本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置及檢測方法，屬于生物防蟲技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes，EPNs)是一類專門寄生昆蟲的線蟲，通過3齡感染期幼蟲對害蟲身體的自然開口或節(jié)間膜侵入的方式進(jìn)入寄主體內(nèi)，并釋放攜帶的共生細(xì)菌，使其在害蟲體內(nèi)繁殖，產(chǎn)生毒素，最終導(dǎo)致害蟲死亡。因EPNs具有寄主范圍廣泛，主動尋找寄主，對非靶標(biāo)生物安全，對環(huán)境無副作用，能與許多農(nóng)藥、肥料混用等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于防治蠐螬、地老虎、桃小食心蟲、天牛等多種農(nóng)林地下害蟲。

在應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治害蟲的過程中，如何有效地從土壤中獲得適合于地方生態(tài)條件下的線蟲品系是成功防治害蟲的關(guān)鍵。此類工作目前主要采用大蠟螟(Galleria mellonella)活體誘集的方法，具體步驟為田間取土后，將土樣分裝在塑料盒內(nèi)，再加入一定數(shù)量的大蠟螟幼蟲進(jìn)行誘集。這種方法需要經(jīng)過大蠟螟感染、解剖以及線蟲收集檢測過程，費事費力，且此方法需要占用較大試驗場地，花費大量時間來檢查實驗結(jié)果。因此極大地限制了線蟲的野外收集。

另外，在田間應(yīng)用線蟲后，需要監(jiān)測線蟲在土壤的存活情況以便決定下一次應(yīng)用的必要性、應(yīng)用實踐及用量。這一過程目前仍然采用大蠟螟活體誘集的方法，除以上的局限性外，田間取樣勢必破壞田間作物。

此外，昆蟲病原線蟲作為一種害蟲生防因子，其優(yōu)勢之一在于不僅能夠在害蟲體內(nèi)大量繁殖，而且可在土壤內(nèi)長時間存活，具有調(diào)節(jié)害蟲種群數(shù)量、持續(xù)控制害蟲的能力。因此，如何獲得不同時期內(nèi)田間使用某種線蟲品系的種群密度則是有效發(fā)揮線蟲調(diào)節(jié)害蟲種群數(shù)量、持續(xù)控制害蟲的能力又一關(guān)鍵。此類工作目前主要采用分子檢測手段，即通過實時熒光定量PCR的方法。此方法繁瑣，且費用極高，不利于大面積的推廣及應(yīng)用。

如：中國專利文獻(xiàn)CN101849534 A公開了一種昆蟲病原線蟲分離與檢測裝置，可用于土壤中昆蟲病原線蟲分離及種群密度測量。該裝置雖然不破壞作物的正常生長，但該裝置采用大蠟螟進(jìn)行誘集，誘集時間長，并且線蟲分離與密度檢測裝置分別進(jìn)行，費時費力，在應(yīng)用中存在很大的局限性，同時在實際應(yīng)用中還存在誘集的線蟲容易沿棉花逃離的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置及檢測方法。

