本發(fā)明涉及一種牛油果種苗的培養(yǎng)方法。
背景技術：
：牛油果(avocado，alligatorpear)又稱鱷梨，學名PerseaamericanaMill.，樟科鱷梨屬常綠喬木。原產(chǎn)美洲墨西哥、厄瓜多爾、哥倫比亞等國，中美洲作為糧食食用，歐美多國視其為果中珍品。根據(jù)國際糧農組織統(tǒng)計，牛油果在世界范圍內50余個國家廣泛種植，且是其重要的農業(yè)和商業(yè)水果。牛油果果實呈梨形、橢球形或近球形，成熟時果皮淡綠、綠或暗綠，采下熟后果皮變成黃綠、乳黃、褐色或暗褐色，后熟時果肉微軟，肉色乳白、淡黃或乳黃，肉質細膩，具蛋黃味，略甜。牛油果營養(yǎng)價值高、保健效果好，其脂肪中，80％以上屬于不飽和脂肪酸，可以清除血液中的膽固醇。牛油果含糖量低(1％(w/w))，是糖尿病患者的高能食品，被稱之為保健水果。牛油果為常綠喬木，種子含油量高，也是良好的綠化樹種和油料植物。牛油果對低溫的適應能力較強，其耐寒性與柑桔相似，對土壤條件的要求不甚嚴格，在我國有非常廣闊的地區(qū)適合種植。目前，在牛油果的種苗培育過程中通常采用實生法、嫁接法和高壓法等繁殖方法進行繁殖，但這幾種方法繁殖系數(shù)較低，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)對種苗的需求。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中不足，通過組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)牛油果種苗，使單個牛油果種子在一個月內形成多株牛油果苗，實現(xiàn)提高繁殖系數(shù)，快速獲得得到大量的優(yōu)質牛油果種苗。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種牛油果種苗的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：步驟1，種子表面滅菌：依次采用70％(v/v)乙醇處理0.5-2min，1％(w/w)升汞處理1-5min，無菌水洗；步驟2，切割：橫切切除種子1/4-1/2部分，然后剩余部分不再切割，或者繼續(xù)縱切，將種子大致平分為2-8部分，并使每一部分均保有種子的胚部分；步驟3，將步驟2處理后的種子接種至培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，步驟1中，采用70％(v/v)乙醇處理1-2min。優(yōu)選地，步驟1中，采用1％(w/w)升汞處理2-5min。優(yōu)選地，步驟1中，采用70％(v/v)乙醇處理1min，1％(w/w)升汞處理2min。優(yōu)選地，步驟3中采用MS培養(yǎng)基。優(yōu)選地，步驟3中采用添加有0.2mg/L的6-BA的MS培養(yǎng)基。優(yōu)選地，步驟3中，接種時，將種子底部向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸。優(yōu)選地，步驟2中，橫切切除種子頂端部分后，繼續(xù)對種子進行1/2切割、1/4切割、或1/8切割，其中，1/2切割為縱切將種子一分為二，使每部分均保有種子的胚部分；1/4切割為在1/2切割的基礎上繼續(xù)縱切，將種子分為4部分，每部分均保有種子的胚部分；1/8切割，為在1/4切割的基礎上繼續(xù)縱切，將種子分為8部分，每部分均保有種子的胚部分。優(yōu)選地，在進行步驟1之前，將種子子葉表面凹凸不平的部分削去，使種子表面光滑平整。本發(fā)明通過組織培養(yǎng)的方法，對經(jīng)切割的牛油果種子進行培養(yǎng)，使單個牛油果種子在一個月內形成多株牛油果苗，實現(xiàn)提高繁殖系數(shù)，快速獲得得到大量的優(yōu)質牛油果種苗的目的，為我國牛油果產(chǎn)業(yè)健康快速的發(fā)展提供技術支持和保障。附圖說明圖1為牛油果種子及牛油果切割方法圖示，其中，圖A:未剝皮的牛油果種子；圖B：剝去種皮的牛油果種子；圖C：切去牛油果種子未成熟子葉頂部1/3正視圖，紅色箭頭所指為兩片未成熟子葉的中間線，也為1/2切的垂直下刀處；圖D：切去牛油果種子未成熟子葉頂部1/3側視圖；圖E：牛油果1/2切，紅箭頭所指為牛油果的胚所在地點；圖F：牛油果1/4切；圖G：牛油果1/8切正視圖；圖H：牛油果1/8切側視圖，紅色箭頭所指兩個1/8牛油果種子沒有攜帶胚組織；圖I：1/8牛油果種子放大圖，紅色箭頭所指部分為牛油果胚組織。