本發(fā)明涉及一種攜帶增強型綠色熒光蛋白標記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構建方法，具體涉及通過顯微注射構建出增強型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因家兔，表達的增強型綠色熒光蛋白標記家兔個體的全部細胞，在藍色光的激發(fā)條件下發(fā)射出綠色熒光。
背景技術：
：綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一種在當今生命科學和醫(yī)學研究中被廣泛使用的示蹤物，由GFP基因編碼，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。基于GFP的光學成像技術使人們可以直接觀察到從微觀到宏觀各個層次上豐富多彩的生命現(xiàn)象。GFP由238個氨基酸組成，分子量為26.9kDa，最初是從維多利亞多管發(fā)光水母中分離出來的，在藍光照射下會發(fā)出綠色熒光。來源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分別有主要和次要的激發(fā)峰，它的發(fā)射峰在509nm，處于可見光譜的綠色區(qū)域(圖1)。錢永健(RogerTsien)在1995年完成GFP的單點突變。S65T突變顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，熒光強度和光穩(wěn)定性也大大增強。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應用潛力。而F64L點突變則改善了GFP在37℃的折疊能力，綜上就產(chǎn)生了增強型GFP，也就是我們常見的EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein)。GFP已被廣泛用于標記轉(zhuǎn)基因動物，如小鼠、大鼠、山羊、牛豬等。2000年在法國已制備出GFP的轉(zhuǎn)基因家兔，但迄今尚未有制備出EGFP轉(zhuǎn)基因家兔的報道。與GFP相比EGFP熒光強度和光穩(wěn)定性增強，更適用于活體標記；但較強的EGFP表達會影響胚胎的早期發(fā)育，降低轉(zhuǎn)基因動物出生率，甚至不能得到轉(zhuǎn)基因動物。因此，增強型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物的構建仍有待研究。技術實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種攜帶增強型綠色熒光蛋白標記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構建方法，其具有顯著的遺傳標記，用于區(qū)分非標記樣本(包括家兔個體、組織和細胞)為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案：一種攜帶增強型綠色熒光蛋白標記的轉(zhuǎn)基因家兔，表達的EGFP標記家兔個體的全部細胞，在藍色光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。所述的轉(zhuǎn)基因家兔由下述方法構建得到：將重組EGFP編碼基因?qū)爰彝檬芫阎校@得EGFP轉(zhuǎn)基因兔；所述重組EGFP編碼基因是pCAG-GFP質(zhì)粒通過SnaBI+HindIII雙酶切得到的2.8kbDNA片段；對仔兔進行EGFP基因鑒定或綠色熒光檢測，陽性為首建兔。首建兔與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細胞均被激發(fā)出綠色熒光。本發(fā)明還公開了用上述的轉(zhuǎn)基因家兔構建EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系的方法，是將上述獲得的首建兔與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細胞均被激發(fā)出綠色熒光。本發(fā)明通過優(yōu)化啟動子序列，應用EGFP制作出了轉(zhuǎn)基因家兔，EGFP標記的家兔可提供從宏觀(個體)到微觀(細胞)層次的直觀可見的顯著生物標記樣本。本發(fā)明由于采取以上技術方案，其具有以下優(yōu)點：(1)EGFP熒光強度和光穩(wěn)定性更強，不易被組織和細胞的背景熒光掩蓋和混淆。EGFP標記的家兔，其組織和細胞攜帶顯著的綠色熒光標記，非常容易與非標記組織和細胞區(qū)分開。(2)優(yōu)化了EGFP的啟動序列，通過縮短啟動子序列，使EGFP在胚胎中穩(wěn)定而又溫和地表達，減少其對胚胎發(fā)育的影響。提高了EFGP轉(zhuǎn)基因兔的出生率。附圖說明圖1是EGFP的表達質(zhì)粒。圖2是EGFP基因表達框。圖3是用于顯微注射的EGFP基因。圖4是家兔受精卵顯微注射過程。圖5是胚胎注射EGFP基因后被激發(fā)出綠色熒光。圖6是轉(zhuǎn)基因兔檢測到EGFP基因。圖7是轉(zhuǎn)基因兔被激發(fā)出綠色熒光。圖8是轉(zhuǎn)基因兔皮膚組織被激發(fā)出綠色熒光。圖9是轉(zhuǎn)基因兔皮膚培養(yǎng)細胞被激發(fā)出綠色熒光。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的進行詳細的描述。本發(fā)明通過顯微注射方式，將EGFP編碼基因?qū)爰彝檬芫阎?，再移植到代孕母兔體內(nèi)使其出生。(2)仔兔3周齡時，用打孔器取耳尖皮膚，于熒光顯微鏡下觀察激發(fā)的綠色熒光(3)首建兔通過與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細胞均被激發(fā)出綠色熒光。