本發(fā)明涉及生物膜領(lǐng)域，具體地，涉及一種抑制和/或破壞生物膜的方法。

背景技術(shù)：

生物膜是指微生物為了適應(yīng)環(huán)境，粘附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等不均一的胞外基質(zhì)，將菌體自身包裹在其中而形成的大量菌體聚集膜樣物，是菌體在自然界中一種常見的生存狀態(tài)。生物膜的形成分為以下幾個(gè)階段：1、初始粘附，游離的細(xì)菌粘附在固體基質(zhì)表面，并分泌胞外核酸促進(jìn)粘附。2、微菌落的形成，粘附的細(xì)菌經(jīng)過繁殖擴(kuò)增形成微菌落，并分泌胞外蛋白促進(jìn)粘附。3、生物膜成熟，菌體進(jìn)一步生長并分泌大量的胞外基質(zhì)，主要成分為胞外多糖，蛋白質(zhì)，胞外核酸和脂類，形成成熟的生物膜。4、生物膜凋亡，生物膜成熟后，膜內(nèi)細(xì)菌仍然增殖，在微菌落生長后期，生物膜破裂，釋放出游離的細(xì)菌，可進(jìn)入下一個(gè)生物膜形成周期。相對于游離細(xì)菌，生物膜內(nèi)菌體被胞外基質(zhì)包裹，形成一層厚厚的生物屏障，阻礙抗菌藥物的滲透，增強(qiáng)菌體對不良環(huán)境的耐受性。即使抗菌藥物滲透到生物膜內(nèi)部，內(nèi)部的細(xì)菌由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、氧氣不足等因素生長緩慢或處于休眠期，對抗生素極不敏感，這是導(dǎo)致生物膜無法根除的主要原因?；谀退幮缘脑颍瑢ふ倚碌闹委煵呗砸云谝种粕锬さ男纬赏瑫r(shí)破壞成熟生物膜是具有挑戰(zhàn)性的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中生物膜引發(fā)的耐藥性的缺陷，本發(fā)明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法，采用本發(fā)明提供的方法，能夠抑制生物膜的形成，還能夠破壞成熟的生物膜。

具體的，本發(fā)明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法，該方法包括：將式(I)所示的化合物與樣品進(jìn)行接觸，所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品；

其中，R₁^#、R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₁^*、R₂^*、R₃^*和R₄^*各自獨(dú)立地為C₁-C₁₂的烷基，X^#和X^*各自獨(dú)立地表示鹵素；n為8-15的整數(shù)；所述式(I)所示的化合物的數(shù)均分子量為5000-10000。

本發(fā)明的方法能夠抑制和破壞生物膜的原因可能為：細(xì)菌表面的主要成分為多糖、蛋白質(zhì)、脂類等，帶有負(fù)電荷，而式(I)所示化合物帶有正電荷，所以細(xì)菌通過靜電作用和疏水作用與化合物緊密結(jié)合。在抑制生物膜形成過程中，將式(I)所示化合物加入到稀釋后的細(xì)菌溶液中，式(I)所示化合物通過靜電作用和疏水作用與細(xì)菌結(jié)合到一起。當(dāng)式I所示化合物濃度足夠高時(shí)，過量的式(I)所示化合物能夠包裹細(xì)菌，削弱細(xì)菌與細(xì)菌之間、細(xì)菌與基底之間的相互作用，導(dǎo)致生物膜形成能力變?nèi)酰_(dá)到抑制生物膜形成的效果。在破壞成熟生物膜過程中，將式(I)所示化合物加入到成熟的生物膜中，靜電作用和疏水作用使式(I)所示化合物結(jié)合到細(xì)菌及生物膜表面。這樣可以使式(I)所示化合物在光照條件下產(chǎn)生的活性氧與細(xì)菌及生物膜足夠近，進(jìn)而有效地破壞生物膜。

本發(fā)明提供的抑制生物膜形成及破壞成熟生物膜的方法，克服了現(xiàn)有的破壞生物膜方法容易產(chǎn)生耐藥性的難題。在抑制生物膜形成過程中，式(I)所示化合物通過靜電和疏水作用將細(xì)菌包裹起來，削弱細(xì)菌與細(xì)菌之間、細(xì)菌與基底之間的相互作用，而不是殺死細(xì)菌，從源頭抑制了耐藥性的產(chǎn)生。在破壞成熟生物膜過程中，利用式(I)所示化合物在光照條件下產(chǎn)生的活性氧直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，同樣避免了耐藥性的產(chǎn)生。本發(fā)明為建立有效的生物膜去除和預(yù)防策略奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是實(shí)施例3中的生物膜形成能力曲線圖；

