本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)害蟲防治領域，更具體地涉及一種防治亞洲玉米螟的生物制劑法。

背景技術：

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis屬鱗翅目、草螟科，廣泛分布于亞洲和大洋洲的大部分國家，在我國亞洲玉米螟的分布較為廣泛，從東北一直到海南都有其分布。是我國玉米生產(chǎn)上主要的害蟲是嚴重影響玉米產(chǎn)量和質量。

為了保證玉米的質量和產(chǎn)量，通過農(nóng)藥防治亞洲玉米螟是常用的手段，常規(guī)的農(nóng)藥包括化學農(nóng)藥和生物農(nóng)藥。生物農(nóng)藥是指利用生物活體(真菌，細菌，昆蟲病毒，轉基因生物，天敵等)或其代謝產(chǎn)物(信息素，生長素，萘乙酸鈉，2，4-D等)針對農(nóng)業(yè)有害生物進行殺滅或抑制的制劑，又稱天然農(nóng)藥。相對于化學農(nóng)藥，生物農(nóng)藥更加環(huán)保，且對人的危害小。

球孢白僵菌Beauveria bassiana是研究和應用較多的一種重要昆蟲病原真菌，寄主范圍廣，可寄生于15個目的700余種昆蟲中。其不但能夠寄生昆蟲，而且當生態(tài)系統(tǒng)中缺乏昆蟲寄主時，能夠在不同的環(huán)境中營腐生活。球孢白僵菌因其具有物理防治害蟲、易于培養(yǎng)、對環(huán)境不產(chǎn)生污染等特點，還具有對人畜安全、能夠循環(huán)再侵染害蟲的優(yōu)點，已成為生物防治研究的熱點之一。從目前國內外對球孢白僵菌應用范圍的研究看，它不僅可以替代傳統(tǒng)化學農(nóng)藥殺害昆蟲，也可用于醫(yī)藥等行業(yè)。球孢白僵菌是生物防治亞洲玉米螟中應用最廣泛的蟲生真菌，不同劑型的球孢白僵菌產(chǎn)品在玉米主產(chǎn)區(qū)已廣泛應用。

在我國東北選用該球孢白僵菌防治亞洲玉米螟的主要方法有噴霧法、噴粉法、顆粒劑法，防治時期為春季封垛期和玉米心葉期。

球孢白僵菌到現(xiàn)在為止生產(chǎn)上面臨一些問題，其中一個最重要的問題就是真菌殺蟲劑用于害蟲大規(guī)模防治效果遲緩而不穩(wěn)定，導致工業(yè)化、標準化及對劑型加工等方面均存在困難，影響了生物制劑的推廣。另外，在田間應用時，田間環(huán)境多為低濕高溫環(huán)境，不利于孢子萌發(fā)及長出菌絲侵染蟲體， 溫度、濕度和光照時間等因素，都會使白僵菌在田間應用及其效果發(fā)揮受到較大限制。而且，隨著我國秸稈還田的推廣，農(nóng)村玉米垛的減少，使利用白僵菌封垛的引用面積減少。因此，需要提供一種球孢白僵菌生物制劑，該制劑的球孢白僵菌能夠適應田間環(huán)境，具有良好的孢子萌發(fā)及長出菌絲的效果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個技術問題在于提供一種球孢白僵菌顆粒劑，該制劑的球孢白僵菌能夠適應田間環(huán)境，具有良好的孢子萌發(fā)及長出菌絲的效果。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下述技術方案：

一種球孢白僵菌顆粒劑，其通過如下方法制備得到：

將球孢白僵菌或球孢白僵菌孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中；在25℃、絕對濕度為100％的環(huán)境中發(fā)酵7天；其中，

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法為：每升PD培養(yǎng)基中添加4g的葡萄糖、0.4g的磷酸二氫鉀、0.2g的硫酸鎂、0.1g的硫酸鋅、8mg的維生素B₁、1000g的玉米秸稈顆粒和1.2升的水。

