技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于抑藻劑的制備方法，特別屬于復(fù)合抑藻劑的制備方法這一技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水華(waterbloom)通常是指當(dāng)水體達(dá)到富營(yíng)養(yǎng)化或嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化的狀態(tài)時(shí)，在一定的溫度、光照等條件下在水面形成或薄或厚的綠色或其他顏色的藻類漂浮物的現(xiàn)象。由于藻類具有浮力和運(yùn)動(dòng)能力，絕大部分的水華通常都是由浮游藻類引起的，引起水華現(xiàn)象的浮游藻的種類比較多，如藍(lán)藻、綠藻、裸藻、硅藻等，其中，藍(lán)藻水華是最為常見也是最為嚴(yán)重的。這是由于藍(lán)藻獨(dú)特的生理生態(tài)特性，偽空泡或偽空泡群結(jié)構(gòu)、膠質(zhì)鞘結(jié)構(gòu)、耐營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫性、co2濃縮機(jī)制、他感效應(yīng)，使得它在生態(tài)系統(tǒng)的生存競(jìng)爭(zhēng)中，占據(jù)有利的優(yōu)勢(shì)，成為水華藻類中的優(yōu)勢(shì)藻種。藍(lán)藻水華具有重大危害，而水體的富營(yíng)養(yǎng)化是發(fā)生水華現(xiàn)象的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，防治水華最重要的措施是控制水體的富營(yíng)養(yǎng)化，即切斷污染源。然而，導(dǎo)致水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化的營(yíng)養(yǎng)鹽來源很復(fù)雜，使得其控制難度較大，治理水華的另一個(gè)重要措施是直接去除有害藻類。該種治理方法主要可以分為物理法、化學(xué)法和生物法。利用水生植物的化感作用來抑藻也是生物法之一，化感作用是指一種生物產(chǎn)生一種或多種生物化學(xué)成分，以影響其他生物生長(zhǎng)、生存與繁殖的生物學(xué)現(xiàn)象，水生植物向水體中釋放的化感物質(zhì)，大多數(shù)是植物的次生代謝產(chǎn)物，自然條件下即可降解，不會(huì)長(zhǎng)期積累，因此生態(tài)安全性良好。但通常的水生植物的化感物質(zhì)具有都有使用量大、起效慢的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種復(fù)合抑藻劑的制備方法，所制的復(fù)合抑藻劑具有起效快的特點(diǎn)。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為：一種復(fù)合抑藻劑的制備方法，包括以下步驟：

a)消毒工序：將金魚藻(ceratophyllumdemersuml.)于室溫中浸入重量濃度為3％的次氯酸鈉(naclo)溶液中，靜置3-5分鐘，進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗沖洗5-6次，金魚藻與次氯酸鈉溶液的重量比為1:8-12；

b)培養(yǎng)工序：將上述消毒好的金魚藻放入盛有hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，再按10⁵個(gè)/ml細(xì)菌密度加入微生物菌種，用消毒牛皮紙封口，于25℃、光照強(qiáng)度4000lx的環(huán)境中培養(yǎng)0.5-1.0個(gè)月，用定性濾紙過濾，取濾液進(jìn)行抑藻，金魚藻與hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的重量體積比為1：90-120。

所述的微生物菌種通過以下方法制備：

取金魚藻植株周圍(0.1m*0.1m)水樣，用定性濾紙過濾，以消除原生動(dòng)物并去除水中雜質(zhì)，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的平板，37℃條件下培養(yǎng)48h，用平板劃線法進(jìn)行反復(fù)分離純化，將純化的單克隆菌種分別接入盛有500ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基或500mlpda液體培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，置于150r/min,30℃條件下振蕩培養(yǎng)3d，將培養(yǎng)好的菌液4000r·min^-1離心15min，得到沉淀物，將沉淀物加入到bg-11培養(yǎng)基搖勻，馴化培養(yǎng)48h進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)，抑藻時(shí)細(xì)菌在藻液中的個(gè)數(shù)為10⁵～10⁶個(gè)/ml，選取10⁵個(gè)/ml時(shí)，第4天的抑藻效率大于40％的菌種。

所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl5g，水定容至1000ml，ph7.2-7.4。

所述的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl5g，瓊脂20g,水1000ml，ph7.2-7.4。

所述的pda培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200g(煮爛取上清)，葡萄糖20g，水定容至1000ml。

