本發(fā)明涉及一種通過(guò)組織培養(yǎng)的技術(shù)再生的方法，特別是涉及一種用于冰菜的通過(guò)組織培養(yǎng)的技術(shù)再生的方法。

背景技術(shù)：

隨著生物科學(xué)的發(fā)展和世界耕地及林地等鹽漬化程度的日益加重，引進(jìn)耐鹽品種和提高植物耐鹽性的研究越來(lái)越受到重視，冰菜汁液中含有一定的鹽分，在鹽堿地改良、食用等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

目前冰菜大規(guī)模生產(chǎn)中，培養(yǎng)基質(zhì)中的含鹽量不易控制，且采用常規(guī)的種子和莖段組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，效果并不理想，或者是所得植株不夠健壯，或者是長(zhǎng)勢(shì)不佳，培育出的冰菜口感也不好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決的以上技術(shù)問(wèn)題，而提供的一種冰菜種子和莖段組織培養(yǎng)的方法，本發(fā)明的冰菜種子組織培養(yǎng)的方法出芽率高、長(zhǎng)勢(shì)好，本發(fā)明的冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法得到的冰菜株高和鮮重均顯著高于常規(guī)方法。本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中加入鹽溶液的培養(yǎng)方法，得到在較高含鹽量(0.9％)的條件下生長(zhǎng)良好的冰菜組培苗，并將其應(yīng)用于耐鹽生產(chǎn)。

本發(fā)明涉及一種冰菜種子組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺(tái)中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無(wú)菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無(wú)菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干水分；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25～30℃；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9～1％。

優(yōu)選地，所述步驟三中，培養(yǎng)過(guò)程中冰菜種子出芽前為避光，出芽后光照強(qiáng)度為2000-3000Lx，光照周期12h/12h。

優(yōu)選地，所述步驟三中，接種量為每瓶6粒冰菜種子。

本發(fā)明還涉及一種冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、接種材料的制備：取冰菜種子接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長(zhǎng)1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2000-3000Lx；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9～1％。

優(yōu)選地，所述步驟三中，光照周期12h/12h。

優(yōu)選地，所述步驟三中，接種量為每瓶2個(gè)接種材料。

本發(fā)明的冰菜種子和莖段組織培養(yǎng)的方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：

1.本發(fā)明的冰菜種子培養(yǎng)的方法出芽率高、長(zhǎng)勢(shì)好，本發(fā)明的冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法得到的冰菜株高和鮮重均顯著高于常規(guī)方法。本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中加入鹽溶液的培養(yǎng)方法，得到在較高含鹽量(0.9％)的條件下生長(zhǎng)良好的冰菜組培苗，并將其應(yīng)用于耐鹽生產(chǎn)

2.本發(fā)明的方法培養(yǎng)得到的冰菜帶有大量冰晶，略帶咸味；移栽后產(chǎn)量高。

3.本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，易操作掌握，效果顯著，具有很好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例和驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的冰菜種子和莖段組織培養(yǎng)的方法作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的冰菜種子組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺(tái)中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無(wú)菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無(wú)菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干水分；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養(yǎng)溫度為25℃，避光培養(yǎng)1天，冰菜種子出芽；然后調(diào)整光照強(qiáng)度為2000Lx，光照周期12h/12h，繼續(xù)培養(yǎng)41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜組培苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的冰菜種子組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺(tái)中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無(wú)菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無(wú)菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干水分；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養(yǎng)溫度為28℃，避光培養(yǎng)1天，冰菜種子出芽；然后調(diào)整光照強(qiáng)度為3000Lx，光照周期12h/12h，繼續(xù)培養(yǎng)41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜幼苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的冰菜種子組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺(tái)中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無(wú)菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無(wú)菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干水分；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養(yǎng)溫度為30℃，避光培養(yǎng)1天，冰菜種子出芽；然后調(diào)整光照強(qiáng)度為2500Lx，光照周期12h/12h，繼續(xù)培養(yǎng)41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜組培苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95％。

對(duì)實(shí)施例1-3中得到的冰菜幼苗進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果如表1所示。

接種7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和死亡率，NaCl脅迫42d后，分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的株高(去掉根系從莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的長(zhǎng)度)和鮮重(將植株去掉根系，稱量鮮重)。

出芽率(％)＝出芽株數(shù)/接種株數(shù)×100％

成活率(％)＝成活株數(shù)/接種株數(shù)×100％

株高＝總高度/接種株數(shù)，取各瓶平均數(shù)

鮮重＝總的鮮重/接種株數(shù)，取各瓶平均數(shù)

表1實(shí)施例1-3中所得幼苗的出芽率、成活率、株高和鮮重

實(shí)施例4

本實(shí)施例的冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、接種材料的制備：取冰菜組織接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長(zhǎng)1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶2個(gè)接種材料，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，光照周期12h/12h；培養(yǎng)42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜組培苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％。