所述球孢白僵菌為MAT1-2基因標記的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，菌名為GZ01，分類名為：球孢白僵菌Beauveria bassiana，已于2016年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC No.12471。

本申請將所獲得的球孢白僵菌顆粒劑命名為球孢白僵菌GZ01顆粒劑。

玉米秸稈顆粒為玉米秸稈粉碎獲得的顆粒，顆粒過60目篩網(wǎng)。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明的球孢白僵菌顆粒劑具有能夠適應田間低濕高溫環(huán)境，高效感染玉米螟，具有高效的抗蟲效果。本發(fā)明的球孢白僵菌顆粒劑對于對田間玉米植株均對2代亞洲玉米螟種群具有控制作用，也就是說球孢白僵菌對亞洲玉米螟生長發(fā)育的治病影響是一個緩慢的過程，對于存活下來的幼蟲在這個越冬過稱中有著持續(xù)控制的潛力。

附圖說明

下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出田間采集植株根莖葉MAT1-2型基因片段電泳檢測。

圖2示出田間采集亞洲玉米螟僵蟲MAT1-2型基因片段電泳檢測。

圖3示出田間采集幼蟲解滯育后僵蟲MAT1-2型基因片段電泳檢測。

圖4示出田間采集植株根莖葉球孢白僵菌宿存量。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：配制球孢白僵菌顆粒劑

1)配制PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮切碎，稱取1000g，加4000m去離子水，煮沸30min，過濾除渣，取過濾液加入75g葡萄糖，高壓下蒸氣滅菌20min。

2)配置PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮切碎，稱取1000g加4000m去離子水，煮沸30min，過濾除渣，在過濾液中加入75g葡萄糖，加入100g瓊脂粉，高壓下蒸氣滅菌20min，冷卻到50℃，在無菌操作臺中將培養(yǎng)基導入無菌培養(yǎng)皿中。

3)在PDA平板培養(yǎng)基上接種球孢白僵菌，并于25℃培養(yǎng)7天。

4)配制發(fā)酵培養(yǎng)基：在5L液體PD培養(yǎng)基中加入20g葡萄糖、2g磷酸二氫鉀、1g硫酸鎂、0.5g硫酸鋅、40mg維生素B₁、5000g玉米秸稈顆粒和6L無菌水，混合均勻。

5)將PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的球孢白僵菌分生孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻；

6)將接種的球孢白僵菌分生孢子于25℃、絕對濕度(RH)為100％的條件下發(fā)酵7天，即獲得球孢白僵菌顆粒劑。

所述球孢白僵菌為含有MAT1-2基因標記的球孢白僵菌，本申請將菌種命名為球孢白僵菌GZ01，所制得的顆粒劑為球孢白僵菌GZ01顆粒劑。

實施例2：球孢白僵菌顆粒劑的效果實驗

1.植物施菌

在伊通靠山鎮(zhèn)伊通植保站試驗地進行，玉米栽培品種為先玉335，采用大壟雙行種植，一壟為一個試驗組，試驗組內隨機選取40株玉米植株，在玉米植株三葉期時在植株近根部挖10-15cm深坑，在坑內放置約125g球孢白僵菌 GZ01顆粒劑，使所述顆粒劑與玉米植株的根部接觸，然后在坑上輕輕覆蓋一層土。

2.植物接蟲

人工飼養(yǎng)的亞洲玉米螟成蟲產(chǎn)卵后，將帶卵塊的蠟紙剪下，放入保濕的1.5mL透氣離心管中，每個離心管放入一個標準卵塊(約60粒卵)，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(26±1℃)，待卵塊黑頭后，接入田間處理玉米植株的新葉上。在隨機選取的對照組玉米植株和試驗組標記的玉米植株，在玉米七葉期或抽雄時接亞洲玉米螟黑頭卵塊。

3.根莖葉內生菌的檢測(PDA法)