所述的微生物菌種也可以為不動(dòng)桿菌屬(acinetobactersp.iffi10213)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn)：按本發(fā)明方法所制的微生物和金魚藻的復(fù)合抑藻劑，共同抑藻的最高效率達(dá)到了100％，超過了單獨(dú)的金魚藻(61.25％)和單獨(dú)的微生物(70.11％)；且達(dá)到最高抑制率的時(shí)間由單獨(dú)的金魚藻的第4天和單獨(dú)的微生物的第4d提前到了共同作用時(shí)的第2d；可以得出微生物與金魚藻共同作用于銅綠微囊藻，起到協(xié)同抑制的作用，縮短了起效時(shí)間。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1：

微生物菌種通過以下方法制備：

取金魚藻植株周圍(0.1m*0.1m)水樣，用定性濾紙過濾，以消除原生動(dòng)物并去除水中雜質(zhì)，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的平板，37℃條件下培養(yǎng)48h，用平板劃線法進(jìn)行反復(fù)分離純化，將純化的單克隆菌種分別接入盛有500ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，置于150r/min,30℃條件下振蕩培養(yǎng)3d，將培養(yǎng)好的菌液4000r·min^-1離心15min，得到沉淀物，將沉淀物加入到bg-11培養(yǎng)基搖勻，馴化培養(yǎng)48h進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)，抑藻時(shí)細(xì)菌在藻液中的個(gè)數(shù)為10⁵～10⁶個(gè)/ml，選取10⁵個(gè)/ml時(shí)，第4天的抑藻效率大于40％的菌種。

所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl5g，水定容至1000ml，ph7.2-7.4。

所述的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl5g，瓊脂20g,水1000ml，ph7.2-7.4。

所述的pda培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200g(煮爛取上清)，葡萄糖20g，水定容至1000ml。

實(shí)施例2：

微生物菌種通過以下方法制備：

取金魚藻植株周圍(0.1m*0.1m)水樣，用定性濾紙過濾，以消除原生動(dòng)物并去除水中雜質(zhì)，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的平板，37℃條件下培養(yǎng)48h，用平板劃線法進(jìn)行反復(fù)分離純化，將純化的單克隆菌種分別接入盛有500mlpda液體培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，置于150r/min,30℃條件下振蕩培養(yǎng)3d，將培養(yǎng)好的菌液4000r·min^-1離心15min，得到沉淀物，將沉淀物加入到bg-11培養(yǎng)基搖勻，馴化培養(yǎng)48h進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)，抑藻時(shí)細(xì)菌在藻液中的個(gè)數(shù)為10⁵～10⁶個(gè)/ml，選取10⁵個(gè)/ml時(shí)，第4天的抑藻效率大于40％的菌種。

實(shí)施例3：

一種復(fù)合抑藻劑的制備方法，包括以下步驟：

a)消毒工序：將金魚藻(ceratophyllumdemersuml.)于室溫中浸入重量濃度為3％的次氯酸鈉(naclo)溶液中，靜置3分鐘，進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗沖洗5次，金魚藻與次氯酸鈉溶液的重量比為1:8；

b)培養(yǎng)工序：將上述消毒好的金魚藻放入盛有hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，再按10⁵個(gè)/ml細(xì)菌密度加入實(shí)施例1所制的微生物菌種，用消毒牛皮紙封口，于25℃、光照強(qiáng)度4000lx的環(huán)境中培養(yǎng)0.5個(gè)月，用定性濾紙過濾，取濾液進(jìn)行抑藻，金魚藻與hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的重量體積比為1：90。

實(shí)施例4：

一種復(fù)合抑藻劑的制備方法，包括以下步驟：

a)消毒工序：將金魚藻(ceratophyllumdemersuml.)于室溫中浸入重量濃度為3％的次氯酸鈉(naclo)溶液中，靜置4分鐘，進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗沖洗5次，金魚藻與次氯酸鈉溶液的重量比為1:10；

b)培養(yǎng)工序：將上述消毒好的金魚藻放入盛有hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，再按10⁵個(gè)/ml細(xì)菌密度加入實(shí)施例2所制的微生物菌種，用消毒牛皮紙封口，于25℃、光照強(qiáng)度4000lx的環(huán)境中培養(yǎng)0.8個(gè)月，用定性濾紙過濾，取濾液進(jìn)行抑藻，金魚藻與hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的重量體積比為1：100。