發(fā)明概述：

本發(fā)明針對線蟲的收集及統(tǒng)計種群數(shù)量時，需要采集土樣、調(diào)查大蠟螟感染情況、解剖蟲體、破壞作用等所導(dǎo)致的費時費力的問題，提供一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，該裝置結(jié)構(gòu)簡單，誘集效率高，且線蟲不容易逃離；通過該裝置測試不同物質(zhì)對線蟲誘集能力的評價；評價韭蛆+韭菜根組合的韭蛆數(shù)量對誘集線蟲的影響；明確韭蛆+韭菜根組合誘集線蟲的最佳時間；以及檢測器放置間距的優(yōu)化；最終建立不同線蟲濃度下的誘集線蟲的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該裝置及方法可以應(yīng)用在農(nóng)業(yè)如糧食作物﹑油料作物、蔬菜作物等以及林業(yè)等多種模式下的線蟲種群檢測。同時也可以用在非耕地地塊進(jìn)行線蟲種群檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，該裝置包括兩層管狀結(jié)構(gòu)的采集管和捕捉管，采集管包括采集內(nèi)管和采集外管兩層，采集內(nèi)管和采集外管兩端均開口設(shè)置，采集內(nèi)管的底端螺紋連接有誘集網(wǎng)罩，捕捉管位于采集外管的底端并與采集外管螺紋連接，誘集網(wǎng)罩位于采集外管內(nèi)，捕捉管為上端開口、下端封閉的管狀結(jié)構(gòu)，環(huán)繞捕捉管的側(cè)壁上設(shè)有2-3個誘集孔，在捕捉管內(nèi)填充有清水，在捕捉管的內(nèi)壁上設(shè)置有密封誘集孔的無紡布，并且無紡布的下端延伸至清水中。

本發(fā)明優(yōu)選的，采集內(nèi)管與采集外管之間的間距為2～10mm。通過無數(shù)次實驗驗證，采集內(nèi)管與采集外管之間的間距對誘集效果最佳，間距過大，誘集得到的線蟲數(shù)量少，間距過大，操作不方便并且線蟲數(shù)量少。

本發(fā)明最為優(yōu)選的，采集內(nèi)管與采集外管之間的間距為4～5mm。

本發(fā)明優(yōu)選的，采集管的頂端設(shè)置有密封塞將采集管密封并將采集內(nèi)管和采集外管連接在一起。

本發(fā)明優(yōu)選的，誘集網(wǎng)罩的高度為15～20mm，誘集網(wǎng)罩的內(nèi)徑與采集內(nèi)管相匹配。

本發(fā)明優(yōu)選的，捕捉管的高度為35～45mm，捕捉管的內(nèi)徑與采集外管相匹配。

本發(fā)明優(yōu)選的，誘集網(wǎng)罩的底端距離誘集孔下端1～4mm，最為優(yōu)選的，誘集網(wǎng)罩的底端距離誘集孔下端2mm。該距離既保證了最佳的誘集效果，又有效的防止誘集的線蟲逃離。

本發(fā)明優(yōu)選的，無紡布的下端延伸至清水的長度為4～7mm，最為優(yōu)選的，無紡布的下端延伸至清水的長度為5mm。延伸的長度可以使線蟲更容易通過無紡布中水分進(jìn)行清水中，且進(jìn)入清水后線蟲再難于逃離到土壤中。

本發(fā)明優(yōu)選的，采集管的高度5～60cm。采集管的高度滿足采集不同深度土壤中的線蟲。

根據(jù)實際應(yīng)用，采集管的高度5～25cm。

本發(fā)明優(yōu)選的，誘集孔為兩個，兩誘集孔之間的間距為0.5～2mm。

利用上述昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置檢測昆蟲病原線蟲種群密度的方法，包括步驟如下：

(1)選擇需要檢測的地塊，利用線蟲種群密度檢測裝置進(jìn)行檢測；

(2)根據(jù)檢測不同深度土壤中的線蟲安裝不同型號的采集管，將采集管和捕捉管拆離，然后將誘集物質(zhì)裝入網(wǎng)罩內(nèi)，在捕捉管內(nèi)裝入清水至誘集孔處，然后將盛有清水的捕捉管與裝有誘集物質(zhì)網(wǎng)罩安裝在一起；所述的誘集物質(zhì)為韭蛆和韭菜根的組合，韭蛆與韭菜根的頭數(shù)與根數(shù)比為：(5～25)：(3～6)，韭菜根的長度為0.5～2cm；

(3)在待檢測的土壤上打一個洞，然后將步驟(2)中安裝在一起的捕捉管、采集管整體放入洞中，間隔排布檢測裝置，保證誘集最大數(shù)量的線蟲，其中采集管在上，捕捉管在下；