玉米植株長成(玉米成熟期時)后，分別采集試驗組玉米植株和對照組玉米植株的根莖葉。選取試驗組植株的葉片，每組隨機采集的4個樣品進行內生菌檢測，每個樣品重復檢測3次，將每片玉米植株葉片剪成1cm×1cm 4小片，用鑷子將小片浸于0.5％的NaCl溶液中2min，再浸入70％乙醇中2min，無菌鑷子取出小葉片，將其平貼于PDA平板培養(yǎng)基上，將每4個小片置于同一平板，用封口膜封口后室溫下放置3天后，連續(xù)觀察長菌的小葉片數(shù)量和菌落的形態(tài)，將獲得的菌落提取其DNA，并進行PCR鑒定。

選取試驗組和對照組玉米植株莖部，每組隨機采集的4個樣品進行內生菌檢測，每個樣品重復檢測3次，將每株玉米的莖剪成2cm，4個小段，處理及培養(yǎng)方法同植株葉片。

選取試驗組和對照組玉米植株須根，每組隨機采集的4個樣品進行內生菌檢測，每個樣品重復檢測3次，將每株玉米的須根剪成2cm，4個小段，處理及培養(yǎng)方法同植株葉片。

球孢白僵菌菌株的DNA提取具體方法如下：

1)平板球孢白僵菌菌粉100mg液氮研磨成粉末；

2)置于預先加入600μl提取液的2.0mL離心管中靜置2min，其中所述提取液的組成包括如下成分：1％SDS，0.5M NaCl，0.2M Tris-HCl，0.01M EDTA，pH8.0；

3)加入100μl的10％SDS，充分混勻后加入300μl氯化卞，劇烈震蕩混勻；

4)在50℃中水浴1h，水浴中不用顛倒；

5)加入100μl的3M NaAC溶液，冰浴15min，然后在12000rpm條件下離心10min；

6)吸取上清液轉入新的離心管，加入等體積Tris-飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，12000rpm離心10min；

7)取上清，在上清中加入10μl的RnaseA(100ng/μl)，并在65℃水浴30min；

8)加入等體積Tris-飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，12000rpm條件下離心10min；

9)加入2倍體積的冰預冷無水乙醇，溫和的翻轉，室溫下沉淀30min，12000rpm離心10min；

10)棄上清保留沉淀，以70％乙醇洗沉淀物，在12000rpm的條件下離心3min，洗滌1-2次；

11)干燥后加TE溶解DNA，作為模板，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

12)進行PCR鑒定。

PCR反應體系如下：

PCR反應程序設置為：94℃預變性5min，每次循環(huán)94℃1min，48℃1min，72℃1min，最后72℃延伸10min，共30次循環(huán)，保存于4℃。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測

電泳結果見圖1。圖1中泳道M為分子量標記物，泳道Y1和Y2為田間采集植株葉片的DNA電泳檢測，J1和J2為田間采集植株莖部DNA電泳檢測，G1和G2為田間采集根部DNA電泳檢測，J11為葉片對照組，G12為莖部對照組，以上檢測樣品均證明為試驗組的玉米植株的根莖葉中具有球孢白僵菌GZ01，表明球孢白僵菌GZ01內生于實驗組玉米植株的根莖葉中。圖4表明球孢白僵菌的宿存量分別為根的宿存量為95％，莖的宿存量為75％，葉的宿存量為55％。

根的宿存量＝產(chǎn)生白僵菌菌落的根的數(shù)量/被檢測的根的總量；

莖的宿存量＝產(chǎn)生白僵菌菌落的莖的數(shù)量/被檢測的莖的總量；

葉的宿存量＝產(chǎn)生白僵菌菌落的莖的數(shù)量/被檢測的葉的總量。

4.田間采集亞洲玉米螟僵蟲及亞洲玉米螟幼蟲解滯育后僵蟲電泳檢測

玉米植株(玉米成熟期時)長成后，剝莖收集試驗樣地試驗組玉米植株 和對照組玉米植株上亞洲玉米螟幼蟲和亞洲玉米螟僵蟲，將所有亞洲玉米螟幼蟲和亞洲玉米螟僵蟲帶回實驗室。