圖2是實(shí)施例4中熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系圖；

圖3是實(shí)施例5中的生物膜抑制率曲線圖；

圖4是實(shí)施例6中不同光照時(shí)間下死活菌染色熒光比率圖；

圖5是實(shí)施例7中不同光照時(shí)間下的電鏡成像圖。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個(gè)范圍的端點(diǎn)值之間、各個(gè)范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個(gè)或多個(gè)新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。

本發(fā)明提供了一種抑制和/或破壞生物膜的方法，該方法包括：將式(I)所示的化合物與樣品進(jìn)行接觸，所述樣品為含有生物膜的樣品和/或能夠形成而未形成生物膜的樣品；

其中，R₁^#、R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₁^*、R₂^*、R₃^*和R₄^*各自獨(dú)立地為C₁-C₁₂的烷基，X^#和X^*各自獨(dú)立地表示鹵素；n為8-15的整數(shù)；所述式(I)所示的化合物的數(shù)均分子量為5000-10000。

術(shù)語“生物膜”是微生物(特別是細(xì)菌)粘附于接觸的物體表面，分泌胞外多糖、蛋白質(zhì)和核苷酸等物質(zhì)，并將自身包被于其中的大量微生物群聚膜樣物。

根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在式(I)中，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*相同，均為C₁-C₅的烷基；R₁^#和R₁^*相同，為C₃-C₈的烷基；X^#和X^*各自獨(dú)立地選自氯、溴和碘中的至少一種，優(yōu)選均為溴。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為甲基，所述R₁^#和R₁^*均為正己基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為乙基，所述R₁^#和R₁^*均為正己基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為甲基，所述R₁^#和R₁^*均為正戊基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為乙基，所述R₁^#和R₁^*均為正戊基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為甲基，所述R₁^#和R₁^*均為正丁基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為乙基，所述R₁^#和R₁^*均為正丁基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為甲基，所述R₁^#和R₁^*均為正丙基。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體的實(shí)施方式，R₂^#、R₃^#、R₄^#、R₂^*、R₃^*和R₄^*均為乙基，所述R₁^#和R₁^*均為正丙基。

本發(fā)明所述抑制和/或破壞生物膜的方法優(yōu)選為體外和/或非治療目的的方法。

在本發(fā)明中，所述抑制和/或破壞生物膜的方法具體可以分為抑制生物膜的方法和破壞生物膜的方法。所述抑制生物膜的方法指的是抑制生物膜的形成的方法，所述破壞生物膜的方法指的是對于已經(jīng)形成的成熟的生物膜的破壞方法。

具體的，所述樣品為能夠形成而未形成生物膜的樣品時(shí)，所述抑制生物膜的方法可以包括：將式(I)所示的化合物與能夠形成而未形成生物膜的樣品進(jìn)行接觸。所述能夠形成而未形成生物膜的樣品指的是具有形成生物膜的能力而還未形成生物膜的樣品，例如可以為含有細(xì)菌的液體樣品和/或含有真菌的液體樣品。所述含有細(xì)菌的液體樣品和/或含有真菌的液體樣品中還未形成生物膜。本發(fā)明所述的細(xì)菌指的是能夠形成生物膜的細(xì)菌，具體種類沒有特別的限定，例如可以為革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌，具體可以為金黃色葡萄球菌，進(jìn)一步優(yōu)選為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113(金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113的來源可參考Di Poto A,Sbarra M S,Provenza G,et al.The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms[J].Biomaterials,2009,30(18):3158-3166)中的至少一種。本發(fā)明所述的真菌指的是能夠形成生物膜的真菌，具體種類也沒有特別的限定，例如可以為白色念珠菌，具體可以為白色念珠菌3153A或SC5314(上述兩種白色念珠菌的來源可參考Ramage G,Saville S P,Wickes B L,et al.Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol,a quorum-sensing molecule[J].Applied and environmental microbiology,2002,68(11):5459-5463)。

優(yōu)選地，所述能夠形成而未形成生物膜的樣品為含有細(xì)菌的液體樣品。所述接觸體系中，細(xì)菌的數(shù)量可以為10⁴-10⁷個(gè)/mL。此時(shí)進(jìn)行接觸的所述式(I)所示的化合物的用量可以在較大范圍內(nèi)變動(dòng)，例如，可以為1-100μM(μmol/L)，優(yōu)選為20-50μM。