圖2為牛油果種子不同接種方法對胚芽生長的影響，其中，圖A:胚芽軸向上，垂直插入培養(yǎng)基，胚芽剛好與培養(yǎng)基接觸；圖B：牛油果種子水平放入培養(yǎng)基；圖C：牛油果種子胚軸反向插入培養(yǎng)基；圖D：牛油果種子接種5天后生長情況，胚芽先發(fā)育；圖E：牛油果種子接種7天后生長情況；圖F：牛油果種子接種10天后生長情況，胚根生長；圖G：牛油果1/4切側視圖；圖H：牛油果1/4切底視圖，生長出四根胚根；圖I：牛油果1/4切頂視圖，生長出四根胚芽。圖3為牛油果種子再生苗胚軸及胚根生長及煉苗種植情況，其中，除圖C和圖F為1/4切割外，其他均為1/8切割，并且圖A-C為牛油果種子再生幼苗莖及葉片生長情況，圖A為正常生長情況，圖B為只留少量子葉的胚芽生長情況，圖C為多胚現(xiàn)象；圖D-F:分別為圖A-C所對應的植株根部生長情況；圖G:為煉苗后的植株；圖H：為煉苗后栽培三周的生長情況。具體實施方式下面參照附圖，結合具體的實施方式對本發(fā)明作進一步的說明，以更好地理解本發(fā)明。1材料與方法1.1材料供試牛油果購自廣西省農業(yè)科學院。1.2方法1.2.1種子清洗及去皮備用從成熟牛油果果肉中取出牛油果種子后，清洗種子外層附著的果肉；種子自然風干3天左右，搓揉去除附著在種子外表面的種皮(如圖1A圖和B圖所示)；進行組織培養(yǎng)之前，用小刀將種子子葉表面凹凸不平的部分削去，盡量使種子表面光滑平整，以利于種子表面滅菌。1.2.2種子表面滅菌通過70％(v/v)乙醇1-2分鐘、1％(w/w)升汞2-3分鐘或10％(w/w)次氯酸鈉5-10分鐘間不同的組合(如表1所示)，實現(xiàn)對牛油果種子表面滅菌的目的。各處理一周后統(tǒng)計污染率和發(fā)芽率，每個處理進行三次重復，選出牛油果種子表面滅菌的最優(yōu)方案。1.2.3牛油果種子的切割方法及接種培養(yǎng)瓶的方法牛油果種子切割方法：橫切，切去種子頂端1/3的部分，留下剩余2/3的部分備用；縱切第一刀，沿種子子葉間隙垂直向下切，將種子一分為二，使兩部分均保有種子的胚部分；縱切第二刀，將1/2的種子繼續(xù)分割為1/4，使4份均保有種子的胚胎部分；縱切第三刀，將1/4的種子繼續(xù)分割為1/8，盡量使8份均保有種子的胚胎部分。檢測不同切割方法對牛油果種子產(chǎn)生苗數(shù)量的影響(如圖1中C-I圖所示)。用鑷子夾取切好的帶胚牛油果種子接種于培養(yǎng)基，按以下三種方法接種如培養(yǎng)瓶中：一，種子底端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸(如圖2A圖所示)；二，種子平躺放在培養(yǎng)基上，使未成熟子葉和胚與培養(yǎng)基充分接觸(如圖2B圖所示)；三，種子未成熟子葉頂端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸(如圖2C圖所示)。觀察不同接種方法對出苗率的影響。將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)方法如下：將種子接種完成之后，將培養(yǎng)瓶轉入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行暗培養(yǎng)3-7天后，將培養(yǎng)瓶轉入16h光照/8h黑暗植物光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。1.2.4不同培養(yǎng)基組成對牛油果種子的發(fā)芽率的影響對比1/2MS、MS、MS添加6-BA對牛油果幼苗形態(tài)建成的影響。2結果與分析2.1種子表面滅菌對出苗率的影響通過70％(v/v)乙醇30分鐘、1分鐘、2分鐘與1％(w/w)升汞或者10％次氯酸鈉處理1分鐘、2分鐘、5分鐘不同的組合(如表1所示)，進行種子表面滅菌，然后用無菌水沖洗3次，每次1分鐘，晾干表面水分后備用。沿牛油果種子子葉間隙進行1/2切割(如圖1C圖所示)，使每半邊種子均含有胚組織(如圖1G圖所示)。子葉底端向下，垂直接種于MS培養(yǎng)基上(如圖2A圖所示)，每個組合30個樣本，16小時光照8小時黑暗，26℃植物光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一周后統(tǒng)計種子的污染率和發(fā)芽率。