實施例1(1)EGFP表達序列的制備與優(yōu)化pCAG-GFP質(zhì)粒(Addgene,http://www.addgene.org/11150/)結構如圖1所示，包括CMV增強子、雞β啟動蛋白和CAG啟動子組成的復合啟動序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列；在大腸桿菌中擴增并大量提取pCAG-GFP質(zhì)粒。為比較啟動子序列對胚胎發(fā)育的影響，制備了兩種表達構件。常規(guī)啟動子表達構件(以下簡稱常規(guī)構件):用SpeI+hindIII雙酶切pCAG-GFP質(zhì)粒，回收得到3.1kb片段，包括CMV增強子、雞β啟動蛋白和CAG啟動子組成的復合啟動序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列。優(yōu)化啟動子表達構件(以下簡稱優(yōu)化構件)：質(zhì)粒通過SnaBI+HindIII雙酶切得到2.8kbDNA片段，包括雞β啟動蛋白和CAG啟動子組成的復合啟動序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列，如圖2所示。割膠純化EGFP基因表達片段通過瓊脂糖凝聚電泳驗證DNA的質(zhì)量，如圖3所示，用于顯微注射。(2)優(yōu)化構件與常規(guī)構件對兔胚胎影響的比較如圖3所示純化的EGFP片段，稀釋到3ng/μl。運用顯微注射的方法分別將EGFP優(yōu)化構件與常規(guī)構件注射到家兔受精卵的原核中，經(jīng)過2-4天的體外培養(yǎng)，分別記錄2細胞期、囊胚期的胚胎發(fā)育率及EGFP表達情況。實驗結果顯示，優(yōu)化構件組的胚胎顯示出更優(yōu)的發(fā)育能力，且EGFP表達比例更高(表1)。表1(3)顯微注射制備轉(zhuǎn)基因兔運用顯微注射的方法分別將上述制備的兩種EGFP基因表達構件注射到家兔受精卵的原核中，經(jīng)過短期體外培養(yǎng)后，成活的胚胎被移植到受體兔的輸卵管中，經(jīng)過約31天的妊娠，獲得基因注射兔。具體過程如下：性成熟(6月齡以上)的家兔將進行超數(shù)排卵處理，連續(xù)三天，每天兩次按劑量遞增的方式(3，3；4，4和5，5mg)實施頸皮下注射FSH(促濾泡激素)，F(xiàn)SH處理完畢后，超排母兔與公兔交配兩次，并注射100IUhCG/供體(IU國際單位，hCG人絨毛促性腺激素)。hCG處理后18-20h，從供體兔的輸卵管中沖洗出受精卵。受精卵經(jīng)15000g的條件離心7-8分鐘，充分顯示雄性與雌性原核，如圖4中A所示。整個顯微注射的過程見圖4，在明顯確立了原核膨脹后，如圖4中B和D所示，注射過的卵子移入10％FBSM199培養(yǎng)液中在38.5℃，5％CO2培養(yǎng)箱中短暫培養(yǎng)，以檢查注射胚胎的成活率和分裂的狀況，并在顯微鏡下觀察綠色熒光激發(fā)情況，如圖5所示。約15-20枚注射胚胎將被移植到經(jīng)過同期發(fā)情處理的受體母兔的輸卵管中。結果顯示，導入優(yōu)化構件的胚胎產(chǎn)子率為15.1％，共得到3個陽性的EGFP轉(zhuǎn)基因兔，總轉(zhuǎn)基因效率為5.5％(表1，n＝55)。常規(guī)構件的胚胎產(chǎn)子率為10.2％，得到1個轉(zhuǎn)基因兔，但其在出生后1周死亡。表2為EGFP轉(zhuǎn)基因兔制作效率。表2構件名稱優(yōu)化構件常規(guī)構件供體兔數(shù)量119胚胎收集數(shù)529447平均排卵數(shù)4849基因?qū)肱咛?shù)401356胚胎移植數(shù)364315受體兔數(shù)1311產(chǎn)子數(shù)5532產(chǎn)子率15.1％10.2％EGFP陽性數(shù)31(出生1周后死亡)EGFP陽性率5.5％3.1％(4)轉(zhuǎn)基因兔EGFP基因鑒定仔兔3周齡時，用打孔器取耳尖組織提取DNA，采用PCR方法鑒定EGFP基因在家兔基因組中的整合。PCR引物為GFP-F5：ACCACTACCAGCAGAACACCC(SEQIDNO.1)、GFP-R5：TTGCCAAACTCTAAACCAAATACTC(SEQIDNO.2)擴增EGFP上的564bp片段，如圖6所示，EGFP陽性圖擴增得到564bp片段，而正常家兔無任何條帶。(5)轉(zhuǎn)基因兔的綠色熒光檢測仔兔1周齡時，用紫外光源激發(fā)EGFP，如圖7所示，激發(fā)后家兔顯現(xiàn)綠色熒光。同時為進一步驗證激發(fā)光的可靠性，在仔兔3周齡時，用打孔器取耳尖組織，于熒光顯微鏡下觀察激發(fā)的綠色熒光，如圖8所示，耳尖組織顯示出亮綠色熒光。(6)EGFP兔組織及細胞綠色熒光檢測EGFP兔與正常家兔雜交3代以上，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系。子代家兔取耳尖皮膚組織進行細胞培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下驗證其組織水平和細胞水平的綠色熒光標記，如圖9所示，EGFP兔的組織和細胞均顯現(xiàn)出明亮的綠色熒光。SEQUENCELISTING<110>南京師范大學<120>一種攜帶增強型綠色熒光蛋白標記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構建方法<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1accactaccagcagaacaccc21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgccaaactctaaaccaaatactc25當前第1頁1 2 3