在本發(fā)明中，所述樣品為能夠形成而未形成生物膜的樣品時(shí)，所述接觸的條件包括：溫度可以為37±0.5℃，時(shí)間可以10分鐘以上，優(yōu)選為20-30小時(shí)。

本發(fā)明對上述抑制生物膜的作用強(qiáng)度可以通過結(jié)晶紫染色法進(jìn)行定量檢測，并根據(jù)式(II)計(jì)算生物膜的存活率(VR)：

其中，A₀為未與式(I)所示的化合物接觸的細(xì)菌樣品在590nm處的吸光值(空白對照)，A為與式(I)所示的化合物接觸過的細(xì)菌樣品在590nm處的吸光值。

在本發(fā)明中，所述結(jié)晶紫染色法可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇。所述結(jié)晶紫是一種三苯甲烷類染料。電離后，該分子的染色部分帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的分子，包括細(xì)菌細(xì)胞膜表面的分子以及成熟生物膜分泌的胞外基質(zhì)中的多糖、核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合，使生物膜染色，所以可以用來定量生物膜。

在本發(fā)明中，所述樣品為含有生物膜的樣品時(shí)，所述方法還包括：將接觸之后的體系進(jìn)行光照，可以破壞生物膜。此時(shí)所述接觸的條件沒有特別的限定，例如可以包括：溫度可以為37±0.5℃；時(shí)間可以為10分鐘以上，優(yōu)選10-30分鐘。所述光照的條件可以包括：溫度可以為15-30℃，時(shí)間可以為5-25分鐘，光強(qiáng)可以為20-100mW/cm²，光照所使用的光為白光，光照的波長可以為400-800nm。由于白光為復(fù)合光，所以波長并不是一個(gè)固定數(shù)值。

在本發(fā)明中，所述含有生物膜的樣品可以為含有細(xì)菌形成的生物膜的液體樣品和/或含有真菌形成的生物膜的液體樣品。本發(fā)明所述的細(xì)菌指的是能夠形成生物膜的細(xì)菌，具體種類沒有特別的限定，例如可以為革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽性菌，具體可以為金黃色葡萄球菌，進(jìn)一步優(yōu)選為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、金黃色葡萄球菌V 329和金黃色葡萄球菌SA 113中的至少一種。本發(fā)明所述的真菌指的是能夠形成生物膜的真菌，具體種類也沒有特別的限定，例如可以為白色念珠菌，具體可以為白色念珠菌3153A或SC5314。

將接觸的時(shí)間控制在上述范圍內(nèi)再配合以光照，特別有利于實(shí)現(xiàn)破壞生物膜的目的。對于破壞效果，可以通過培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行定量。例如，對細(xì)菌而言，所述破壞生物膜的效果可以通過將光照后的體系中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，根據(jù)式(III)計(jì)算生物膜的抑制率IR：

其中，C為與式(I)所示的化合物接觸的細(xì)菌培養(yǎng)后形成的菌落數(shù)，C₀為未與式(I)所示的化合物接觸的細(xì)菌培養(yǎng)后形成的菌落數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明一種具體的實(shí)施方式，所述破壞生物膜的效果檢測步驟可以為：將式(I)所示的化合物與含有生物膜的樣品(例如菌液)進(jìn)行接觸并光照之后，超聲震蕩使生物膜分散；將分散后的細(xì)菌稀釋一定倍數(shù)后，取100μL稀釋液鋪在固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h后數(shù)平板上的菌落數(shù)；然后根據(jù)式(III)計(jì)算生物膜的抑制率IR。稀釋倍數(shù)可以根據(jù)細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行確定，使得固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)便于統(tǒng)計(jì)。

在本發(fā)明中，與式(I)所示的化合物接觸的含有生物膜的樣品的量可以在較大范圍內(nèi)變動(dòng)，當(dāng)所述含有生物膜的樣品為含有細(xì)菌的液體樣品時(shí)，所述含有生物膜的樣品是由包括以下步驟的方法制備得到的：控制細(xì)菌的起始數(shù)量為10⁴-10⁷個(gè)/mL，經(jīng)過18-30小時(shí)的培養(yǎng)形成。溫度可以為37±0.5℃。所述接觸體系中，式(I)所示的化合物的用量可以在較大范圍內(nèi)變動(dòng)，例如，可以為1-100μM，優(yōu)選為20-50μM。