實(shí)施例5：

一種復(fù)合抑藻劑的制備方法，包括以下步驟：

a)消毒工序：將金魚藻(ceratophyllumdemersuml.)于室溫中浸入重量濃度為3％的次氯酸鈉(naclo)溶液中，靜置5分鐘，進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗沖洗6次，金魚藻與次氯酸鈉溶液的重量比為1:12；

b)培養(yǎng)工序：將上述消毒好的金魚藻放入盛有hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，再按10⁵個(gè)/ml細(xì)菌密度加入實(shí)施例1所制的微生物菌種，用消毒牛皮紙封口，于25℃、光照強(qiáng)度4000lx的環(huán)境中培養(yǎng)1.0個(gè)月，用定性濾紙過濾，取濾液進(jìn)行抑藻，金魚藻與hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的重量體積比為1：120。

實(shí)施例6：

除b)培養(yǎng)工序?yàn)椋骸皩⑸鲜鱿竞玫慕痿~藻放入盛有hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，用消毒牛皮紙封口，于25℃、光照強(qiáng)度4000lx的環(huán)境中培養(yǎng)0.8個(gè)月，用定性濾紙過濾，取濾液進(jìn)行抑藻，金魚藻與hoagland(0.1×)培養(yǎng)液的重量體積比為1：100?！蓖?，其余與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例7：

除菌種為不動(dòng)桿菌屬(acinetobactersp.iffi10213)，外其余與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例8：

藻種培養(yǎng)：

在無菌條件下，向已經(jīng)高溫濕熱滅菌的250ml錐形瓶?jī)?nèi)加入100ml的bg-11培養(yǎng)基，加入銅綠微囊藻藻種，搖勻后放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件為:溫度24±2℃，光周期12l/12d，光照強(qiáng)度4000lx，ph值7.0。每天振蕩搖勻4-5次，實(shí)驗(yàn)前7天，對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每天加入新鮮培養(yǎng)基，使之處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

抑藻試驗(yàn)：

分別取出已稀釋的藻液40ml加入100ml錐形瓶中，再加入實(shí)施例3所制的抑藻劑，使得抑藻劑的的最終濃度分別為50ml/l、100ml/l、200ml/l、400ml/l。另外設(shè)置空白對(duì)照組，即只含相同藻密度的藻液；每組三個(gè)平行，置于藻種培養(yǎng)的相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期為4天，每隔24h用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞數(shù)。

本發(fā)明中銅綠微囊藻的抑制百分率(inhibitionratio)公式為：

ir(％)＝(1-n/n0)×100％，其中：

ir----抑制率；

n----處理組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)；

n0----對(duì)照組的銅綠微囊藻的藻密度(cells/ml)。

其結(jié)果如表1所示：

表1

由表1可以看出40％的處理組第2d的抑制率達(dá)到了100％,在第4d所有的實(shí)驗(yàn)組的抑制率達(dá)到了100％。

實(shí)施例9：

除抑藻試驗(yàn)為：

分別取出已稀釋的藻液40ml加入100ml錐形瓶中，再加入實(shí)施例1所制的菌種，使得抑藻劑的的最終濃度分別為a:10⁵個(gè)/ml、b:10⁶個(gè)/ml兩個(gè)濃度梯度，另外設(shè)置空白對(duì)照組，即只含相同藻密度的藻液；每組三個(gè)平行，進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期為4天，每隔24h用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞數(shù)。外，其余與實(shí)施例8相同。

其結(jié)果如表2所示：

表2：

如表2可知當(dāng)菌種濃度達(dá)到10⁵個(gè)/ml時(shí)第四天的抑藻效率達(dá)到最大為41.51％；達(dá)到10⁶個(gè)/ml時(shí)，抑藻的抑制率可以達(dá)到70.11％。

實(shí)施例10：

除抑藻試驗(yàn)所加的抑藻劑為實(shí)施例6所制的抑藻劑外，其余與實(shí)施例8相同。

其結(jié)果如表3所示；

如表3所示：當(dāng)濃度最大時(shí)(400ml/l)，在第4d抑制率可以達(dá)到61.25％。

實(shí)施例11：

除抑藻試驗(yàn)所加的抑藻劑為實(shí)施例7所制的抑藻劑外，其余與實(shí)施例8相同。

其20％的處理組第2d的抑制率達(dá)到了100％,在第4d所有的實(shí)驗(yàn)組的抑制率達(dá)到了100％。