本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法。
背景技術(shù)：
精液冷凍保存與人工受精技術(shù)在現(xiàn)代化畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著舉足輕重的作用，應(yīng)用冷凍精液進(jìn)行人工授精可以不受時(shí)間、地域、品種及個(gè)體的限制，并且大量減少公畜的飼養(yǎng)數(shù)量，降低生產(chǎn)成本，提高優(yōu)良種公畜的利用率，提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。我國(guó)在奶牛及肉牛上應(yīng)用冷凍精液技術(shù)及人工授精技術(shù)已發(fā)展的較為完善，在奶山羊人工授精技術(shù)推廣過(guò)程中，由于市場(chǎng)上奶山羊人工授精的稀釋液效果不佳，使得人工授精技術(shù)推廣困難重重?，F(xiàn)有的奶山羊稀釋液在人工授精的精液稀釋環(huán)節(jié)存在以下問(wèn)題：精液稀釋倍數(shù)低，通常只能稀釋3倍左右；精液稀釋后精子存活時(shí)間短，一般在12-24小時(shí)以內(nèi)，精液稀釋24小時(shí)后精子活力降低，在0.3以下；人工授精母羊受胎率低，一般在65％左右。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，以克服現(xiàn)有的奶山羊稀釋液精液稀釋倍數(shù)低、精液稀釋后精子存活時(shí)間短、稀釋后精子活力低和人工授精母羊受胎率低的問(wèn)題。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，稱取葡萄糖3～5g，檸檬酸鈉1～2g和乙二胺四乙酸二鈉0.05～0.2g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03～0.10ml維生素C，0.01～0.5ml維生素B12，0.01～0.5ml催產(chǎn)素和0.01～0.5ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；
步驟4，配置精液稀釋液
將基礎(chǔ)液、保護(hù)液和營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶，其溶質(zhì)為脫脂后的新鮮羊奶，溶劑為蒸餾水。
步驟4中，按質(zhì)量百分比，稱取60～80％的基礎(chǔ)液，5～15％的保護(hù)液和15～25％的營(yíng)養(yǎng)液，以上各組份的質(zhì)量百分比總和為100％；將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
本發(fā)明的有益效果是，精液稀釋倍數(shù)可高達(dá)30倍，精液稀釋后保存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)120小時(shí)，精液稀釋24小時(shí)后精子活力達(dá)到0.5-0.7，精液稀釋120小時(shí)后精子活力仍然保持在0.3-0.4，保證母羊人工授精配種受胎率在85％以上；且稀釋液配置方法簡(jiǎn)單，便于技術(shù)人員掌握，能有效提升養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益及人工授精鮮精技術(shù)的推廣。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，稱取葡萄糖3～5g，檸檬酸鈉1～2g和乙二胺四乙酸二鈉0.05～0.2g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中再加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03～0.10ml維生素C，0.01～0.5ml維生素B12，0.01～0.5ml催產(chǎn)素和0.01～0.5ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為35～40℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；另外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶，其溶質(zhì)為脫脂后的新鮮羊奶，溶劑為蒸餾水。
步驟4，配置精液稀釋液
按質(zhì)量百分比，稱取60～80％的基礎(chǔ)液，5～15％的保護(hù)液和15～25％的營(yíng)養(yǎng)液，以上各組份的質(zhì)量百分比總和為100％；將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
基礎(chǔ)液中，葡萄糖不僅充當(dāng)精子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)它還可以有效的抑制卵磷脂酶的活性，防止精液中溶血卵磷脂的積累。由于葡萄糖是小分子物質(zhì)，可明顯改變稀釋液的滲透壓，可對(duì)精子起到保護(hù)作用；檸檬酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉，主要作用是緩沖精子在稀釋保存過(guò)程中由于代謝產(chǎn)生的廢物使精液的pH改變而對(duì)精子活力所帶來(lái)的不良影響，還可以緩和稀釋液中離子對(duì)精子的損害作用，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間；恩諾沙星為微黃色或淡黃色結(jié)晶性粉末，半衰期長(zhǎng)，在動(dòng)物體內(nèi)有良好的組織分布性，屬于廣效性抑菌劑，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌具有抑菌作用。
保護(hù)液中，乙二醇是比較理想的精子低溫保護(hù)劑，可以滲入到精子細(xì)胞內(nèi)部，調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓的平衡，對(duì)精子起保護(hù)作用；維生素C是一種抗氧化劑，保護(hù)精子免于自由基的威脅，同時(shí)也作為一種輔酶，參與精子的各種代謝；維生素B12是一種生理活性物質(zhì)，作為精子中幾種變位酶的輔酶，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，提高精卵結(jié)合機(jī)率；催產(chǎn)素和前列腺素可提高母畜受胎率：促進(jìn)母畜子宮平滑肌收縮，提高精子運(yùn)動(dòng)速度，防止精液倒流，有效促進(jìn)精卵結(jié)合機(jī)率。
營(yíng)養(yǎng)液中，脫脂羊奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，對(duì)維持精液pH和鰲合一些金屬離子有很好的作用，并能有效的延緩精液保存時(shí)低溫打擊，顯著提高稀釋后的精子活力；硫酸卡那霉素為氨基糖甙類廣譜抗生素，主要對(duì)革蘭陰性菌及耐藥性強(qiáng)的金葡菌也有良好的抗菌作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1
