本發(fā)明涉及魚類養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及魚類養(yǎng)殖中的魚苗選育領(lǐng)域，具體的說，是一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育及驗證方法。

背景技術(shù)：

我國已成為世界農(nóng)業(yè)大國。水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要組成部分，同時也帶動了地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，養(yǎng)殖魚類的選育是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。現(xiàn)在大多不具規(guī)模的水產(chǎn)養(yǎng)殖均采用魚種結(jié)合的養(yǎng)殖方法，對魚苗的密度進(jìn)行有效計算，對魚苗本身的選育工作研究及較少，如此以來，投放的魚苗并非全優(yōu)狀態(tài)，即出現(xiàn)一些耐氧性、耐熱性不強的魚在環(huán)境驟變的情況下發(fā)生死亡的情況或者在同樣的養(yǎng)殖條件下生長性能差，導(dǎo)致成本投入和產(chǎn)量不成正比的問題。大規(guī)模養(yǎng)殖或水產(chǎn)研究機構(gòu)現(xiàn)有的選育方法多是依據(jù)形態(tài)特征來進(jìn)行選育的，其選育過程費時費力、選育效果不穩(wěn)定性、選育的周期長，一般將在20年以上、地域限制性大、驗證選育效果較難等特征。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)已有細(xì)胞、生化、分子等多方面涉及于魚類選育工作，但多集中于對魚類生長性能能的選育。由于不同地域水域環(huán)境不盡相同，現(xiàn)有選育過程并沒有將魚類對各種水域環(huán)境的耐受能力作為選育的目標(biāo)，因此，將不同魚類自身的選育結(jié)合養(yǎng)殖水域、環(huán)境耐受能力進(jìn)行綜合選育養(yǎng)殖魚種魚苗對于可持續(xù)發(fā)展養(yǎng)殖具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育及驗證方法，用于解決現(xiàn)有的魚苗選育容易導(dǎo)致魚種對不同環(huán)境下的水域適應(yīng)性差，例如：耐氧性、耐寒性、耐熱性等適應(yīng)能力差而導(dǎo)致生長性能不好甚至死亡的問題。本發(fā)明能夠綜合基于魚種本身的特性和水域環(huán)境的特點進(jìn)行綜合選育并提供一種對所述選育方法的驗證方法。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育方法，是根據(jù)不同魚種和不同水域環(huán)境的特性，從普通魚苗中選育出對環(huán)境抗逆性強，生長快且具有優(yōu)良基因的魚苗個體，包括以下步驟：

1.1建立親魚基礎(chǔ)群親本F0，通過親魚基礎(chǔ)群F0培育出一齡種魚F1并制作親本F0基因庫；

1.2選取一定數(shù)量的6-8月齡的種魚F1分別建立實驗群進(jìn)行培育；

1.3培育完畢后，建立各實驗群中優(yōu)良基因魚苗個體F1基因庫；

1.4通過對種魚F1基因庫與親本F0基因庫進(jìn)行對比確定實驗群中優(yōu)良基因魚苗個體對應(yīng)的親魚基礎(chǔ)群親本F0。

優(yōu)選地，所述步驟1.1具體如下：

1.11對所述親魚基礎(chǔ)群親本F0進(jìn)行選育，選育的標(biāo)準(zhǔn)為：體型均勻、無畸形，游動活潑，個體體重高于群平均體重10％-20％，雌雄搭配比為2:3-2:4之間；

1.12親魚基礎(chǔ)群親本F0養(yǎng)殖區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)為：單個養(yǎng)殖池面積為3-4畝，水深1.5-2米，池底平坦；

1.13親魚基礎(chǔ)群親本F0投放密度標(biāo)準(zhǔn)為：按照重量計算每畝投放100-130千克親魚；

1.14通過采用PIT電子標(biāo)記為每條親魚設(shè)置不同的編號并剪取部分鰭條，用無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.15在交配期間采用注射或投放催產(chǎn)激素，通過人工受精獲得不同家系受精卵，卵膜破裂4天后，各家系取20000尾混合統(tǒng)一池塘培育，并孵化獲得不同家系魚苗，將各家系魚苗培育至夏花階段后，平均分配到多個池塘進(jìn)行種魚F1培育。

優(yōu)選地，所述步驟1.2具體如下：

1.21將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能優(yōu)良，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的20％-30％、健康無病、無畸形的個體，對生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，剪取魚種F1-A的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.22將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行不同溫度的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高溫耐受實驗存活下來魚種F1-B的部分胸鰭和低溫耐受實驗存活下來的魚種F1-b，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.23將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行高鹽度的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高鹽耐受實驗存活下來魚種F1-C的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.24將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行不同溶氧的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高溶氧耐受實驗存活下來育種F1-D的部分鰭條和低溶氧耐受實驗存活下來育種F1-d的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.25將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行水體PH的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取耐酸性PH實驗存活下來育種F1-E的部分鰭條和耐堿性PH實驗存活下來育種F1-e的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.26將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行饑餓耐受實驗，實驗結(jié)束后對實驗魚進(jìn)行形態(tài)測量和體重稱量，剪取存活下來減重低于平均減重15-20％的魚種F1-F的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.27將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行抗病能力實驗，實驗結(jié)束后剪取抗病能力實驗存活下來魚種F1-G的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆谩Ｖ档谜f明的是：多數(shù)魚類常見病多由嗜水氣單胞菌引起，固大多數(shù)抗病能力實驗以嗜水氣單胞菌進(jìn)行抗病能力實驗，目的是為了選擇抗病能力好的個體，以保留抗病能力強的親本進(jìn)行優(yōu)選。