通過PCR的方法檢測亞洲玉米螟僵蟲體內的球孢白僵菌是否含有MAT1-2基因(檢測方法同上)，結果如圖2所示，泳道1、2和3為采集試驗組亞洲玉米螟僵蟲DNA電泳檢測結果，4、5和6為采集對照組亞洲玉米螟僵蟲DNA電泳檢測結果。試驗組的亞洲玉米螟僵蟲作為PCR模板時都出現(xiàn)陽性結果，而對照組則結果為陰性，表明試驗組亞洲玉米螟僵蟲感染球孢白僵菌GZ01，對照組感染的不是球孢白僵菌GZ01。

將實驗組的亞洲玉米螟幼蟲培養(yǎng)于實驗室，此時亞洲玉米螟處于滯育階段，當亞洲玉米螟處于滯育階段時，亞洲玉米螟體內感染的球孢白僵菌也將停止繁殖。將滯育的玉米螟在實驗室解滯育。亞洲玉米螟解滯育也會激活球孢白僵菌繁殖，使亞洲玉米螟幼蟲死亡，成為亞洲玉米螟僵蟲。通過PCR的方法檢測亞洲玉米螟僵蟲體內是否感染了球孢白僵菌GZ01，檢測的基因為MAT1-2基因。結果見圖3，泳道1-8為采集亞洲玉米螟幼蟲解滯育后所得僵蟲DNA電泳檢測，證明球孢白僵菌GZ01導致亞洲玉米螟幼蟲死亡。說明此試驗方法已經(jīng)能夠實現(xiàn)對亞洲玉米螟的防治。

5.對亞洲玉米螟生存狀態(tài)檢測

玉米植株長成后，剝莖，收集試驗組玉米植株和對照組玉米植株上存活的玉米5齡螟幼蟲、蛹和亞洲玉米螟僵蟲，記錄亞洲玉米螟的平均成活率、平均化蛹率和白僵菌僵蟲數(shù)量。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel軟件分析，用one-way ANOVA進行方差分析。結果見表1.

表1顯示了試驗玉米植株上亞洲玉米螟的存在狀況。

注：表中比率指該蟲體數(shù)占各組整個蟲體的百分率。

結果表明，試驗組和對照組的亞洲玉米螟幼蟲平均成活率分別為96.06％和97.84％，化蛹率分別為3.15％和0.72。

在雌穗成熟的末期，試驗組和對照組亞洲玉米植株球孢白僵菌感染率分 別為0.79％、1.44％。雖然使用試驗組玉米植株感染球孢白僵菌的百分比低于對照組，但隨著時間的推移，經(jīng)過滯育-解滯育的過程后，試驗組的亞洲玉米螟幼蟲被感染率會明顯地增高為18.90％，而對照組沒有明顯變化。這表明球孢白僵菌GZ01在整個內生階段中沒有起到明顯地治病作用，但對于對田間玉米植株均對2代亞洲玉米螟種群具有控制作用，也就是說球孢白僵菌對亞洲玉米螟生長發(fā)育的治病影響是一個緩慢的過程，對于存活下來的幼蟲在這個越冬過稱中有著持續(xù)控制的潛力。

6.球孢白僵菌GZ01顆粒劑對亞洲玉米螟幼蟲生長發(fā)育影響檢測

玉米植株長成后，剝莖，收集試驗組和對照組玉米植株上存活的亞洲玉米螟幼蟲，稱量每頭蟲子體重。結果見表2。

表2施用球孢白僵菌GZ01顆粒劑對亞洲玉米螟幼蟲生長發(fā)育影響

蛀孔在不同試驗組玉米植株上分布的比較

表2結果顯示：施用球孢白僵菌GZ01顆粒劑的試驗組亞洲玉米螟幼蟲的平均體重為0.0162±0.0008g，而未施用的對照組幼蟲的平均體重為0.2530±0.0015g(表2)。施用球孢白僵菌GZ01顆粒劑極顯著地抑制亞洲玉米螟的生長發(fā)育(t＝5.4205，p<0.01)。

7.玉米植株蛀孔分布情況分析

玉米植株長成后，剝莖收集對照組和試驗組地玉米植株上存活的亞洲玉米螟幼蟲，記錄被害植株蛀孔數(shù)、蛀孔位置；然后統(tǒng)計計算出試驗組和對照組玉米樣地被害植株在各莖節(jié)的分布情況、平均蛀孔量。采用SPSS16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析，用one-way ANOVA進行方差分析。結果見表3.

