本發(fā)明屬于干細胞領(lǐng)域，具體涉及一種臍血造血干細胞凍存管。

背景技術(shù)：

臍血干細胞是臍血中的一種具有分化潛能的原始細胞，具備自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影響或誘導下，向各種細胞或組織分化。臍血造血干/祖細胞具有高度的自我更新能力或復制能力，能保持干細胞數(shù)量恒定，并能進一步分化為各系祖細胞及成熟細胞。CD34抗原是分離純化造血干/祖細胞的主要標志，臍血中的CD34+細胞群在數(shù)量、質(zhì)量和增殖能力方面高于外周血，臍血中的造血干/祖細胞具有更原始、更強的增殖分化能力。近年來，臍血造血干細胞移植已發(fā)展為一種高科技生物治療手段，廣泛應(yīng)用于許多疾病的治療，包括惡性血液病、自身免疫性疾病、嚴重免疫缺陷癥等，臨床證明具有一定的療效。

冷凍保存是臍血保存和造血干細胞移植的關(guān)鍵。已知，臍血干細胞在液氮中凍存6個月、1年、2年后的數(shù)量和活性無明顯變化，凍存效果較好，因而建議臍血干細胞長期保存應(yīng)置于液氮中。鑒于-80℃凍存的方法方便、成本較低、應(yīng)用廣泛，6個月以內(nèi)的凍存采用-80℃凍存更為方便。徐長根等研究(-80℃下不同凍存時間對臍血造血干細胞保存效果的影響，臨床輸血與檢驗2010年4月第12卷第2期)發(fā)現(xiàn)，臍血細胞在-80℃下保存1、2、3、4、8周后，各組的有核細胞數(shù)和CD34+數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義，而在凍存16、32周后較1周的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。臺盼藍拒染率在8、16、32周較1周的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種臍血造血干細胞凍存管，用于臍血造血干細胞在-80℃條件下6個月以內(nèi)的有效凍存。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種臍血造血干細胞凍存管，包括凍存管主體，該凍存管主體的內(nèi)壁設(shè)有包被層，包被層為γ聚谷氨酸材質(zhì)。

優(yōu)選地，所述γ聚谷氨酸的分子量為70萬克/摩爾。

優(yōu)選地，γ聚谷氨酸包被層的厚度為0.2-0.4mm。

一種制備上述臍血造血干細胞凍存管的方法，包括如下步驟：

步驟S1，將無菌γ聚谷氨酸溶于無菌水中，制成濃度為0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；

步驟S2，取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售凍存管中，置于35-45℃無菌條件靜置2-4小時；

步驟S3，傾倒凍存管中剩余溶液，用無菌水清洗2-3次，置于無菌條件備用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的凍存管內(nèi)壁含有γ聚谷氨酸包被層，使用本發(fā)明凍存管凍存臍血造血干細胞時，-80℃凍存6個月細胞數(shù)量和活性無明顯下降，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。因此，臍血造血干細胞6個月內(nèi)的短期保存可以使用本發(fā)明提供的凍存管在-80℃凍存；超過6個月的長期凍存建議使用液氮保存。

附圖說明

圖1為本發(fā)明凍存管結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為γ聚谷氨酸包被層；

圖2為包被凍存組和常規(guī)凍存組6個月凍存期內(nèi)臺盼藍拒染率變化。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖詳細介紹本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如教科書和實驗指南中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或易于獲知。

實施例1本發(fā)明凍存管的制備

取市售2mL康寧凍存管自制本發(fā)明提供的凍存管，具體步驟如下：

步驟S1，將無菌γ聚谷氨酸(采用γ射線鈷60照射滅菌，分子量70萬克/摩爾)溶于無菌水中，制成濃度為0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；

