本發(fā)明屬魚(yú)類(lèi)生物工程與細(xì)胞工程遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及選育純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)及超雄魚(yú)大規(guī)模生產(chǎn)全雄魚(yú)的方法。
背景技術(shù)：
黃顙魚(yú)從純屬野生轉(zhuǎn)為全人工繁養(yǎng)，至今已有20年歷史。期間，凡長(zhǎng)速快、個(gè)體大的成魚(yú)多數(shù)被人們吃掉了，唯有魚(yú)篩底下長(zhǎng)速慢、個(gè)體小的級(jí)外魚(yú)（“毛毛魚(yú)”）留下來(lái)繼續(xù)養(yǎng)殖一年而供給黃顙魚(yú)孵化場(chǎng)作繁殖用的母魚(yú)，用以生產(chǎn)黃顙魚(yú)普通苗或全雄苗，加上近親繁殖，年復(fù)一年，種質(zhì)一代不如一代；另外，普通黃顙魚(yú)雌雄各半，雄魚(yú)個(gè)體與生長(zhǎng)速度是雌魚(yú)的2—3倍。雖然近五年來(lái)國(guó)內(nèi)開(kāi)始興起全雄魚(yú)養(yǎng)殖，但生產(chǎn)全雄苗所用的超雄魚(yú)YY♂供應(yīng)緊張，價(jià)格昂貴，甚至不予外供，社會(huì)上種質(zhì)混雜，不少人以假亂真，而檢測(cè)技術(shù)僅掌握在少數(shù)人之手，普通苗場(chǎng)及廣大養(yǎng)戶(hù)很難對(duì)親本YY♂及全雄苗XY♂進(jìn)行檢測(cè)鑒定。如此種種，均成為黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。因此，有必要對(duì)黃顙魚(yú)種質(zhì)進(jìn)行提純復(fù)壯生產(chǎn)純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)、超雄魚(yú)供應(yīng)各孵化場(chǎng)作繁殖純系全雄苗親本；大規(guī)模生產(chǎn)純系全雄苗供應(yīng)廣大養(yǎng)戶(hù)大面積養(yǎng)殖商品魚(yú)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要提供選育純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)及超雄魚(yú)大規(guī)模生產(chǎn)全雄魚(yú)的方法。包括以下步驟：
（1）建立純系黃顙魚(yú)種質(zhì)庫(kù)：在長(zhǎng)江水系篩選個(gè)體大、性狀優(yōu)良的野生黃顙魚(yú)成熟親魚(yú)，通過(guò)人工雌核發(fā)育，生產(chǎn)純系全雌子代XX♀，開(kāi)口四天后，提取部分子代苗獨(dú)立投喂17α—甲基睪酮藥餌或藥蟲(chóng)，將其轉(zhuǎn)性為生理雄魚(yú)XX♂，與全雌魚(yú)XX♀分別獨(dú)立培育至性成熟，XX♀與XX♂交配，規(guī)模擴(kuò)繁純系全雌魚(yú)種群；
（2）應(yīng)用GMT技術(shù)和測(cè)交技術(shù)研制黃顙魚(yú)超雄魚(yú)YY♂和超雄生理雌魚(yú)YY♀：純系全雌魚(yú)XX♀與野生原系雄魚(yú)XY雜交，獲得雜交子代XY♂和XX♀，其中XY♂和XX♀各占50%，雜交苗開(kāi)口五天后，取500尾獨(dú)立培育至性成熟，另外取500尾用EE2雌二醇藥餌或藥蟲(chóng)轉(zhuǎn)性為生理雌魚(yú)XY♀，獨(dú)立培養(yǎng)至性成熟；雜交子代XY分別與10—20尾生理雌魚(yú)交配，開(kāi)口五天后，各組均抽出500尾獨(dú)立培育成熟，另抽500尾用EE2雌二醇轉(zhuǎn)性為生理雌魚(yú)，分別獨(dú)立培育至性成熟；若母本為生理雌魚(yú)，其后代超雄魚(yú)占25%，普通雄魚(yú)占50%，雌魚(yú)占25%；若母本為正常雌魚(yú)，則子代雌雄各半；測(cè)交選出超雄魚(yú)YY♂和超雄生理雌魚(yú)YY♀。
