本發(fā)明涉及胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型及其建立方法，屬于實驗動物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

胃癌（gastriccancer,gc）是全球第五大常見的惡性腫瘤（肺癌、腸癌、乳腺癌、肝癌）之一。在世界發(fā)達國家中，胃癌排列于癌癥新發(fā)病數(shù)第五位，位于肺癌、乳腺癌、腸癌、肝癌之后；而在發(fā)展中國家列第二位，僅次于肺癌。國外文獻統(tǒng)計，胃癌占消化系瘤50%，國內(nèi)報道占62%。據(jù)統(tǒng)計，2012年有952000新病例（占所有癌癥發(fā)病率7%）和723000例死亡病例（占所有癌癥死亡率9%）。在我國，每年新確診的胃癌有30萬，死于胃癌者多達16萬，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23%，占消化系腫瘤死亡人數(shù)的50%。我國胃癌死亡率20年（20世紀(jì)70年代至20世紀(jì)90年代）變化情況分析結(jié)果表明，胃癌死亡總體趨勢是男性高于女性，農(nóng)村高于城市；與世界各國相比，我國男性、女性胃癌世界死亡率居于首位。

侵襲（或侵潤）（invasion）與轉(zhuǎn)移（metastases）是惡性腫瘤危害生命的最主要生物學(xué)特性。所謂腫瘤的侵襲實質(zhì)是腫瘤細胞通過各種方式破壞周圍正常組織結(jié)構(gòu)，脫離原發(fā)腫瘤，異常地分布于周圍組織及其間隙的過程，是惡性腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提步驟。但部分良性腫瘤也有向周圍組織及其間隙浸潤的特性。對于沒有發(fā)生侵襲或者侵襲程度較為局限的惡性腫瘤，通常以手術(shù)等治療手段進行根治。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的最主要特性之一。所謂轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞脫離其原發(fā)部位。在體內(nèi)通過各種轉(zhuǎn)運途徑，到達與原發(fā)部位不連續(xù)的組織繼續(xù)增值生長，并形成與原發(fā)腫瘤同樣病理性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的全過程。局部侵襲通過對局部正常組織器官的壓迫、損毀，可抑制并影響正常組織器官的功能。而轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，則標(biāo)志著腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折，遠處轉(zhuǎn)移一旦出現(xiàn)，往往意味著腫瘤進入晚期階段，單憑局部治療已難以達到治愈目的。轉(zhuǎn)移的主要途經(jīng)包括：1.血行轉(zhuǎn)移；2.淋巴道轉(zhuǎn)移；3.種植轉(zhuǎn)移。

胃癌的血道轉(zhuǎn)移是個多步驟的過程，可概括為：癌細胞從原發(fā)灶脫離，入侵循環(huán)系統(tǒng)，穿越血管，粘附于血管壁，增殖生成繼發(fā)腫瘤。胃癌的臟器轉(zhuǎn)移中肺轉(zhuǎn)移占20%~40%，僅次于肝轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞進入門靜脈，經(jīng)過肝臟在到達肺，形成轉(zhuǎn)移灶；或胃周圍經(jīng)腹膜后轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的腫瘤細胞，上行經(jīng)胸導(dǎo)管、靜脈入血，形成肺轉(zhuǎn)移；或腫瘤細胞經(jīng)淋巴途徑穿過膈肌，上行到縱膈，在肺門或縱膈形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進一步轉(zhuǎn)移至肺。腫瘤細胞還可經(jīng)膈肌直達胸膜，進而經(jīng)肺門、縱膈波及肺，此種轉(zhuǎn)移較少。

動物實驗作為人類疾病研究中的一個重要環(huán)節(jié)，能夠較客觀的模擬人類體內(nèi)環(huán)境，這是體外實驗完全不能替代的。隨著物理學(xué)和化學(xué)的發(fā)展，動物模型學(xué)近年來取得了很大進展，各種人類疾病模型都被完美的復(fù)制，從而為人類的疾病研究提供了更廣闊的平臺。