在本發(fā)明中，所述式(I)所述的化合物在光照條件下產(chǎn)生活性氧，可以通過活性氧探針進(jìn)行檢測，所述活性氧探針的種類可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如具體可以為還原態(tài)2,7-二氯熒光素(DCFH)。

本發(fā)明還可以通過熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)對式(I)所示的化合物對生物膜的破壞作用進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一種的具體實(shí)施方式，可以通過BacLight死活菌染色試劑盒(購自Invitrogen廠家，貨號為L13152)進(jìn)行染色。BacLight死活菌染色試劑盒包含兩種染料：PI和SYTO9。檢測原理為：SYTO9可以同時(shí)對死菌和活菌染色，而PI只能對死菌染色，同時(shí)淬滅SYTO9的熒光。最終結(jié)果為死菌發(fā)紅光，活菌發(fā)綠光。通過對與式(I)所示的化合物接觸和光照之后的生物膜樣品進(jìn)行檢測，就可以得出對細(xì)菌生物膜的破壞作用的變化情況。例如，未光照組視野中全為綠色，表明細(xì)菌全為活菌。隨著光照時(shí)間的延長，視野中紅色增多，則表明式(I)所示的化合物產(chǎn)生的活性氧對生物膜中細(xì)菌的破壞作用增強(qiáng)。

另外需要說明的是，對式(I)所示的化合物與能夠形成而未形成生物膜的樣品進(jìn)行接觸后，也可以再進(jìn)行光照進(jìn)一步破壞細(xì)菌和/或真菌的細(xì)胞膜。光照的條件與和式(I)所示的化合物與含有生物膜的樣品接觸之后的光照的條件可以相同。

以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

在以下實(shí)施例中，

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號為：CGMCC No.1.2386。

BacLight死活菌染色試劑盒購自Invitrogen廠家，貨號為L13152。

2,7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)購自Sigma-Aldrich廠家，貨號為D6883。

TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司，貨號為211825。TSBg培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基中添加0.25質(zhì)量％的葡萄糖的培養(yǎng)基。

PBS為購自Hyclone廠家的貨號為SH30256.01的產(chǎn)品。

結(jié)晶紫購自Sigma-Aldrich廠家，貨號為C0775。

熒光成像在激光共聚焦掃描顯微鏡(購自O(shè)lympus廠家，型號為FV1000-IX81)儀器上進(jìn)行。

電鏡成像在掃描電子顯微鏡(購自Hitachi廠家，型號為S-4800)上進(jìn)行。

其余的化學(xué)和生物試劑均為商購獲得。

NB液體培養(yǎng)基組成成分按質(zhì)量體積比(質(zhì)量體積比指的是質(zhì)量與體積的比值，單位g/mL，下同)計(jì)：1.0％胰蛋白胨(100mL的NB液體培養(yǎng)基中含有1.0g胰蛋白胨)，0.3％牛肉浸取物，0.5％氯化鈉，98.2％蒸餾水；NB固體培養(yǎng)基配方為：向NB液體培養(yǎng)基中加入1.5重量％的瓊脂。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說明式(I)所示化合物PFP的合成

PFP的具體結(jié)構(gòu)為：

9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴:1,6-二溴己烷(97.6g，400mmol)加入100ml50％的氫氧化鉀溶液中，加入1.28g相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨(TBAB)，反應(yīng)液溫度升至75℃，然后加入2,7-二溴芴(12.96g，40mmol)攪拌15min。反應(yīng)停止并冷卻至室溫后，二氯甲烷萃取(100ml×3)，合并有機(jī)相，并分別用1M鹽酸溶液和蒸餾水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。粗產(chǎn)物硅膠柱層析分離純化，展開劑為二氯甲烷/石油醚(v/v＝1/9)，得白色固體產(chǎn)物9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴21.4g，產(chǎn)率82％。1H-NMR:(300MHz,CDCl₃,ppm)δ:0.58(m,4H),1.08(m,4H),1.21(m,4H),1.66(m,4H),1.91(m,4H),3.29(m,4H),7.43(s,4H),7.53(s,2H)；13C-NMR:(100MHz,CDCl₃,ppm)δ:23.53,27.80,29.00,32.67,33.92,40.06,55.06,121.30,126.17,130.38,139.09,152.23.EI(m/z):650(100％)[M+]Anal.Calcd for C₂₅H₃₀Br₄(650.15):C,46.14,H,4.614.Found:C,45.95,H,4.61.

