本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對節(jié)白蠟中具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物及其殺菌組合物。

背景技術(shù)：

農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要生產(chǎn)資料，對于保證農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)具有不可或缺的作用。我國是農(nóng)業(yè)大國，如何利用我國僅占世界7％的耕地面積來養(yǎng)活我國占世界總?cè)丝?2％的人口，是我國國民經(jīng)濟(jì)的首要任務(wù)?；瘜W(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到重要作用，但由于長期不合理使用，致使出現(xiàn)3R(Resistance，Resurgence，Residue)現(xiàn)象，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來隱患。當(dāng)今人們對環(huán)境更高要求以及食品安全的迫切需求，使得合理使用農(nóng)藥，創(chuàng)制高效、低毒、環(huán)境友好的綠色農(nóng)藥成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

植物源農(nóng)藥具有易分解、與環(huán)境相容性好、對非靶標(biāo)生物相對安全等優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)代環(huán)保和人們健康的要求，因而越來越引起人們的高度重視。我國是利用植物資源防治病蟲害最早的國家。早在周朝的《周禮秋官》中就有芥草熏殺蠹物的記載。李時珍所著的《本草綱目》記錄了不少可以用來殺蟲的植物，如百部、苦參、川楝、巴豆等。我國植物源農(nóng)藥商品化生產(chǎn)則始于新中國成立初期，其標(biāo)志性產(chǎn)品是除蟲菊素制劑、魚藤酮制劑及煙堿制劑。目前已有煙堿、除蟲菊素、百部堿、馬錢子堿、異羊角拗苷、茶皂素、蛇麻子素、莨菪烷類生物堿、瑞香狼毒等多種植物源殺蟲劑及苦參堿、黃苓苷及黃苓素、小檗堿、丁香酚、檸檬醛等植物源殺菌劑完成了登記或臨時登記。

對節(jié)白蠟(Fraxinus hupehensis)是湖北長江大學(xué)蘇丕林教授于1975年首次發(fā)現(xiàn)的白蠟屬新種，發(fā)現(xiàn)之初，僅分布于湖北省鐘祥京山大洪山南麓山丘地帶，因此又名：湖北梣、湖北白蠟、對節(jié)樹、望鄉(xiāng)樹。對節(jié)白蠟是我國二級珍稀保護(hù)植物，具有很好的應(yīng)用價(jià)值：樹皮作為中藥秦皮的來源之一，具有重要的藥用價(jià)值；對節(jié)白蠟是世界僅存的木犀白蠟名貴樹種，是世界景點(diǎn)、盆景、根雕家族的極品；對節(jié)白蠟盆景被譽(yù)為“活化石”或“盆景之王”。目前關(guān)于對節(jié)白蠟的研究主要集中在園林、園藝及景觀領(lǐng)域；對其化學(xué)成分及提取物等相關(guān)研究，僅有華中科技大學(xué)的馬力等就對節(jié)白蠟中的秦皮甲(乙)素和黃酮總量的提取、分析進(jìn)行過相關(guān)文章報(bào)道，且側(cè)重于醫(yī)藥用途。

特別引起我們注意的是，對節(jié)白蠟鮮有病蟲害，蚜蟲、螨蟲、線蟲、紅蜘蛛等均不會對其造成影響。僅是嫩芽剛出時，芽梢會偶受病蟲影響，數(shù)天后芽葉老化，危害會自動消除。白粉病、立枯病等均不對其造成危害。我們分析認(rèn)為，對節(jié)白蠟很有可能自身能夠產(chǎn)生抗蟲、抗病的活性物質(zhì)，幫助其免于病蟲害的影響。而有關(guān)對節(jié)白蠟抗蟲抗病方面的研究目前尚無報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種對節(jié)白蠟中具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物及其殺菌組合物，可作殺蟲、殺菌劑使用，用于防治農(nóng)作物病害。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種對節(jié)白蠟中具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物，該揮發(fā)性提取物是由以下方法制備得到：將對節(jié)白蠟的根、莖、葉、花和/或種子于-5～0℃下低溫粉碎處理后，加入同時蒸餾萃取裝置(SDE)中于50～150℃的溫度下進(jìn)行蒸餾萃取1～72小時，冷卻至室溫，靜置分層，取有機(jī)相，將有機(jī)相用干燥劑進(jìn)行脫水，過濾除去干燥劑，并于真空中在-100℃～30℃溫度下脫除萃取溶劑即可得到對節(jié)白蠟具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物；蒸餾萃取中用到的萃取劑選自酯、酮、醚、氯代烷烴、芳烴或烷烴。