步驟S2，取2mLγ聚谷氨酸溶液加入2mL康寧凍存管中，于40℃無菌條件靜置3小時；

步驟S3，傾倒凍存管中剩余溶液，用無菌水清洗3次，置于無菌條件備用。

顯微鏡觀察顯示，凍存管內(nèi)壁形成均勻的γ聚谷氨酸包被層，包被層厚度0.3mm。

γ聚谷氨酸溶液的濃度可以在0.1-0.2mg/mL之間調(diào)整，靜置溫度在35-45℃之間調(diào)整，靜置時間4-5小時，最終獲得的包被凍存管內(nèi)壁的γ聚谷氨酸包被層厚度在0.2-0.4mm之間。

其他規(guī)格的凍存管制備方法類似。

當然，為了提高科研人員的工作效率，可以制備成預包被凍存管成品銷售給科研人員。

實施例2凍存管內(nèi)壁包被對凍存效果的影響

一、實驗方法

1、臍血造血干細胞分離

肝素抗凝的臍血用Ficoll作密度梯度離心獲得臍血單個核細胞，洗滌后用RPMI 1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為5×10¹⁰/L。

2、低溫凍存

采用含5％DMSO(二甲基亞砜，體積百分濃度)、3％HES(羥乙基淀粉，質(zhì)量體積百分濃度)和4％HSA(人血白蛋白，質(zhì)量體積百分濃度)的RPMI 1640培養(yǎng)液作為細胞冷凍保護劑，在試管中將等體積的細胞冷凍保護劑(4℃預冷)緩慢加入細胞懸液(4℃預冷)中，邊加邊混勻，然后分裝于2ml的凍存管中。在4℃冰箱中平衡30min后置于-80℃冰箱直接凍存，分別凍存0.5、1、3、6個月后42℃快速復溫并檢測各項指標。

實驗分為包被凍存組和常規(guī)凍存組，包被凍存組采用實施例1制備的γ聚谷氨酸包被凍存管，常規(guī)凍存組直接使用市售的常規(guī)凍存管。每組每個時間點設(shè)5個重復。

3、指標檢測

有核細胞計數(shù)：用白細胞稀釋液稀釋細胞懸液后，血細胞計數(shù)板計數(shù)，重復3次取均值。

流式細胞儀檢測CD34+：取50μl有核細胞懸液，加入20μl FITC標記的抗CD34+抗體，陰性對照加入20μl鼠IgG1-FITC，避光室溫孵育20min，用PBS洗3次，最后加0.5ml含0.1％多聚甲醛的PBS，上機分析。在FSC-SSC散點圖上，以陰性對照設(shè)門(淋巴細胞群)，在FITC熒光參數(shù)直方圖上設(shè)定陰性。分析軟件為Cellquest。

采用臺盼藍拒染法進行活細胞計數(shù)：取0.5ml細胞懸液置于EP管，再加入約0.1ml 0.5％臺盼藍染液，混合2min后制片，鏡檢。采用血細胞計數(shù)板計數(shù)，計算臺盼藍拒染率。

應(yīng)用SPSS 11.0軟件，采用單因素方差分析實驗數(shù)據(jù)。

二、實驗結(jié)果

包被凍存組和常規(guī)凍存組臍血造血干細胞凍存0.5、1、3、6個月后有核細胞數(shù)、CD34+陽性細胞數(shù)和臺盼藍拒染率(％)見表1和圖2。

表1各指標檢測結(jié)果(n＝5)

表1和圖2表明，包被有γ聚谷氨酸的凍存管對臍血造血干細胞具有凍存保護作用，在6個月凍存期間，其有核細胞數(shù)、CD34+陽性細胞數(shù)和臺盼藍拒染率(細胞存活率)均沒有顯著變化。而使用常規(guī)無γ聚谷氨酸包被層的凍存管凍存臍血造血干細胞時，雖然0.5月、1月細胞數(shù)量和活性無明顯下降，但是3月細胞數(shù)量和活性顯著下降，6月下降更明顯。因此，臍血造血干細胞6個月內(nèi)的短期保存可以使用本發(fā)明提供的凍存管在-80℃凍存；超過6個月的長期凍存建議使用液氮保存。

上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。