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴(260mg，0.4mmol)與2′,2′-二甲基-1′,3′-丙二醇-1,4-苯二硼酸酯(120mg，0.4mmol)加入到6.4mL的THF中，溶解后加入1.6mL碳酸鉀溶液(2M)與催化量的鈀催化劑PdCl₂(dppf)(20mg)，混合液升溫至80℃反應(yīng)2d。反應(yīng)液冷卻至室溫后，將THF減壓除去，加入氯仿，洗滌兩次，將有機(jī)相濃縮，滴加到甲醇中沉淀，離心、干燥后得固體產(chǎn)物(115mg，52％)。

1H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。

PFP：將上一步得到的固體產(chǎn)物(57mg，0.1mmol)溶解在5mL的二氯甲烷溶液中，加入過量的三甲胺的甲醇溶液，室溫反應(yīng)5h。將反應(yīng)生成的沉淀過濾、洗滌，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物(60mg，88％)。

1H NMR(400MHz,DMSO-6):δ(ppm)7.91-7.79(m,10H),3.18(b,4H),2.96(b,>15H),2.18-1.91(m,4H),1.47(b,4H),1.09(b,8H),0.67(b,4H)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說明金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇培養(yǎng)

以金黃色葡萄球菌ATCC 6538為模板，在超凈工作臺中用75體積％酒精脫脂棉對所購裝有金黃色葡萄球菌ATCC 6538的安瓿瓶外表面進(jìn)行消毒后，用火焰加熱其頂端，滴400μL無菌水至加熱的安瓿瓶頂端使之破裂。吸取300μL適宜的液體培養(yǎng)基(可用無菌水代替)，滴入安瓿瓶內(nèi)，輕輕振蕩吹打，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，分別移植于兩個(gè)NB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。用接種環(huán)刮取適量菌體畫Z型接種到新的NB固體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，如此連續(xù)傳3-4代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的菌株，放4℃作菌種備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說明抑制生物膜的方法

(1)生物膜的形成和抑制

挑取固體培養(yǎng)基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養(yǎng)基中，37℃下轉(zhuǎn)速180rpm震蕩培養(yǎng)10h。用NB培養(yǎng)基調(diào)OD₆₀₀值為1.0，取少量菌液(10μL)稀釋100倍于TSBg培養(yǎng)基中。取90μL稀釋后的菌液與10μL不同濃度的PFP混合，置于96孔板中，孔板中PFP的終濃度分別為1μM、5μM、10μM、20μM、50μM和100μM。37℃培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)?？瞻讓φ諡榧尤?0μL滅菌水，其余操作與實(shí)驗(yàn)組一致。

(2)抑制生物膜效果的檢測

取出96孔板，棄去培養(yǎng)基，并用PBS洗三次除去游離的細(xì)菌。加入100μL的95體積％乙醇固定15分鐘，除去乙醇后，放置至板干。加入100μL的0.1質(zhì)量體積％結(jié)晶紫染色5分鐘，除去結(jié)晶紫，用滅菌水洗三次。加入110μL的10體積％乙酸溶解結(jié)晶紫，檢測每孔590nm處吸收值?？瞻讓φ沼洖锳₀，加入不同濃度PFP的記為A，金黃色葡萄球菌生物膜存活率(VR)根據(jù)式(II)計(jì)算，并繪制生物膜形成能力曲線，如圖1所示。

從圖1中可以看出，加入PFP后，金黃色葡萄球菌形成生物膜的能力減弱，且隨著PFP濃度的升高，PFP對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用增強(qiáng)。說明PFP能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用于說明PFP光照后產(chǎn)生的活性氧的檢測方法

還原態(tài)2,7-二氯熒光素(DCFH)的活化：在500μL的2,7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)中加入2mL的0.01M的NaOH后室溫放置30min，再加入10mL磷酸緩沖液(25mM，pH＝7.4)，混勻冰上暗處儲存待用。

向90μL活化后的DCFH溶液(40μM)加入10μL不同濃度PFP(終濃度分別為5μM、10μM和20μM)，用光密度為3mW/cm²白光光源照射樣品5min，每隔1min測525nm處的熒光值，激發(fā)波長為488nm。空白對照為90μL活化后的DCFH溶液加入10μL滅菌水在光密度為3mW/cm²的白光光源照射5min，每隔1min測525nm處的熒光值，激發(fā)波長為488nm，所得525nm處熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系見圖2。

從圖2中可以看出，PFP有很強(qiáng)的產(chǎn)生活性氧的能力，并且隨著PFP濃度的升高，產(chǎn)生活性氧的能力變強(qiáng)，可用于光照殺傷周圍細(xì)菌。