一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為40℃的條件下，稱取葡萄糖3g，檸檬酸鈉2g和乙二胺四乙酸二鈉0.1g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中再加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為40℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.1ml維生素C，0.15ml維生素B12，0.01ml催產(chǎn)素和0.08ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為40℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；
步驟4，配置精液稀釋液
按質(zhì)量百分比，稱取70％的基礎(chǔ)液，10％的保護(hù)液和20％的營(yíng)養(yǎng)液，將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
實(shí)施例2
一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為35℃的條件下，稱取葡萄糖3.5g，檸檬酸鈉1.5g和乙二胺四乙酸二鈉0.05g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中再加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為35℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.08ml維生素C，0.5ml維生素B12，0.1ml催產(chǎn)素和0.01ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為35℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；另外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶，其溶質(zhì)為脫脂后的新鮮羊奶，溶劑為蒸餾水。
步驟4，配置精液稀釋液
按質(zhì)量百分比，稱取60％的基礎(chǔ)液，15％的保護(hù)液和25％的營(yíng)養(yǎng)液，將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
實(shí)施例3
一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為37℃的條件下，稱取葡萄糖4.8g，檸檬酸鈉1.2g和乙二胺四乙酸二鈉0.18g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中再加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為37℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.04ml維生素C，0.01ml維生素B12，0.36ml催產(chǎn)素和0.5ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為37℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；另外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶，其溶質(zhì)為脫脂后的新鮮羊奶，溶劑為蒸餾水；
步驟4，配置精液稀釋液
按質(zhì)量百分比，稱取80％的基礎(chǔ)液，5％的保護(hù)液和15％的營(yíng)養(yǎng)液，將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
實(shí)施例4
一種奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液的制備方法，其具體操作步驟如下：
步驟1，配置基礎(chǔ)液
在環(huán)境溫度為38℃的條件下，稱取葡萄糖5g，檸檬酸鈉1g和乙二胺四乙酸二鈉0.2g，將這三種物質(zhì)倒入一個(gè)容器中，向容器中加蒸餾水至100ml，攪拌均勻，得到混合溶液；再向該混合溶液中再加入恩諾沙星，攪拌均勻，得到基礎(chǔ)液；每100mL混合溶液中加入5000UG恩諾沙星；最后將基礎(chǔ)液在4℃低溫保存；
步驟2，配置保護(hù)液
在環(huán)境溫度為38℃的條件下，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙二醇溶液；再往乙二醇溶液中加入維生素C、維生素B12、催產(chǎn)素和前列腺素；每1ml乙二醇溶液加入0.03ml維生素C，0.3ml維生素B12，0.5ml催產(chǎn)素和0.27ml前列腺素，得到保護(hù)液；將保護(hù)液在4℃低溫保存；
步驟3，配置營(yíng)養(yǎng)液
在環(huán)境溫度為38℃的條件下，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶中加入硫酸卡那霉素，得到營(yíng)養(yǎng)液；其中，100ml體積脫脂羊奶加入10萬(wàn)IU硫酸卡那霉素；將營(yíng)養(yǎng)液在4℃低溫保存；另外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的脫脂羊奶，其溶質(zhì)為脫脂后的新鮮羊奶，溶劑為蒸餾水；
步驟4，配置精液稀釋液
按質(zhì)量百分比，稱取65％的基礎(chǔ)液，13％的保護(hù)液和22％的營(yíng)養(yǎng)液，將這三種物質(zhì)在4℃低溫的無(wú)菌條件下混合攪拌均勻，得到奶山羊人工授精技術(shù)用稀釋液。
使用方法：1.采集種公羊精液；2.在顯微鏡下觀察此精液是否符合要求，篩選出合格的公羊精液，合格要求為：新鮮精液活力大于0.8且密度大于2.0×109個(gè)/mL的精液；3.在4℃的低溫環(huán)境下，將本發(fā)明稀釋液和精液按30:1的比例混合，稀釋后的有效精子數(shù)在0.6×108個(gè)/mL以上。
將本發(fā)明稀釋液和精液混合后，進(jìn)行4℃低溫?zé)o菌環(huán)境存儲(chǔ)，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的存儲(chǔ)，檢測(cè)出稀釋后精子的性能如表1所示：
表1精液稀釋性能測(cè)試
精子存活時(shí)間：精子存活時(shí)間是指精子在一定條件下精子的總存活時(shí)間，與受精能力有關(guān)，存活時(shí)間越長(zhǎng)，精子受精能力越強(qiáng)。精子存活時(shí)間＝第一次檢查時(shí)間至倒數(shù)第二次檢查之間的時(shí)間間隔+最后一次與倒數(shù)第二次檢查時(shí)間間隔的一半。
精子存活指數(shù)：精子存活指數(shù)是精子存活時(shí)間和精子存活率兩種指標(biāo)的綜合反映。精子存活指數(shù)＝相鄰前后兩次檢查的精子平均活力與其間隔時(shí)間的乘積相加的總和。
從表1我們可以看出，用本發(fā)明稀釋液對(duì)合格的奶山羊精液稀釋后，在4℃低溫?zé)o菌的存儲(chǔ)條件下，可保存120個(gè)小時(shí)；120小時(shí)內(nèi)，稀釋的精液完全符合授精要求。
另外，本稀釋液屬于鮮精稀釋液，鮮精技術(shù)配置的精液是液體狀。
在奶山羊場(chǎng)人工授精過(guò)程中，種羊精液用30倍體積本發(fā)明稀釋液稀釋，母羊發(fā)情后，早晚各輸精一次：母羊全群受胎率在85％以上，同母羊自然交配的受胎率無(wú)顯著差異，精液稀釋120小時(shí)，精子活力仍然保持在0.3-0.4，1000只母羊一個(gè)月配種全部結(jié)束，僅僅7只種公羊循環(huán)使用，就能滿足配種需要，而且不影響種公羊生產(chǎn)性能。