作為一個高侵襲性和致命性的惡性腫瘤，胃癌的侵襲性與抑癌基因、癌基因、生長因子及其受體等突變有關(guān)。對于腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的晚期患者，直到現(xiàn)在也很少有有效的治療方案。因此，建立一種高效穩(wěn)定的胃癌小鼠轉(zhuǎn)移模型極為關(guān)鍵，

傳統(tǒng)的胃癌轉(zhuǎn)移方法，多采用原位移植。需要預(yù)先制備好胃癌細胞株，或者尋找胃癌患者手術(shù)切除下來的癌組織注射到裸鼠的胃壁，構(gòu)建了人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的方法，但是該模型存在潛伏期長，轉(zhuǎn)移率低的問題。也有專業(yè)技術(shù)人員將胃癌組織塊直接包埋于裸鼠的胃大彎處或者小彎處，雖然能穩(wěn)定建立胃癌轉(zhuǎn)移模型，但是手術(shù)風(fēng)險較大，且術(shù)后對裸鼠的健康造成了一定的影響。也有一些先進的實驗室，輔助顯微外科設(shè)備，使得胃癌的原位移植對裸鼠的損傷降到最低。但由于實驗條件要求較高，該方法也未能得到普及。

也有的實驗室試圖通過皮下移植的方式，想要通過肌肉隔膜的轉(zhuǎn)移，建立簡單的胃癌轉(zhuǎn)移模型。雖然移植的皮下腫瘤能侵潤到肌肉層，但是很難穿透肌肉隔膜，且轉(zhuǎn)移到肌肉表層的情況也很難準(zhǔn)確統(tǒng)計。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型及其建立方法。

本發(fā)明首先提供一種胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，所述小鼠為免疫缺陷型nude或scid小鼠。

本發(fā)明還提供一種胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立方法，所述方法具體操作如下：

將bgc-823和mkn-45胃癌細胞在體外培養(yǎng)，細胞活力很旺盛的時候，用無菌的pbs重懸成適當(dāng)?shù)臐舛?；通過尾靜脈接種于免疫缺陷的免疫缺陷型nude和scid小鼠體內(nèi)飼養(yǎng)后得到胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。

所述bgc-823和mkn-45胃癌細胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的rmpi-1640培養(yǎng)基中；。

所述用pbs重懸成1x10⁷個/ml細胞的濃度；

所述胃癌細胞尾靜脈接種量為200μl，即200x10⁴個細胞/只。

將尾椎接種bgc-823和mkn-45胃癌細胞的nude和scid小鼠飼養(yǎng)觀察數(shù)周，等到小鼠出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)的時候，對小鼠進行猝死，并進行解剖；此時，會發(fā)現(xiàn)肺組織有明顯的轉(zhuǎn)移病灶；對小鼠的肺組織進行清洗，拍照，并用10%福爾馬林固定，做成石蠟切片；進行he和ihc染色，并對轉(zhuǎn)移效率進行系統(tǒng)性的評估。

本發(fā)明還提供一種腫瘤轉(zhuǎn)移效率評估的方法，對所得到的胃癌肺轉(zhuǎn)移小鼠進行解剖，取出已經(jīng)有明顯轉(zhuǎn)移病灶的肺，制作石蠟切片，采用特異性的抗人類白細胞抗原的（內(nèi)源性）抗體（anti-hlaclassiabc）做ihc染色，隨機選取組織切片三個相對分散的點，統(tǒng)計每一百個細胞中，陽性反應(yīng)的細胞個數(shù)占比即為腫瘤轉(zhuǎn)移效率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的有益效果如下：

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明在實驗難度（不需要做手術(shù)原位移植），實驗條件（不需要外科顯微設(shè)備輔助），以及實驗周期（不需要提前制備胃癌組織塊或者等待胃癌患者進行手術(shù)）幾方面，都得到了改進。且轉(zhuǎn)移效率高，評估轉(zhuǎn)移方法科學(xué)，非常適合用于科研和新藥開發(fā)。