實(shí)施例5

本實(shí)施例的冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、接種材料的制備：取冰菜組織接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長(zhǎng)1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶2個(gè)接種材料，培養(yǎng)溫度為30℃，光照強(qiáng)度為3000Lx，光照周期12h/12h；培養(yǎng)42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜組培苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。

實(shí)施例6

本實(shí)施例的冰菜莖段組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

一、培養(yǎng)基的配制：調(diào)整MS培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養(yǎng)基中加入NaCl，并調(diào)整pH值為5.8，得到冰菜培養(yǎng)基；

二、接種材料的制備：取冰菜種子接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長(zhǎng)1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；

三、接種、培養(yǎng)：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養(yǎng)基上，接種量為每瓶2個(gè)接種材料，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2500Lx，光照周期12h/12h；培養(yǎng)42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長(zhǎng)健壯的冰菜組培苗；

其中，步驟一的冰菜培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％；瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75％；NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95％。

對(duì)實(shí)施例1-3中得到的冰菜組培苗進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果如表1所示。

NaCl脅迫培養(yǎng)結(jié)束后，分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的株高(去掉根系從莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的長(zhǎng)度)和鮮重(將植株去掉根系，稱量鮮重)。

株高＝總高度/接種株數(shù)，取各瓶平均數(shù)

鮮重＝總的鮮重/接種株數(shù)，取各瓶平均數(shù)

表2實(shí)施例4-6中所得組培苗的株高和鮮重

驗(yàn)證試驗(yàn)1

分別將實(shí)施例1-3培養(yǎng)得到的冰菜幼苗和實(shí)施例4-6培養(yǎng)得到的冰菜組培苗在含0.9％鹽營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行水培，并結(jié)合冰菜生長(zhǎng)發(fā)育的特性，控制溫度、濕度、光照、pH值、EC值、鹽濃度等各項(xiàng)影響因子，具體按以下步驟進(jìn)行。

移栽：采用海綿作為栽培基質(zhì)。

提前一天準(zhǔn)備兩塊育苗專用十字海綿(如無(wú)十字，可用剪刀按6cm×6cm剪出十字)，進(jìn)行清洗，即將海綿放到加水的無(wú)孔育苗盤，反復(fù)擠壓后，更換新水，放置一夜，備用。

水培槽中加入營(yíng)養(yǎng)液，水位離種植板約1cm的距離。半個(gè)小時(shí)后測(cè)電導(dǎo)度和pH值，調(diào)節(jié)Ec值為1200μs/cm左右，pH值在6.5-7.2之間(用硝酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值)。

第二天用鑷子將組培苗插入海綿十字處，每十字處放1顆苗，帶海綿栽到種植板上，種植板上開(kāi)直徑3cm的種植孔，孔距14cm，每孔栽一個(gè)苗，根系接觸到清水。

栽植后管理：

營(yíng)養(yǎng)液的管理：緩苗后開(kāi)始添加鹽溶液，鹽濃度為0.6％-0.9％，調(diào)好定時(shí)器，白天每隔50min供液1次，每次供液10min。每天要巡視系統(tǒng)水位。在定植緩苗后每周補(bǔ)充水槽里蒸發(fā)掉的水份和營(yíng)養(yǎng)液，約一個(gè)月補(bǔ)充一次Na的水溶液。根據(jù)水槽中水量加入粗鹽或食鹽使?fàn)I養(yǎng)液中NaCl濃度約為0.9％。

環(huán)境條件控制：氣溫白天控制在20-30℃，夜間15-18℃。高溫季節(jié)重點(diǎn)是遮陽(yáng)、降溫。冬春季節(jié)白天氣溫保持在17-22℃，夜溫約15℃。營(yíng)養(yǎng)液溫度15-22℃；濕度控制在70％-90％；光強(qiáng)控制在3 000-15000lx。

分栽：待植物長(zhǎng)滿種植版，相互遮陰時(shí)分栽，隔一個(gè)種植孔取出一個(gè)苗，取出的苗移栽到新的育苗版上，增大植物的生長(zhǎng)空間；及時(shí)摘掉病葉。

采收：定植30天后即可采收，在早晨溫度較低時(shí)先輕輕地摘下植株下部的大葉片，再采收側(cè)枝(要求嫩枝長(zhǎng)15cm以上)，生長(zhǎng)盛期每15d收獲1次，分別碼好放在包裝盒或筐內(nèi)。

結(jié)果：

在含有0.9％NaCl溶液中，以上實(shí)施例1-6中培育得到的冰菜幼苗和組培苗成活率高，冰菜生長(zhǎng)旺盛，冰晶明顯，口感好，產(chǎn)量高，具體數(shù)值如表3所示。