表3顯示了玉米植株蛀孔分布情況。結果表明，試驗組玉米植株幼蟲危害的蛀孔數(shù)相對來說略少，亞洲玉米螟幼蟲危害的蛀孔在玉米雄穗柄至雌穗下第7節(jié)均有分布，其中以雌穗著生節(jié)(含穗柄)及其上、下1-3節(jié)上蛀孔最多。在此范圍內，試驗組和對照組組玉米植株上平均分布比率為7.84％、9.98％，試驗組比對照組平均分布比率低2.14％。蛀孔在雌穗以上莖節(jié)上的分布比率為4.41％、4.81％；蛀孔在雌穗以下莖節(jié)上的分布比率為6.89％、6.56％， 分別高出雌穗以上莖節(jié)上的分布比率為2.48％、1.75％。其中試驗組雌穗以上莖節(jié)與對照組雌穗以上莖節(jié)蛀孔的平均分布比率相比較，前者為3.61％，后者為4.81％.綜合以上數(shù)據(jù)分析得出，試驗組植株蛀孔總量少于對照組，試驗組比對照組危害較低。

表3亞洲玉米螟幼蟲危害蛀孔在不同試驗組玉米上的分布

注：表中比率指該部位蛀孔數(shù)占整株株孔的百分率；上1-上6和下1-下7分布指雌穗著生節(jié)以上和以下的1-7莖節(jié)。

8.玉米植株上蛀孔長度的比較

玉米植株長成后，剝莖收集試驗組玉米植株上存活的亞洲玉米螟幼蟲，記錄被害植玉米株平均蛀孔總隧道和平均隧道長度。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel軟件分析，用one-way ANOVA進行方差分析。

表4不同玉米組織亞洲玉米螟幼蟲蛀孔長度的比較

注：表內數(shù)據(jù)為平均值±SD，同列相同字母的不同處理間在0.05水平上差異不顯著，Duncan，s新復極差檢驗。

表4顯示了玉米植株上蛀孔長度的比較狀況。結果表明，試驗組和對照組玉米植株蛀孔平均長度分別為3.21cm和3.75cm，差異顯著(p<0.05)。由此可見，試驗組植株受害平均蛀孔長度小于對照組，也就是說，試驗組玉米植株上蛀孔數(shù)量較多，但是平均蛀孔長度較短；而對照組玉米植株上蛀孔位置數(shù)量較少，但是平均蛀孔長度較長。

在試驗組玉米植株中不同部分受害程度也是不同的。在雌穗和雌穗下莖兩部分，試驗組的蛀孔長度均比對照組分別高出79.5cm和53.1cm，試驗組受害植株平均蛀孔長度與對照組相比差異不顯著(p>0.05)。與之相反，在雌穗上莖、雌穗節(jié)和雌穗柄三個部分，對照組蛀孔長度均比試驗組分別高出126.4cm、4.3cm和11.8cm，雌穗上莖接種組受害植株平均蛀孔長度與對照組差異顯著(p<0.05)，雌穗節(jié)和雌穗柄接種組受害植株平均蛀孔長度與對照組差異不顯著(p>0.05)。綜合以上數(shù)據(jù)分析得出，因為植株下莖水分較多，所以雌穗節(jié)下莖蛀孔長度明顯大于雌穗節(jié)上莖；試驗組在雌穗上莖、雌穗節(jié)和雌穗柄三個部分防效效果相對好于對照組，而試驗組植株的雌穗和雌穗下莖的防效效果相對對照組較差。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。