本發(fā)明的模型建立成功之后，采用了多種評價機制，對肺轉(zhuǎn)移后的結(jié)果做了評價。其中包括兩種傳統(tǒng)方式，即表面肺結(jié)節(jié)的統(tǒng)計和he染色；其次，受免疫學(xué)啟發(fā)，人源的細胞株轉(zhuǎn)移到小鼠的肺部之后，采用了一種特異性的抗人類白細胞抗原的（內(nèi)源性）抗體（anti-hlaclassiabc）做ihc染色，在微觀的條件下，來評價肺轉(zhuǎn)移的效率。本發(fā)明從宏觀肺結(jié)節(jié)到微觀he和ihc染色，都做到了定性和定量。系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移評價機制，將會為需要做胃癌細胞腫瘤轉(zhuǎn)移模型的實驗，提供更有說服力的精確證明。這也是本發(fā)明的一個重要環(huán)節(jié)，相較于傳統(tǒng)的單一的計算肺表面結(jié)節(jié)的方式，主觀因素將會更小，計數(shù)更加科學(xué)，評價更加客觀準(zhǔn)確。

本發(fā)明通過篩選幾種常用的胃癌細胞系：bgc-823，mkn-45，ags和sgc-7901，最終確定bgc-823和mkn-45在兩種常用的免疫缺陷型nude和scid小鼠身上建立腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型。成模所需要的實驗條件和操作較為簡便，且實驗后肺轉(zhuǎn)移病灶明顯，轉(zhuǎn)移效率高，形成轉(zhuǎn)移病灶后的小鼠，存活周期適中（1至1.5個月），很適合用于科研和教學(xué)。

本發(fā)明形成轉(zhuǎn)移病灶的部位是一個較大的組織器官（肺），相對于某些病灶轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)或者腹膜的模型，轉(zhuǎn)移病灶易于觀察且易摘取。此外，還克服了傳統(tǒng)胃癌小鼠轉(zhuǎn)移模型的多種缺陷，實驗的手術(shù)難度降低了，試驗后（手術(shù)后）小鼠的存活率明顯提高（基本可以達到100%），實驗需要的設(shè)備（不需要體視顯微鏡）簡單，實驗需要的周期縮短（不需要提前制備組織塊），以及后期評價轉(zhuǎn)移效率的指標(biāo)，都遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的方法。

本發(fā)明的建立，可以有效地篩選藥物，為臨床前的研究提供有力的數(shù)據(jù)支撐。在藥物篩選的同時，可以利用篩選到的有效藥物反作用于該模型，并在不同的時間段，取出有轉(zhuǎn)移病灶的肺，進一步探討分子作用方面的機制。隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的的迅猛發(fā)展，尤其是基因組學(xué)，蛋白組學(xué)，生物信息學(xué)等諸多問題，都可以在這個模型的基礎(chǔ)上得到進一步探索或者驗證。還可以依托這個模型尋找治療胃癌的新靶點，從而加快抗胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的研究和開發(fā)。

附圖說明：

圖1為nude小鼠模型建立前后小鼠肺的直觀表現(xiàn)圖；其中，圖a為nude小鼠未形成轉(zhuǎn)移病灶的肺，圖b和c分別是nude小鼠注射bgc-823和mkn-45胃癌細胞株后形成轉(zhuǎn)移病灶的肺。

圖2為scid小鼠模型建立前后小鼠肺的直觀表現(xiàn)圖；其中，圖a為scid小鼠未形成轉(zhuǎn)移病灶的肺，圖b和c分別是scid小鼠注射bgc-823和mkn-45胃癌細胞株后形成轉(zhuǎn)移病灶的肺。

圖3為nude小鼠未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶和發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的肺部he染色對照圖。

圖4為scid小鼠未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶和發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的肺部he染色對照圖。