(4)放置40～50h后，從洞中取回檢測裝置，然后卸掉捕捉管，并將捕捉管中的水吸出后，在顯微鏡下觀察水里線蟲的個數(shù)；

(5)根據(jù)步驟(4)中觀察到的線蟲個數(shù)，計算獲得土壤中線蟲的種群密度。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(1)中待測土壤的濕度為10％-18％，氣溫在15～35℃。為了保證線蟲在此環(huán)境條件下線蟲在土壤中的擴散能力基本一致。濕度、溫度過低或過高都會影響到線蟲擴散能力，進(jìn)而影響到誘集到線蟲的數(shù)量。

本發(fā)明優(yōu)選的，韭蛆與韭菜根的頭數(shù)與根數(shù)比為：(15～25)：(4～6)，韭菜根的長度為1cm。

最為優(yōu)選的，韭蛆與韭菜根的頭數(shù)與根數(shù)比為：20：4。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(3)檢測裝置間隔排布的間距為10～14cm，每個處理重復(fù)4次進(jìn)行誘集。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(4)檢測裝置在洞中放置時間為48h。

本發(fā)明優(yōu)選的，所述韭蛆為3齡的活韭蛆。

本發(fā)明兩層管狀結(jié)構(gòu)的采集管更好利用韭蛆+韭菜根的氣味來誘集線蟲，同時大大提高線蟲的誘集效果，且阻礙了進(jìn)入捕捉管內(nèi)線蟲逃離到土壤中。將網(wǎng)罩中的大蠟螟幼蟲改進(jìn)為韭蛆+韭菜根的組合，這一設(shè)計是根據(jù)線蟲、韭蛆和韭菜根的互作關(guān)系，利用韭菜根受到韭蛆為害。

有益效果

1、本發(fā)明改進(jìn)檢測裝置，獲得一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置及其使用方法，該裝置和方法采用雙層管狀設(shè)計裝置，利用韭蛆+韭菜根釋放揮發(fā)性物質(zhì)和二氧化碳來誘集線蟲，改進(jìn)誘集孔為環(huán)繞網(wǎng)罩四周設(shè)計為2個長孔，改進(jìn)采集管結(jié)構(gòu)上無紡布條密封安裝部位使其下端浸入清水中，使線蟲更容易通過無紡布中水分進(jìn)行清水，且防止進(jìn)入清水后的線蟲再次逃離到土壤中，在此基礎(chǔ)上將采集管的高度可以設(shè)計為不同型號，滿足采集不同深度土壤中的線蟲，這些改進(jìn)提高了誘集線蟲效果，其絕對誤差最小為0.429，是CN101849534A公開裝置所檢測數(shù)量的6.75倍，表現(xiàn)出最好的檢測效果。

2、本發(fā)明裝置和方法可以取代常規(guī)用大蠟螟活體誘集線蟲的方法，解決了CN101849534A裝置中誘集效果低的問題，提高線蟲檢測效果，可實現(xiàn)實時田間監(jiān)測土壤中線蟲在數(shù)量和存活情況，且田間取樣不會破壞田間作物，具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置采集管的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置誘集網(wǎng)罩與捕捉管的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置整體結(jié)構(gòu)示意圖；

其中，1、采集管；2、捕捉管；3、密封塞；4、采集內(nèi)管；5、采集外管；6、螺絲紋；7、誘集網(wǎng)罩；8、捕捉管側(cè)壁；9、誘集孔；10、無紡布10；11、清水。