本發(fā)明還提供了一種殺菌組合物，所述殺菌組合物由用上述所述的揮發(fā)性提取物和載體組成。

本發(fā)明殺菌組合物中的載體系滿足下述條件的物質(zhì)：它與活性成分配制后便于施用于待處理的位點(diǎn)，例如可以是植物、種子或土壤；或者有利于貯存、運(yùn)輸或操作。載體可以是固體或液體，包括通常為氣體但已壓縮成液體的物質(zhì)，通常在配制殺蟲、殺菌組合物中所用的載體均可使用。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的應(yīng)用，殺菌組合物通常加工成濃縮物的形式并以此用于運(yùn)輸，在施用之前由使用者將其稀釋。所述殺菌組合物的劑型為可濕性粉劑、顆粒劑、泡騰片劑、可乳化的濃縮劑、水乳劑、懸浮濃縮劑、氣霧劑或煙霧劑。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的用途，作為殺蟲劑、殺菌劑使用，用于防治水稻紋枯病、小麥赤霉病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的對節(jié)白蠟中提取的揮發(fā)性提取物具有廣譜的殺菌活性，可作為殺蟲、殺菌劑使用，對水稻紋枯病、小麥赤霉病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害具有較顯著的殺菌抑制作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。

本發(fā)明的一種對節(jié)白蠟中具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物，該揮發(fā)性提取物是由以下方法制備得到：將對節(jié)白蠟的根、莖、葉、花和/或種子于-5～0℃下低溫粉碎處理后，加入同時蒸餾萃取裝置(SDE)中于50～150℃的溫度下進(jìn)行蒸餾萃取1～72小時，冷卻至室溫，靜置分層，取有機(jī)相，將有機(jī)相用干燥劑進(jìn)行脫水，過濾除去干燥劑，并于真空中在-100℃～30℃溫度下脫除萃取溶劑即可得到對節(jié)白蠟具有殺菌活性的揮發(fā)性提取物；蒸餾萃取中用到的萃取劑選自酯、酮、醚、氯代烷烴、芳烴或烷烴。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述萃取劑為乙酸乙酯和乙醚的混合物。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述干燥劑為5A分子篩、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、或無水氯化鈣中的兩種或兩種以上的混合物。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，蒸餾萃取過程中，萃取溫度優(yōu)選為60℃～120℃，特別是80℃～100℃，萃取時間優(yōu)選為優(yōu)選3～24小時，特別是6～12小時。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，在真空中脫除溶劑的溫度優(yōu)選為于-50℃～0℃，特別是-30℃～-10℃。

本發(fā)明還提供了一種殺菌組合物，所述殺菌組合物由用上述所述的提取物和載體組成。

本發(fā)明殺菌組合物中的載體系滿足下述條件的物質(zhì)：它與活性成分配制后便于施用于待處理的位點(diǎn)，例如可以是植物、種子或土壤；或者有利于貯存、運(yùn)輸或操作。載體可以是固體或液體，包括通常為氣體但已壓縮成液體的物質(zhì)，通常在配制殺蟲、殺菌組合物中所用的載體均可使用。

固體載體包括：天然或合成的粘土和硅酸鹽，其中粘土中較佳為硅藻土、滑石、硅鎂土或高嶺土；硅酸鹽中較佳為碳酸鈣、硫酸鈣、氧化硅、硅酸鈣、硅酸鋁、蒙脫石或云母；元素如碳或硫；天然的或合成的樹脂如苯并呋喃樹脂；聚氯乙烯和苯乙烯聚合物或共聚物；固體多氯苯酚；瀝青；蠟如蜂蠟或石蠟。

液體載體包括：水；醇類化合物如乙醇或異丙醇；酮類化合物如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮或環(huán)己酮；醚；芳香烴化合物如苯、甲苯、二甲苯或溶劑油；石油餾分如煤油或礦物油；生物材油；通常，這些液體的混合物也是合適的。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述載體為粘土、硅酸鹽、醇類化合物、酮類化合物、樹脂、聚氯乙烯和苯乙烯聚合物或共聚物、多氯苯酚、芳香烴化合物、石油餾分、生物柴油中的一種或多種的混合物。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述粘土為硅藻土、滑石、硅鎂土或高嶺土；所述硅酸鹽為碳酸鈣、硫酸鈣、氧化硅、硅酸鈣、硅酸鋁、蒙脫石或云母。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述醇類化合物為乙醇或異丙醇；所述酮類化合物為丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、環(huán)己酮、苯、甲苯或二甲苯。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述載體中還可添加表面活性劑，少量表面活性劑的存在有助于稀釋過程。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的應(yīng)用，殺菌組合物通常加工成濃縮物的形式并以此用于運(yùn)輸，在施用之前由使用者將其稀釋。所述殺菌組合物的劑型為可濕性粉劑、顆粒劑、泡騰片劑、可乳化的濃縮劑、水乳劑、懸浮濃縮劑、氣霧劑或煙霧劑。

本發(fā)明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的用途，作為殺蟲劑、殺菌劑使用，用于防治水稻紋枯病、小麥赤霉病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害。

實(shí)施例1

將陰干的對節(jié)白蠟樹葉于0℃下低溫粉碎，準(zhǔn)確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，于250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL乙酸乙酯和乙醚的萃取溶劑，于150℃的溫度下加熱回流提取6小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機(jī)相，加入20g無水硫酸鈉和無水氯化鈣脫水30min，過濾取濾液，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍，合并濾液，濾液經(jīng)真空冷凍干燥儀于-20℃下脫除乙酸乙酯和乙醚，得到對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物。