圖5為nude和scid小鼠未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶和發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的肺部ihc染色對照圖。

圖6為nude和scid小鼠未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶和發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的肺部轉(zhuǎn)移率統(tǒng)計圖。

具體實施方式

為更好的使本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和具體實施例進行詳細的說明。

實施例1：

s1.細胞培養(yǎng)

bgc-823和mkn-45細胞(americantypeculturecollection)體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的rmpi-1640培養(yǎng)基(lifetechnologies公司，美國)中，需要每天定期觀察細胞生長狀態(tài)，細胞長滿培養(yǎng)瓶時要及時傳代（一般在貼壁細胞表面積占80%及以上時傳代）。當(dāng)細胞培養(yǎng)和傳代效果良好時進行下一步實驗。

細胞接種

bgc-823細胞，在200g離心力下離心5min，用血球計數(shù)板，計算出細胞密度，然后用pbs重懸成1x10⁷個/ml細胞的濃度，通過尾靜脈把bgc-823接種到免疫缺陷型nude和scid各只小鼠內(nèi)（200μl，即200x10⁴個/只）。同樣的操作，mkn-45也分別接種到nude和scid小鼠中。具體細胞接種詳細情況，見表1。免疫缺陷型nude和scid小鼠購買于南京大學(xué)模式動物研究所，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)spf級隔離屏障中。

表1.細胞接種情況

s3.猝死

定期觀察小鼠的變化，等到小鼠出現(xiàn)體重明顯下降，精神恍惚，身體顫抖等癥狀的時候，對小鼠進行脊椎脫臼猝死。每只小鼠從接種細胞到猝死歷時周期統(tǒng)計如上表1。

解剖

解剖觀察小鼠的主要器官，取出已經(jīng)有明顯轉(zhuǎn)移病灶的肺，至于培養(yǎng)皿中，用pbs沖洗幾遍，直到把血水沖洗干凈為止。

拍照

先對完整的肺組織進行拍照，正面和背面各拍一次。通過拍照結(jié)果可以清晰看出，bgc-823細胞轉(zhuǎn)移到肺的病灶（肺結(jié)節(jié)）相對mkn-45轉(zhuǎn)移到肺的病灶較緩和，且bgc-823的轉(zhuǎn)移病灶小而均勻，對肺組織的整體形態(tài)影響不大；而mkn-45轉(zhuǎn)移病灶較大，且已經(jīng)嚴(yán)重影響小鼠肺組織的形態(tài)。正常小鼠的肺葉無明顯轉(zhuǎn)移病灶，且形態(tài)完好。其次，發(fā)生轉(zhuǎn)移病灶的小鼠肺組織相對于無明顯轉(zhuǎn)移病灶的小鼠肺組織，體積要更大，詳見圖1和圖2所示。

固定

用4%中性甲醛（10%福爾馬林，加過量的碳酸鈣，配成飽和溶液，取上清）把肺組織固定在大小適合的離心管中（液體約為組織體積的20倍），中間隔1到2h，重新?lián)Q一次固定液，置于搖床上緩慢搖晃24h，即可置于4℃冰箱保存。

石蠟切片的制作

固定24h~48h后，即可取出有轉(zhuǎn)移灶的肺葉組織，體積大小適中，置于新的離心管，加蒸餾水于離心管中，放搖床上緩慢搖動24h（中間換兩次蒸餾水，約每隔8h）。然后按照常規(guī)的石蠟切片步驟，進行脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，裝盒待用。

具體步驟如下：

乙醇脫水過程：70%乙醇過夜（10h左右），85%乙醇2h左右，95%乙醇1h左右，95%乙醇1h左右，100%乙醇1h，100%乙醇30到40min。

二甲苯的透明步驟：第一次透明約40min，用100%的二甲苯；第二次時間不一定，視透明效果而定，用100%的二甲苯（一般20到30min）。

浸蠟步驟：在60℃恒溫箱中放置3個蠟杯，分別編號1（52℃-54℃）、2（54℃-56℃）、3（56℃-58℃），其中分別盛數(shù)塊相應(yīng)熔點的蠟塊，事先讓其溶解為透明液體狀，取透明好的組織塊放入軟蠟中各一個小時，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時，共分3次浸蠟，蠟塊熔點從低到高