圖4不同材料對昆蟲病原線蟲誘集效果的柱狀圖；

圖5不同數(shù)量韭蛆+韭菜根組合對昆蟲病原線蟲誘集效果的柱狀圖；

圖6不同取樣時間對昆蟲病原線蟲誘集效果的曲線圖；

圖7檢測器放置間距對對昆蟲病原線蟲誘集效果的曲線圖；

圖8韭蛆+韭菜根組合對昆蟲病原線蟲誘集趨勢標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

實施例1

一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，結(jié)構(gòu)如圖1-圖3所示，該裝置包括兩層管狀結(jié)構(gòu)的采集管1和捕捉管2，采集管1包括采集內(nèi)管4和采集外管5兩層，采集內(nèi)管4和采集外管5兩端均開口設(shè)置，采集內(nèi)管4的底端螺紋連接有誘集網(wǎng)罩7，捕捉管2位于采集外管5的底端并與采集外管5螺紋連接，誘集網(wǎng)罩7位于采集外管5內(nèi)，捕捉管2為上端開口、下端封閉的管狀結(jié)構(gòu)，環(huán)繞捕捉管2的側(cè)壁上設(shè)有2個誘集孔9，兩誘集孔之間的間距為1mm，誘集孔9的寬度為10mm，在捕捉管2內(nèi)填充有清水11，在捕捉管2的內(nèi)壁上設(shè)置有密封誘集孔的無紡布，并且無紡布10的下端延伸至清水11中。

采集內(nèi)管4與采集外管5之間的間距為4mm，采集管1的頂端設(shè)置有密封塞3，將采集管密封并將采集內(nèi)管和采集外管連接在一起。

誘集網(wǎng)罩7的高度為18mm，誘集網(wǎng)罩7的內(nèi)徑與采集內(nèi)管4相匹配。捕捉管2的高度為40mm，捕捉管2的內(nèi)徑與采集外管5相匹配。

誘集網(wǎng)罩7的底端距離誘集孔9下端2mm。該距離既保證了最佳的誘集效果，又有效的防止誘集的線蟲逃離。無紡布的下端延伸至清水的長度為5mm。延伸的長度可以使線蟲更容易通過無紡布中水分進(jìn)行清水中，且進(jìn)入清水后線蟲再難于逃離到土壤中。采集管1的高度5～60cm。采集管的高度滿足采集不同深度土壤中的線蟲。

實施例2

同實施例1所述一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，不同之處在于，

采集內(nèi)管4與采集外管5之間的間距為6mm。

實施例3

同實施例1所述一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，不同之處在于，

采集內(nèi)管4與采集外管5之間的間距為2mm。

實施例4

同實施例1所述一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，不同之處在于，

誘集網(wǎng)罩7的底端距離誘集孔9下端1mm。

實施例5

同實施例1所述一種昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置，不同之處在于，

誘集網(wǎng)罩7的底端距離誘集孔9下端4mm。

室內(nèi)試驗測定

1、不同材料對昆蟲病原線蟲誘集效果的比較

選用小卷蛾斯氏線蟲Steinernema carpocapsae All泰安市綠農(nóng)生物科技有限公司有售。

將5kg滅菌土裝入圓形塑料盆中，加入無菌水和線蟲懸浮液，使土壤濕度保持在10％左右。侵染期幼蟲(IJS)按45萬IJS/m²接種線蟲，將昆蟲病原線蟲種群檢測器垂直插入塑料盒中。試驗在網(wǎng)罩中分別加入2頭大蠟螟、20頭韭蛆、機械損傷后的韭菜根、20頭韭蛆+4根1cm韭菜根以及空白對照。接種線蟲后48h調(diào)查種群檢測器內(nèi)誘集到的線蟲數(shù)量。收集到檢測器中的線蟲懸浮液在顯微鏡下計數(shù)，每個處理重復(fù)4次，檢測裝置間距為10cm。

試驗結(jié)果(圖4)表明：5個處理對昆蟲病原線蟲誘集效果差異顯著，其中在網(wǎng)罩中加入韭蛆+韭菜根組合誘集的線蟲數(shù)量顯著高于其它處理，是大蠟螟誘集數(shù)量的3.5倍以上，表明韭蛆+韭菜根組合更有利于線蟲的誘集。