（3）建立純系超雄魚(yú)種質(zhì)庫(kù)：生理雌魚(yú)YY♀與超雄魚(yú)YY♂雜交，子代為100%的超雄魚(yú)，開(kāi)口五天后，抽取部分投喂EE2雌二醇藥餌或藥蟲(chóng)45天，將其轉(zhuǎn)性為生理雌魚(yú)YY♀，并與未轉(zhuǎn)性的超雄魚(yú)YY♂分池培育至性成熟，二者雜交，批量繁殖超雄魚(yú)種群，儲(chǔ)備于超雄魚(yú)種質(zhì)庫(kù)；
（4）建立純系全雄魚(yú)生產(chǎn)體系：黃顙魚(yú)超雄魚(yú)YY♂與全雌魚(yú)雜交，大規(guī)模全人工繁殖純系全雄魚(yú)XY♂，供各地養(yǎng)殖戶(hù)養(yǎng)殖商品魚(yú)。
進(jìn)一步，所述EE2雌二醇藥餌的配制方法為：將EE2雌二醇激素溶于95%酒精中，配成原液，再用酒精稀釋拌入鰻料或長(zhǎng)吻鮠料中，晾干后即可獲得EE2雌二醇藥餌，其含EE2雌二醇激素量為40—60mg/kg。
進(jìn)一步，所述藥蟲(chóng)為采用含EE2雌二醇激素量為130—180μg/L的藥液浸泡1小時(shí)后濾去藥液的活豐年蟲(chóng)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
本發(fā)明針對(duì)近年來(lái)黃顙魚(yú)種質(zhì)逐代退化的現(xiàn)狀，選用長(zhǎng)江水系野生原系黃顙魚(yú)中性狀特優(yōu)的成熟親魚(yú)，進(jìn)行雌核發(fā)育，獲得純度較高的純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)XX♀，使黃顙魚(yú)種質(zhì)得以提純復(fù)壯，并應(yīng)用激素性逆轉(zhuǎn)技術(shù)獲得生理雄魚(yú)XX♂，與全雌魚(yú)XX♀雜交擴(kuò)群，規(guī)模生產(chǎn)純系全雌魚(yú)取代社會(huì)上的“毛毛魚(yú)”作為生產(chǎn)全雄苗的母本；同時(shí)，以純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)作為選育基礎(chǔ)，通過(guò)GMT技術(shù)，以及激素性逆轉(zhuǎn)與測(cè)交方法，選育出純度較高的優(yōu)質(zhì)超雄魚(yú)YY♂,與純系全雌魚(yú)XX♀交配而生產(chǎn)出的純系全雄苗XY♂種質(zhì)純正、長(zhǎng)速快、個(gè)體大而均勻、抗病力強(qiáng)，具有極強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)及抗逆性能，提高了商品魚(yú)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明為可持續(xù)發(fā)展的黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)提供了切實(shí)可行的技術(shù)路線與優(yōu)質(zhì)的健康養(yǎng)殖新品系。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施方式