實(shí)施例5

本實(shí)施例用于說明PFP破壞生物膜的方法

(1)生物膜的形成

挑取固體培養(yǎng)基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養(yǎng)基中，37℃下轉(zhuǎn)速180rpm震蕩培養(yǎng)10h。用NB培養(yǎng)基調(diào)OD₆₀₀值為1.0，取少量菌液(10μL)稀釋100倍于TSBg培養(yǎng)基中。取100μL稀釋后的菌液置于96孔板中，37℃培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)。

(2)破壞生物膜效果的檢測

形成生物膜后，棄去96孔板中培養(yǎng)基，用PBS洗3次除去游離的細(xì)菌。加入100μL的PFP溶液(終濃度20μM)，放入37℃培養(yǎng)箱中放置15min。空白對照為加入100μL的PBS溶液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組一致。將96孔板于75mW/cm²光強(qiáng)下光照5-25min，超聲震蕩使生物膜分散。將分散后的細(xì)菌稀釋3000倍后，取100μL稀釋液鋪在NB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h后數(shù)平板上的菌落數(shù)?？瞻讓φ战M記為C₀，實(shí)驗(yàn)組記為C，抑制率(IR)根據(jù)式(III)計(jì)算，并繪制曲線，如圖3所示，

從圖3中可以看出，隨著光照時(shí)間的延長，PFP對生物膜的破壞作用增強(qiáng)。

實(shí)施例6

本實(shí)施例通過熒光顯微成像法證明PFP對生物膜破壞作用

生物膜的形成過程與實(shí)施例5的方法相同。

形成生物膜后，棄去96孔板中培養(yǎng)基，用PBS洗3次除去游離的細(xì)菌。加入100μL的PFP溶液(終濃度20μM)，放入37℃培養(yǎng)箱中放置15min。空白對照為加入100μL的PBS溶液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組一致。將96孔板于75mW/cm²光強(qiáng)下光照5-25min后，棄去PFP溶液，用PBS洗兩次后，用BacLight死活菌染色試劑盒進(jìn)行染色。最后進(jìn)行CLSM表征，采集樣品的明場和熒光場，對于SYTO9激發(fā)波長為488nm，PI為559nm。統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中綠色熒光和紅色熒光的數(shù)值，用綠色熒光值除以紅色熒光值得到活菌與死菌的比率，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，加入PFP后，隨著光照時(shí)間的延長，活菌數(shù)逐漸減少，死菌數(shù)逐漸增多，表明PFP對生物膜的破壞作用于光照時(shí)間呈正相關(guān)。

實(shí)施例7

本實(shí)施例通過電鏡說明PFP對生物膜破壞作用

(1)生物膜的形成

挑取固體培養(yǎng)基中適量ATCC 6538菌體于NB液體培養(yǎng)基中，37℃下轉(zhuǎn)速180rpm震蕩培養(yǎng)10h。用NB培養(yǎng)基調(diào)OD₆₀₀值為1.0，取少量菌液稀釋100倍于TSBg培養(yǎng)基中。取500μL稀釋后的菌液于24孔板中(提前放置好Thermanox塑料蓋玻片)，37℃培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)。

(2)電鏡成像

形成生物膜后，棄去24孔板中培養(yǎng)基，用PBS洗3次除去游離的細(xì)菌。加入500μL的PFP溶液(終濃度20μM)，放入37℃培養(yǎng)箱中放置15min?？瞻讓φ諡榧尤?00μL的PBS溶液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組一致。將24孔板于75mW/cm²光強(qiáng)下光照5-25min后，棄去PFP溶液，用PBS洗兩次后，加入含有0.5體積％戊二醛的PBS溶液，4℃固定過夜。樣品用超純水洗滌2次后，依次用體積百分含量分別為20％、40％、50％、70％、90％和100％乙醇梯度脫水，每次5min。待樣品自然干燥后，真空冷凍干燥2h，樣品噴金處理后可進(jìn)行表征。結(jié)果如圖5所示。

從圖5中可以看出，沒有光照條件下，可以看到細(xì)菌成團(tuán)且被胞外基質(zhì)緊密包裹。隨著光照時(shí)間的延長，細(xì)菌團(tuán)塊變小，并且能觀察到明顯的細(xì)菌脫落，進(jìn)一步證明了PFP產(chǎn)生的活性氧對生物膜有破壞作用。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。