定性檢測方法，與游離乳酸鏈球菌素作比較。經(jīng)測定，當(dāng)包合物溶于水，其乳酸鏈球菌素達(dá)200μg/ml濃度時，與相同濃度游離乳酸鏈球菌素具有相同的殺菌率；游離乳酸鏈球菌素濃度400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)7天，包合物溶液乳酸鏈球菌素濃度達(dá)400μg/ml，持續(xù)殺菌效果可達(dá)17天；將包合物配成乳酸鏈球菌素濃度1.0mg/ml和5.0mg/ml的樣液，游離乳酸鏈球菌素配制相同濃度的兩種樣液，經(jīng)121℃熱滅菌5分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了65%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了94%的殺菌率；經(jīng)121℃熱滅菌10分鐘，經(jīng)檢測，兩種濃度的游離乳酸鏈球菌素液均已無殺菌效果，而包合物濃度1.0mg/ml的樣液保留了60%的殺菌率，濃度5.0mg/ml的樣液保留了93%的殺菌率。
以上僅列舉了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限制于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所作的任何改變均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。