2、不同數(shù)量韭蛆+韭菜根組合對昆蟲病原線蟲誘集效果的比較；

試驗在網(wǎng)罩中加入韭蛆的數(shù)量分別為5、10、20、40、80頭，在分別加入一定數(shù)量的韭菜根，其它試驗要求同試驗1。

試驗結(jié)果(圖5)表明：5個處理對昆蟲病原線蟲誘集效果不同，其中在網(wǎng)罩中分別加入20頭、40頭和80頭韭蛆+4根1cm韭菜根組合誘集的線蟲數(shù)量顯著高于加入5頭和10頭韭蛆的處理，且加入20頭、40頭和80頭韭蛆+韭菜根組合間差異不顯著。因此采用20頭韭蛆+韭菜根組合進(jìn)一步試驗。

3、不同取樣時間對昆蟲病原線蟲誘集效果的影響

試驗在網(wǎng)罩中加入20頭韭蛆+4根1cm韭菜根，分別在接種線蟲后12、24、36、48、60、72、84和96h調(diào)查種群檢測器內(nèi)誘集到的線蟲數(shù)量，其它試驗要求同試驗1。

試驗結(jié)果(圖6)表明：不同取樣時間對昆蟲病原線蟲誘集效果不同，且隨著時間的延長誘集的線蟲數(shù)量。從48h～96h取樣時，誘集的線蟲數(shù)量顯著高于12、24和36h。表明采用此檢測器最佳取樣時間為48h。

4、檢測器放置間距對昆蟲病原線蟲誘集效果的影響

試驗在網(wǎng)罩中加入20頭韭蛆+4根1cm韭菜根，檢測裝置間隔排布的間距分別為2、6、10、14、18和22cm，在接種48h后調(diào)查種群檢測器內(nèi)誘集到的線蟲數(shù)量，其它試驗要求同試驗1。

試驗結(jié)果(圖7)表明：檢測器放置間距對昆蟲病原線蟲誘集效果差異顯著，其中放置間距10～14cm時，誘集線蟲數(shù)量顯著高于其他放置間距。在放置2～6cm時，由于檢測器之間距離較近，容易造成不同檢測器間競爭；而放置距離在18～22cm時，由于檢測器之間距離較遠(yuǎn)，形成每個檢測器單打獨斗的情況，誘集數(shù)量也較低。在放置間距10～14cm時，各檢測器間可以形成良好的合作關(guān)系，發(fā)揮了韭蛆+韭菜根組合釋放揮發(fā)性物質(zhì)和二氧化碳的能力，提高了對線蟲的誘集效果。

5、韭蛆+韭菜根組合對昆蟲病原線蟲誘集趨勢標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在已優(yōu)化條件下，選擇6個不同施用密度，其中包括田間最大應(yīng)用密度和較小應(yīng)用密度，檢測進(jìn)入檢測器中的線蟲數(shù)量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在土壤中分別加入5萬、15萬、25萬、35萬、45萬和55萬/m²(分別相當(dāng)于0.34億、1億、1.6億、2.3億、3億、3.7/畝)的線蟲懸浮液，利用本發(fā)明裝置進(jìn)行回收，然后根據(jù)實際濃度梯度和回收線蟲數(shù)量通過線性回歸制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖8所示，對應(yīng)的線性方程為y＝5.138x+0.881，其中x為橫坐標(biāo)，為土壤中混入的每平方米的線蟲數(shù)，y為縱坐標(biāo)，為檢測到的線蟲數(shù)。相關(guān)系數(shù)R²＝0.9976，表明此裝置誘集效果穩(wěn)定，可以滿足田間線蟲種群密度的檢測。