結果70％(v/v)乙醇與10％(w/w)次氯酸鈉的滅菌組合非常容易導致種子表面褐化，影響種子的胚部分萌發(fā)，污染率高和發(fā)芽率低。而70％(v/v)乙醇與1％(w/w)升汞的滅菌組合種子表面不會出現(xiàn)褐化，污染率和發(fā)芽率統(tǒng)計結果如表1所示，70％(v/v)乙醇處理1-2分鐘，1％(w/w)升汞處理2-5分鐘，無菌水沖洗3次，每次1分鐘，接種于MS培養(yǎng)基上，一周后污染率小于3％，發(fā)芽率高達80％以上。表1牛油果種子表面消毒結果統(tǒng)計2.2牛油果種子的切割方法及接種方法對出苗率的影響結果如圖2所示，不同的牛油果種子接種方式會明顯影響種子的發(fā)芽速度和苗的生長狀態(tài)。經(jīng)過對比試驗發(fā)現(xiàn)，種子底端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸(如圖2A圖所示)這種接種方法明顯優(yōu)于另外兩種接種方法。通過對滅過菌的牛油果種子進行不切割、對半切割、1/4切割和1/8切割后接種到MS培養(yǎng)基中，每個切割方法統(tǒng)計60個樣本，觀察一周后出胚芽比例，兩周后產(chǎn)胚根比例和30天后苗的健壯程度，平均種子產(chǎn)苗數(shù)量。結果如表2所示，由表2可知，不切割和1/8切割的種子出苗數(shù)量較少，但單個種子平均產(chǎn)苗數(shù)量以1/8切割最高。因此，以1/4切割和1/8切割這兩種方式占優(yōu)。表2牛油果種子切割對出苗率的影響不切割對半切割1/4切割1/8切割7天后產(chǎn)胚芽比例33/6046/6053/6037/6014天產(chǎn)胚根比例42/6053/6056/6041/6030天后出苗數(shù)量43555641平均每顆種子產(chǎn)苗數(shù)量0.631.833.735.472.3牛油果種子再生苗胚軸及胚根生長及煉苗種植情況參照圖3，將1/8個牛油果種子的子葉部分完全除去，只留下胚部分，接種于MS培養(yǎng)基上，也能正常形成胚芽和胚根，形成完整的小植株(如圖3中A-B所示)，但苗明顯弱于1/8切割的種子所產(chǎn)生的苗(圖A的苗明顯比圖B的粗壯，且圖A的葉片數(shù)目也明顯多于圖B)，根系數(shù)量和根系長度也明顯短(如圖3中D-E所示，與圖A苗所對應的根系圖D無論從根的數(shù)量還是根的長度明顯長于圖B苗所對應的根系圖E)。同時在牛油果種子發(fā)芽過程中也發(fā)現(xiàn)多胚現(xiàn)象，其中種子不經(jīng)切割出現(xiàn)多胚苗的比率為11.67％，經(jīng)過1/4切割和1/8切割后多胚的現(xiàn)在分別為3.33％和2.5％(如圖3中C所示)。牛油果幼苗經(jīng)過在培養(yǎng)基中30天生長后，葉片展開，根系也比較發(fā)達，經(jīng)擰松培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3-5天后，可以進行移栽(圖3中G所示)。移栽前根部用3％多菌靈沾根，移栽基質選用黑土:椰糠:蛭石＝3:2:1，移栽前期注意遮陰。2.4培養(yǎng)基對牛油果種子的出苗率和出苗質量通過對統(tǒng)計結果分析發(fā)現(xiàn)，1/2MS與MS培養(yǎng)基對出苗效率沒有顯著的差別，但1/2MS培養(yǎng)基中苗普遍弱于MS培養(yǎng)基。同時在MS培養(yǎng)基中添加0.2mg/L6-BA能顯著的提高出苗效率和出苗整齊率，如表3所示。表3不同培養(yǎng)基組成對牛油果種子繁殖系數(shù)的影響2.5不同切割后再生的牛油果幼苗生長3個月后的情況對比不同切割后再生的牛油果幼苗生長3個月后的情況，見表4。表4不同切割后再生的牛油果幼苗生長3個月后對比統(tǒng)計表植株高度、莖粗和葉片數(shù)量統(tǒng)計15株幼苗，主根長度和側根數(shù)量統(tǒng)計10株幼苗。通過分析表明，經(jīng)過切割后再生的牛油果幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)量、主根長度以及側根條數(shù)與不切割的牛油果種子產(chǎn)生的幼苗的相對應指標沒有顯著差異。實施例1從成熟牛油果果肉中取出牛油果種子后，清洗種子外層附著的果肉；種子自然風干3天左右，搓揉去除附著在種子外表面的種皮；進行組織培養(yǎng)之前，用小刀將種子子葉表面凹凸不平的部分削去，盡量使種子表面光滑平整，以利于種子表面滅菌。