參照?qǐng)D1，下面介紹申請(qǐng)人七年來(lái)關(guān)于本發(fā)明在研究與生產(chǎn)實(shí)踐中的具體操作方法。但所舉操作方法不作為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以因地、因人、因時(shí)制宜，對(duì)本發(fā)明作相應(yīng)改動(dòng)。
具體操作方法，有如下步驟：
1.建立純系全雌黃顙魚(yú)種質(zhì)庫(kù)
針對(duì)多年來(lái)各地生產(chǎn)黃顙魚(yú)普通苗及全雄苗存在的問(wèn)題，將黃顙魚(yú)種質(zhì)提純復(fù)壯，按傳統(tǒng)方法即通過(guò)選擇育種與雜交育種來(lái)構(gòu)建純系，需要經(jīng)過(guò)8—10代同胞兄弟妹交配選育，而人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育，只需經(jīng)過(guò)一次抑制第一次卵裂，就可以使基因座位全部純合，由于黃顙魚(yú)性別決定機(jī)制為雌性配子同型，所以生產(chǎn)的子代為純系全雌苗。具體操作步驟如下：
（1）魚(yú)卵采集：在長(zhǎng)江水系挑選個(gè)體粗大、性狀優(yōu)良的野生原系黃顙魚(yú)雌、雄魚(yú)親本回來(lái)進(jìn)行強(qiáng)化培育，野生原系雌魚(yú)注射催產(chǎn)激素后，達(dá)到效應(yīng)時(shí)間時(shí)人工擠出卵子；
（2）精子滅活：選取成熟的異源精子（如：南方大口鯰、長(zhǎng)吻鮠等精子），置于精子保存液稀釋?zhuān)貌ㄩL(zhǎng)2537埃的紫外線燈照射25分鐘，使精子的遺傳物質(zhì)失活即可保存?zhèn)溆茫?/p>
（3）人工授精：滅活精子與卵子混合均勻，加入4‰鹽水激活精子，刺激魚(yú)卵“受精”發(fā)育；
（4）冷休克處理：受精后1—2分鐘內(nèi)，將受精卵放進(jìn)4℃水中冷休克處理15—20分鐘，阻斷卵子減數(shù)分裂第二極體排出而恢復(fù)雌核二倍體；
（5）人工孵化：冷休克處理完畢后將魚(yú)卵取出放入25—30℃水中按正常方法人工孵化出純系全雌子代XX♀；
（6）生理雄魚(yú)制種：在全雌苗開(kāi)口五天后，取出部分苗獨(dú)立培育，投喂40天17α—甲基睪酮藥餌或藥蟲(chóng)將其轉(zhuǎn)性為生理雄魚(yú)XX♂，與未轉(zhuǎn)性的全雌苗分別獨(dú)立培育至性成熟；
（7）雜交擴(kuò)群：純系全雌魚(yú)XX♀與生理雄魚(yú)XX♂雜交擴(kuò)群，規(guī)模生產(chǎn)純系全雌苗，專(zhuān)塘培育成熟后，置于純系全雌魚(yú)種質(zhì)庫(kù)保種。
2選育優(yōu)質(zhì)黃顙魚(yú)超雄魚(yú)YY♂和生理雌魚(yú)YY♀
本發(fā)明在選育出純系全雌魚(yú)的基礎(chǔ)上，用GMT技術(shù)和性逆轉(zhuǎn)與測(cè)交方法研制出優(yōu)質(zhì)黃顙魚(yú)超雄魚(yú)和生理雌魚(yú)，具體方法如下：
（1）優(yōu)質(zhì)雄魚(yú)的選育：用純系黃顙魚(yú)全雌魚(yú)XX♀與野生原系黃顙魚(yú)雄魚(yú)雜交，獲得優(yōu)質(zhì)子代XY♂及XX♀；
（2）優(yōu)質(zhì)生理雌魚(yú)XY♀的制備：上述優(yōu)質(zhì)雜交子代保留500尾用豐年蟲(chóng)投喂五天后，提取250尾獨(dú)立培育，改投EE2雌二醇藥餌：將豐年蟲(chóng)放入劑量為150μg/L的EE2藥液中浸1小時(shí)后，濾取活蟲(chóng)投喂，日喂三次，連喂45天，將其轉(zhuǎn)性為生理雌魚(yú)XY♀，然后用普通黃顙魚(yú)飼料培育至性成熟；其余250尾未轉(zhuǎn)性的雜交苗繼續(xù)獨(dú)立培育至性成熟（當(dāng)雌雄可辨別清楚時(shí)，將其中的雌魚(yú)淘汰掉，僅保留雄魚(yú)XY♂）