田間試驗

試驗在山東省果樹所萬吉山試驗基地，土質(zhì)為疏松和通氣性好的砂壤土。

實施例6

利用實施例1的昆蟲病原線蟲種群密度檢測裝置進(jìn)行分離與檢測的方法，方法如下：

(1)選擇需要檢測的種植韭菜地塊，在韭菜地施用線蟲濃度5萬/m²，土壤濕度12％，氣溫在22℃，利用線蟲種群密度檢測裝置進(jìn)行檢測；

(2)根據(jù)檢測不同深度土壤中的線蟲安裝不同型號的采集管，將采集管和捕捉管拆離，然后將誘集物質(zhì)裝入網(wǎng)罩內(nèi)，在捕捉管內(nèi)裝入清水至誘集孔處，然后將盛有清水的捕捉管與裝有誘集物質(zhì)網(wǎng)罩安裝在一起；所述的誘集物質(zhì)為韭蛆和韭菜根的組合，韭菜根的長度為1cm；韭蛆為3齡活韭蛆，20頭，韭菜根為1cm的韭菜根，4根。

(3)在待檢測的土壤上打一個洞，然后將步驟(2)中安裝在一起的捕捉管、采集管整體放入洞中，間隔10cm排布檢測裝置，保證誘集最大數(shù)量的線蟲，其中采集管在上，捕捉管在下；

(4)放置48后，從洞中取回檢測裝置，然后卸掉捕捉管，并將捕捉管中的水吸出后，在顯微鏡下觀察水里線蟲的個數(shù)；

(5)根據(jù)步驟(4)中觀察到的線蟲個數(shù)，計算獲得土壤中線蟲的種群密度。

實施例7

同實施例1的分離與檢測方法，其他條件同實施例1，不同之處在于，檢測用的誘集物質(zhì)為5頭韭蛆+4根1cm韭菜根。

實施例8

同實施例1的分離與檢測方法，其他條件同實施例1，不同之處在于，放置檢測器間距為20cm。

實施例9

同實施例1的分離與檢測方法，其他條件同實施例1，不同之處在于，放置時間為24h。

對比例1

同實施例1的分離與檢測方法，其他條件同實施例1，不同之處在于，該方法采用CN101849534A公開的一種昆蟲病原線蟲分離與檢測裝置中的裝置進(jìn)行。

對比例2

同實施例1的分離與檢測方法，其他條件同實施例1，不同之處在于，該方法采用CN101849534A公開的一種昆蟲病原線蟲分離與檢測裝置中的裝置進(jìn)行，檢測用的誘集物質(zhì)為大蠟螟。

對比例3

同實施例1的分離與檢測方法，該方法采用本發(fā)明的裝置進(jìn)行，其他條件同實施例1，不同之處在于，檢測用的誘集物質(zhì)為大蠟螟。

試驗例

田間試驗共設(shè)7個處理，分別使用本發(fā)明裝置檢測和CN101849534A公開裝置檢測(實施例1組、實施例2組、實施例3組、實施例4組、對比例1組、對比例2組和對比例3組)。步驟分別采用實施例1、實施例2、實施例3、實施例4和對比例1組、對比例2組、對比例3組所述的方法，小區(qū)面積20m²，重復(fù)3次，每個處理重復(fù)4次，隨機取樣。具體條件步驟見表1。

表1試驗處理的方法

表2不同檢測裝置田間檢測結(jié)果對比

由表2可以看出，采用本發(fā)明裝置進(jìn)行檢測的實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、和對比例3檢測到田間線蟲數(shù)量顯著高于CN101849534A公開裝置對比例1和對比例2。采用本發(fā)明所采用的20頭韭蛆+韭菜根組合物誘集檢測的實施例1、實施例3、實施例4和對比例1所獲得的線蟲數(shù)量顯著高于采用大蠟螟作為誘集物的對比例2和對比例3。采用本發(fā)明實施例1所獲得的線蟲數(shù)量顯著高于實施例2組、實施例3組、實施例4組、對比例1組、對比例2組和對比例3組，其絕對誤差最小為0.429，是CN101849534A公開裝置所檢測數(shù)量的6.75倍，表現(xiàn)出最好的檢測效果。