包埋和切片：用萊卡的包埋機和切片機按照操作說明進行石蠟包埋和切片，切成5μm厚度的片子，裝在玻片盒中待用。

蘇木素伊紅染色（he）

烘片：90-95℃0.5h，能夠較好的去掉組織周圍的氣泡

脫蠟：二甲苯20min；二甲苯20min；100%乙醇30s；100%乙醇30s；85%乙醇10s；50%乙醇10s；蒸餾水10s。

he染色：蘇木素10min，蒸餾水沖洗至紫紅色，鹽酸酒精（1:99）分化30s，流動水沖洗10min，伊紅染液3~5min，迅速水洗至紫紅色。

脫水：50%酒精30s，85%酒精10s，100%酒精10s，100%酒精10s，二甲苯10s，二甲苯10s。

封片：中性樹脂封片

可以觀察到未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺組織，細胞間隙較大，肺泡間的空隙清晰可見。發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的肺組織，細胞與細胞之間生長密集，無正常肺泡間隙，且細胞核偏大，與周圍正常肺細胞大小和排列的緊密程度都存在著顯著差異，詳見圖3和圖4所示。

備注：（蘇木素和伊紅來自：武漢谷歌生物科技有限公司）

s9.免疫組織化學(xué)染色（ihc）

烘片：90-95℃0.5h，能夠較好的去掉組織周圍的氣泡。

脫蠟：二甲苯20min，二甲苯20min，100%乙醇30s，100%乙醇30s，85%乙醇10s，50%乙醇10s，蒸餾水10s。

檸檬酸修復(fù)：ph6.0的檸檬酸，煮沸15min，拔掉電源，打開蓋子，放入冰袋，冷卻到室溫（約30min）。

加一抗：先用pbs沖洗一遍，然后放入pbs盒中3min，紗布擦干周圍水分，加一抗（anti-hlaclassⅰabc），濃度1:100，體積100μl，4℃過夜（約12小時）。

加二抗：先用pbs沖洗一遍，放入pbs盒中3min，紗布擦干周圍水分，加二抗50μl，室溫下孵育20min。

dab染色：先用pbs沖洗一遍，放入pbs盒中3min，紗布擦干周圍水分，滴加dab（a與b按照1:1的比例，每片片子約50μl用量配比）染液，出現(xiàn)陽性反應(yīng)即挺（約20s）。

核染：蘇木素2min，用蒸餾水沖洗。

脫水：50%酒精30s，85%酒精10s，100%酒精10s，100%酒精10s，二甲苯10s，二甲苯10s。

封片：中性樹脂封片

可以觀察到發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的切片，整個組織陽性反應(yīng)十分明顯，具有顯著的人源特性的細胞株特征，詳見圖5。

備注：一抗anti-hlaclassⅰabc（abcam公司），檸檬酸鈉粉劑（gt100202，配成2l的檸檬酸鈉修復(fù)液，ph6.0），pbs粉劑(gt100102，2l的標(biāo)準(zhǔn)裝)，鼠兔通用的二抗(gk500511a)和dab(gk34801)染液，均來自gene公司。

肺轉(zhuǎn)移率統(tǒng)計

隨機選取組織切片三個相對分散的點，統(tǒng)計每一百個細胞中，陽性反應(yīng)的細胞個數(shù)。nudebgc-823肺轉(zhuǎn)移率為93.7%±8.7；nudemkn-45肺轉(zhuǎn)移率為94.3%±2.7；scidbgc-823肺轉(zhuǎn)移率為93.7%±5.7；scidmkn-45肺轉(zhuǎn)移率為94.3%±2統(tǒng)計結(jié)果；詳見圖6。