實(shí)施例2

將陰干的對節(jié)白蠟樹葉于-5℃下低溫粉碎，準(zhǔn)確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，于250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL氯仿和乙醚的萃取溶劑，于50℃的溫度下加熱回流提取72小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機(jī)相，加入30g無水硫酸鎂和5A分子篩脫水50min，過濾取有機(jī)相，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍取濾液，合并濾液和有機(jī)相，然后經(jīng)真空冷凍干燥儀于-100℃下脫除氯仿和乙醚，得到對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物。

實(shí)施例3

將陰干的對節(jié)白蠟樹葉于-5℃下低溫粉碎，準(zhǔn)確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，于250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL丙酮和乙醚的萃取溶劑，于50℃的溫度下加熱回流提取72小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機(jī)相，加入20g無水硫酸鈉和無水氯化鈣脫水30min，過濾取有機(jī)相，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍取濾液，合并濾液和有機(jī)相，然后經(jīng)真空冷凍干燥儀于-100℃下脫除丙酮和乙醚，得到對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物。

實(shí)施例4

將陰干的對節(jié)白蠟樹葉于-5℃下低溫粉碎，準(zhǔn)確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，于250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL甲苯、新戊烷和乙醇的萃取溶劑，于80℃的溫度下加熱回流提取36小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機(jī)相，加入50g無水硫酸鈉、無水硫酸鎂和無水氯化鈣脫水20min，過濾取有機(jī)相，濾餅用10倍體積的乙醇淋洗1遍取濾液，合并濾液和有機(jī)相，然后經(jīng)真空冷凍干燥儀于30℃下脫除甲苯、新戊烷和乙醇，得到對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物。

實(shí)施例5

可濕性粉劑按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)由以下成份組成：

各組分混合在一起，在粉碎機(jī)中粉碎，直到顆粒達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例6

乳油按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)由以下成份組成：

將對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物、PEO-10及乙氧基化甘油三酸酯溶于生物柴油中，得到透明的溶液。

實(shí)施例7

水懸浮劑按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)由以下成份組成：

對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物與70％的應(yīng)加入水量以及十二烷基苯磺酸鈉在球磨機(jī)中粉碎，其他組分溶解在其余水中，攪拌加入，混合均勻得水懸浮劑。

以下以實(shí)施例1為例，對制備得到的對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物進(jìn)行成分分析和殺菌活性測定。

1、將對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物用GC-MS聯(lián)用儀對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析：

樣品處理：取0.05g對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物，加入1mL色譜純乙腈溶解，用0.45um濾膜過濾至1mL樣品瓶中，待分析。

GC-MS分析條件：色譜條件:HP-INNO-Wax彈性石英毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)；色譜柱初始溫度40℃保持2min，以6℃/min速率升溫至120℃保持2min，之后以4℃/min升溫速率升至180℃保持2min，最后以10℃/min速率升溫至280℃保持2min；進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為99.999％的氦氣，載氣流量為1.0m L/min；采用不分流模式。質(zhì)譜條件:采用EI源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，MS四極桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍:50～400amu。

采用上述條件對樣品進(jìn)行GC-MS聯(lián)用儀分析，分析結(jié)果經(jīng)NIST11譜庫檢索，并根據(jù)離子峰輔以人工解析、結(jié)構(gòu)篩選，得到對節(jié)白蠟揮發(fā)性提取物中所含化合物的結(jié)構(gòu)及含量如表1所示。

表1

2、殺菌活性測定：

實(shí)驗(yàn)方法如下：將對節(jié)白蠟殺菌活性提取物用丙酮或二氯甲烷或DMSO溶解制備成一定濃度的母液，在無菌操作條件下，把配制好的母液用培養(yǎng)基稀釋10倍制成的含毒培養(yǎng)基平板，實(shí)驗(yàn)設(shè)不含藥劑處理的空白對照，各重復(fù)3次。

按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1156.2-2006)，采用菌絲生長速率法進(jìn)行測定。將培養(yǎng)好的各種病原菌，在無菌操作條件下用直徑5mm的滅菌打孔器，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面向下，蓋上皿蓋，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

根據(jù)空白對照培養(yǎng)皿中菌落的生長情況調(diào)查病原菌菌絲生長情況，待空白對照中的菌落充分生長后，以十字交叉法測量各處理的菌落直徑，采用下面公式計(jì)算菌落增長直徑，取其平均值。

菌落增長直徑＝菌落直徑-菌餅直徑

測定結(jié)果用下列方法計(jì)算，以空白對照菌落增長直徑和藥劑處理的菌落增長直徑計(jì)算各藥劑處理對各種病原菌的菌絲增長抑制率(參見下面公式)。

菌絲生長抑制率(％)＝[(對照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/空白對照菌落增長直徑]×100

殺菌活性測試結(jié)果如表2所示：

表2

由表2可知，通過本發(fā)明的對節(jié)白蠟中制備得到的提取物對水稻紋枯病、小麥赤霉病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害具有較明顯的殺菌抑制效果。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍作出任何限制，故凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)。