對種子表面滅菌，依次采用70％(v/v)乙醇處理1分鐘、1％(w/w)升汞處理2分鐘，無菌水洗3次，每次1分鐘。橫切，切去種子頂端1/3的部分，留下剩余2/3的部分備用，縱切第一刀，沿種子子葉間隙垂直向下切，將種子一分為二，使兩部分均保有種子的胚部分。用鑷子夾取切好的帶胚牛油果種子接種于添加有0.2mg/L的6-BA的MS培養(yǎng)基，種子底端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸。將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)方法如下：將種子接種完成之后，將培養(yǎng)瓶轉入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行暗培養(yǎng)3-7天后，將培養(yǎng)瓶轉入16h光照/8h黑暗植物光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。牛油果幼苗經(jīng)過在培養(yǎng)基中30天生長后，葉片展開，根系也比較發(fā)達，經(jīng)擰松培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3-5天后，可以進行移栽(圖3中G所示)。移栽前根部用3％多菌靈沾根，移栽基質選用黑土:椰糠:蛭石＝3:2:1，移栽前期注意遮陰。實施例2從成熟牛油果果肉中取出牛油果種子后，清洗種子外層附著的果肉；種子自然風干3天左右，搓揉去除附著在種子外表面的種皮；進行組織培養(yǎng)之前，用小刀將種子子葉表面凹凸不平的部分削去，盡量使種子表面光滑平整，以利于種子表面滅菌。對種子表面滅菌，依次采用70％(v/v)乙醇處理2分鐘、1％(w/w)升汞處理2分鐘，無菌水洗3次，每次1分鐘。橫切，切去種子頂端1/3的部分，留下剩余2/3的部分備用；縱切第一刀，沿種子子葉間隙垂直向下切，將種子一分為二，使兩部分均保有種子的胚部分，然后縱切第二刀，將1/2的種子繼續(xù)分割為1/4，使4份均保有種子的胚胎部分。用鑷子夾取切好的帶胚牛油果種子接種于MS培養(yǎng)基，種子底端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸。將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)方法如下：將種子接種完成之后，將培養(yǎng)瓶轉入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行暗培養(yǎng)3-7天后，將培養(yǎng)瓶轉入16h光照/8h黑暗植物光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。實施例3從成熟牛油果果肉中取出牛油果種子后，清洗種子外層附著的果肉；種子自然風干3天左右，搓揉去除附著在種子外表面的種皮；進行組織培養(yǎng)之前，用小刀將種子子葉表面凹凸不平的部分削去，盡量使種子表面光滑平整，以利于種子表面滅菌。對種子表面滅菌，依次采用70％(v/v)乙醇處理1分鐘、1％(w/w)升汞處理5分鐘，無菌水洗3次，每次1分鐘。橫切，切去種子頂端1/3的部分，留下剩余2/3的部分備用；縱切第一刀，沿種子子葉間隙垂直向下切，將種子一分為二，使兩部分均保有種子的胚部分，然后縱切第二刀，將1/2的種子繼續(xù)分割為1/4，使4份均保有種子的胚胎部分，再縱切第三刀，將1/4的種子繼續(xù)分割為1/8，使8份均保有種子的胚胎部分。用鑷子夾取切好的帶胚牛油果種子接種于添加有0.2mg/L的6-BA的MS培養(yǎng)基，種子底端向下插入培養(yǎng)基，插入深度以培養(yǎng)基上表面剛剛沒過種子的胚部分為宜，使種子的胚部分與培養(yǎng)基充分接觸。將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)方法如下：將種子接種完成之后，將培養(yǎng)瓶轉入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行暗培養(yǎng)3-7天后，將培養(yǎng)瓶轉入16h光照/8h黑暗植物光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。當前第1頁1 2 3