（3）全雄黃顙魚(yú)YY♂與生理雌魚(yú)YY♀的制種
取兩尾發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)雄魚(yú)的精囊剪碎，用精子保存液稀釋?zhuān)糜?—7℃冰箱保存；
取10—20尾發(fā)育良好的純系“生理雌魚(yú)”，注射催產(chǎn)激素，將卵子擠出，分開(kāi)暫放，一尾一尾獨(dú)立與上述（XY♂）精子人工授精，受精卵獨(dú)立孵化，獨(dú)立培育，開(kāi)口五天后，每尾雌魚(yú)產(chǎn)出的魚(yú)苗各保留500尾，其中50%即250尾按上述方法人工雌性化后獨(dú)立培育，余下50%按常規(guī)培苗方法獨(dú)立培育。
將以上各組魚(yú)苗用小網(wǎng)箱獨(dú)立培育至可分清雌雄后，檢查不轉(zhuǎn)性的各組魚(yú)中的雌雄比例。若雌雄各50%左右，則該母本為XX♀，其母本及子代（含已雌性化的子代）全部淘汰；若雌雄比例為1:3，則該母本為XY♀，子代中存在25%超雄魚(yú)YY，應(yīng)將這尾雌魚(yú)產(chǎn)出的子代（含已轉(zhuǎn)性和未轉(zhuǎn)性?xún)刹糠郑┆?dú)立培育成熟。
（4）測(cè)交選出純系黃顙魚(yú)超雄魚(yú)YY♂和生理雌魚(yú)YY♀
候選雄魚(yú)YY♂，與普通雌魚(yú)XX♀1:1配對(duì)繁殖，親本及子代均獨(dú)立培育至子代可分清雌雄，若子代為全雄魚(yú)，則該尾雄魚(yú)為超雄魚(yú)YY♂，否則淘汰；
候選生理雌魚(yú)YY♀與普通雄魚(yú)XY♂人工繁殖出子代獨(dú)立培育，若子代全部為雄魚(yú)，則該尾雌魚(yú)為超雄生理雌魚(yú)YY♀，否則淘汰。
3.建立純系超雄黃顙魚(yú)YY♂和YY♀種質(zhì)庫(kù)
將選出的超雄魚(yú)YY♂和超雄生理雌魚(yú)YY♀人工繁殖，所產(chǎn)子代全部為超雄魚(yú)，按上述方法將部分YY♂人工雌性化變?yōu)槌凵泶启~(yú)YY♀，培育成熟后就可以批量擴(kuò)群，儲(chǔ)存于超雄黃顙魚(yú)種質(zhì)庫(kù)。
4.大規(guī)模生產(chǎn)純系全雄黃顙魚(yú)魚(yú)苗
當(dāng)種質(zhì)庫(kù)儲(chǔ)備有足夠的黃顙魚(yú)超雄魚(yú)YY♂和全雌XX♀成熟親魚(yú)后，就可以在繁殖季節(jié)大規(guī)模全人工繁殖純系全雄黃顙魚(yú)魚(yú)苗供應(yīng)各地養(yǎng)戶(hù)。一尾超雄魚(yú)YY♂可與100—350萬(wàn)粒純系全雌魚(yú)魚(yú)卵交配授精，若親魚(yú)培育良好，受精率與孵化率均在95%以上。
上述方法中，EE2雌二醇藥餌的配制方法為：將EE2雌二醇激素溶于95%酒精中，配成原液，再用酒精稀釋拌入鰻料或長(zhǎng)吻鮠料中，晾干后即可獲得EE2雌二醇藥餌，其含EE2雌二醇激素量為40—60mg/kg。
上述方法中，所述藥蟲(chóng)為采用含EE2雌二醇激素量為130—180μg/L g/L的藥液浸泡1小時(shí)后濾去藥液的活豐年蟲(chóng)。
經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以豐年蟲(chóng)為激素載體比投喂藥餌效果更佳。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，只要以基本相同手段實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。