表3本發(fā)明培養(yǎng)得到幼苗移栽水培后的成活率和產(chǎn)量

通過(guò)以上驗(yàn)證試驗(yàn)可知，本發(fā)明方法培育得到的冰菜幼苗和冰菜組培苗在含鹽(NaCl)量0.9％的水溶液中生長(zhǎng)健壯、產(chǎn)量高，所得冰菜的冰晶明顯、口感好；所述本發(fā)明培育得到的冰菜幼苗和冰菜組培苗耐鹽性強(qiáng)。

驗(yàn)證試驗(yàn)2

不同NaCl濃度脅迫下冰菜種子的出芽率和成活率

設(shè)置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗(yàn)證不同濃度的NaCl脅迫下冰菜種子的出芽率和成活率；其他參數(shù)與實(shí)施例1的方法相同。

冰菜種子用10％的次氯酸鈉溶液表面消毒15分鐘，效果很好，無(wú)污染，經(jīng)觀察，接種第二天25瓶都有種子出芽，出芽率50-70％不等。第一周無(wú)死亡現(xiàn)象，出芽率和成活率見(jiàn)表1。第二周以后開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)不均衡現(xiàn)象，個(gè)別苗生長(zhǎng)緩慢，甚至黃化死亡，存活下來(lái)的苗生長(zhǎng)健壯，葉片肥大，莖粗壯。每瓶存活數(shù)越少，存活的苗子越健壯。全部苗都存活的瓶苗相對(duì)細(xì)弱，葉片小。

表4不同NaCl脅迫冰菜的發(fā)芽率和成活率

注：與對(duì)照的差＝處理-對(duì)照

由表1可以看出只有NaCl濃度為0.6％(T2)出芽率和成活率超過(guò)對(duì)照，達(dá)到最高，其它處理均低于對(duì)照，NaCl濃度為1.2％(T4)出芽率最低；NaCl濃度為0.9％(T3)成活率與對(duì)照持平，而Nacl濃度為0.3％(T1)成活率最低。但成活下來(lái)的苗生長(zhǎng)健壯。冰菜可以在NaCl濃度為0-1.2％范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但達(dá)到1.2％時(shí)出芽率和成活率開(kāi)始下降。

驗(yàn)證試驗(yàn)3

不同NaCl濃度脅迫下冰菜種子培養(yǎng)組胚苗的株高和鮮重

設(shè)置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗(yàn)證不同濃度的NaCl脅迫下組培苗的株高和鮮重；其他參數(shù)與實(shí)施例1的方法相同。

表5不同NaCl脅迫冰菜的株高和鮮重

注：與對(duì)照的差＝(處理-對(duì)照)/對(duì)照×100％

接種后第一周，對(duì)照植株最高，NaCl濃度越高，植株越矮。第一周株高Nacl濃度為1.2％(T4)與對(duì)照相差高達(dá)63.6％。經(jīng)觀察子葉全部展開(kāi)，但NaCl濃度越高，子葉越小。以后差異變小。至第六周，Nacl濃度為0.3％(T1)株高和鮮重最大，原因是T1瓶苗成活率低，生長(zhǎng)空間大，生長(zhǎng)健壯，單株株高和重量大。株高除T4外其它處理均高于對(duì)照，最高T1高出對(duì)照13.6％，T4株高和鮮重最小，較對(duì)照低27.1％。各處理單株鮮重均高于對(duì)照，T1最大，高于對(duì)照57.6％，其次T3高于對(duì)照52.9％。T4與對(duì)照差異最小，高于對(duì)照7.9％。

驗(yàn)證試驗(yàn)4

不同NaCl濃度脅迫下冰菜莖段培養(yǎng)組培苗的株高和鮮重

設(shè)置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗(yàn)證不同濃度的NaCl脅迫下冰菜莖段培養(yǎng)組培苗的株高和鮮重；其他參數(shù)與實(shí)施例4的方法相同。

表6 NaCl脅迫對(duì)冰菜株高和鮮重的影響

注：與對(duì)照的差＝(處理-對(duì)照)/對(duì)照×100％

莖段培養(yǎng)成活率均為100％，培養(yǎng)6周后，各處理株高和單株鮮重均高于對(duì)照，Nacl濃度為0.9％(T3)瓶苗株高和單株鮮重均最大，株高高出對(duì)照46.9％，單株鮮重高出對(duì)照90.8％。T1與對(duì)照相差最小，株高為4.9％，鮮重為0.7％。T2和T4與對(duì)照相差較小，株高分別為33.3％和46.9％；單株鮮重分別為27.7％和26.1％。

經(jīng)觀察，T3的瓶苗冰晶最明顯，生長(zhǎng)健壯。所有處理的瓶苗株高和單株鮮重均比對(duì)照大，生長(zhǎng)健壯。說(shuō)明冰菜不僅耐鹽，而且在培養(yǎng)基中適度添加Nacl溶液，有利于生長(zhǎng)。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書(shū)限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式作出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。