優(yōu)選地，所述步驟1.3具體包括：將所述步驟1.21-1.27步驟中獲得的F1基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)F1-A、F1-B、F1-b、F1-C、F1-D、F1-d、F1-E、F1-e、F1-F、F1-G作為優(yōu)良基因魚苗個體F1基因庫。

優(yōu)選地，所述步驟1.4具體包括：通過魚種親子鑒定的多重PCR微衛(wèi)星序列和Cervus3.0軟件根據(jù)F1-A、F1-B、F1-b、F1-C、F1-D、F1-d、F1-E、F1-e、F1-F、F1-G確定對應(yīng)的親本個體基因F0-A、F0-B、F0-b、F0-C、F0-D、F0-d、F0-E、F0-e、F0-F、F0-G，確定優(yōu)質(zhì)親本魚苗，其余未被選擇的親本標(biāo)記為F0-remain。所述Cervus3.0軟件為推斷親緣關(guān)系的軟件，屬于現(xiàn)有技術(shù)，在此對于Cervus3.0軟件確定親本F0與親本后代F1的對應(yīng)關(guān)系步驟和原理不做詳細(xì)闡述。

值得說明的是：多重PCR技術(shù)和Cervus3.0軟件均屬于現(xiàn)有技術(shù)。

一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育的驗證方法，包括以下步驟：

6.1第二年將F0-A、F0-B、F0-b、F0-C、F0-D、F0-d、F0-E、F0-e、F0-F、F0-G分別與F0-remain進(jìn)行人工受精，建立對照群體f1-A、f1-B、f1-b、f1-C、f1-D、f1-d、f1-E、f1-e、f1-F、f1-G和f1-remain；

6.2從步驟6.1所述的對照群體f1-A、f1-B、f1-b、f1-C、f1-D、f1-d、f1-E、f1-e、f1-F、f1-G和f1-remain中選取6-8月齡魚種各2000尾進(jìn)行生長數(shù)據(jù)測量，并進(jìn)行抗逆性實驗，按照所述步驟1.21-1.27進(jìn)行，對比選擇培育的親本后代與非選育親本后代的生長性能能，抗病性能和抗逆性能，以驗證確定選育親本的后代較非選育后代之間存在明顯的生長和抗逆性差異。

6.3所述步驟6.2中生長穩(wěn)定、抗逆性好的品系對應(yīng)親本F0為目標(biāo)選育種魚，淘汰生長慢抗逆性不好的品系。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明通過對親本標(biāo)記再采用人工受精的方式獲得親本后代F1，利用F1的交叉人工受精獲得親本中的一切優(yōu)質(zhì)品種家系，再通過多重PCR微衛(wèi)星序列和Cervus3.0軟件技術(shù)獲得優(yōu)質(zhì)品種的親本，在投放魚苗時根據(jù)養(yǎng)殖水域的特點選擇適合的各親本在該養(yǎng)殖水域養(yǎng)殖具有生長快、抗病性強和抗逆特性好的特點，避免了現(xiàn)有技術(shù)選育魚種對于環(huán)境抗逆性差，生長緩慢，易病甚至死亡的問題。

(2)本發(fā)明的選育的時間周期短，因不同養(yǎng)殖水域和魚種生長特點不同，一般周期為2-4年即可完成優(yōu)質(zhì)魚種的選育，與現(xiàn)有技術(shù)相比，在時間周期上得到了明顯的縮短。

(3)本發(fā)明還提供了對選育優(yōu)質(zhì)魚種進(jìn)行驗證的方法，能夠?qū)⑦x育得到的優(yōu)質(zhì)魚種進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，能夠剔除和淘汰掉因偶然機會和遺傳不穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)魚種，確保投放魚種均具有較好的生長性能和對環(huán)境的抗逆性。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

首先對本發(fā)明中涉及的相關(guān)名詞及現(xiàn)有技術(shù)解釋如下：

一齡種魚：將夏花經(jīng)過3～5個月的飼養(yǎng)，體長達(dá)到10cm以上，稱為一齡魚種或仔口魚種。

夏花：魚苗下池后，經(jīng)20—30天的飼養(yǎng)，體長達(dá)3厘米左右的稚魚，因出塘正值夏季，故稱夏花。

PCR：PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60℃左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72℃左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。

多重PCR：多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。一般PCR僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。

PIT電子標(biāo)記：PIT魚類射頻標(biāo)記是市場主流的用于魚類和野生動物研究的標(biāo)記，這些標(biāo)記被壓縮裝入玻璃膠囊，每個標(biāo)記具有唯一性。

實施例：

為了更進(jìn)一步的解釋和說明本發(fā)明，下面以我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常見的魚種草魚為例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育方法，是根據(jù)不同魚種和不同水域環(huán)境的特性，從普通魚苗中選育出對環(huán)境抗逆性強，生長快且具有優(yōu)良基因的魚苗個體，包括以下步驟：

1.1建立親魚基礎(chǔ)群親本F0，通過親魚基礎(chǔ)群F0培育出一齡種魚F1并制作親本F0基因庫；

1.2選取一定數(shù)量的6-8月齡的種魚F1分別建立實驗群進(jìn)行培育；

1.3培育完畢后，建立各實驗群中優(yōu)良基因魚苗個體F1基因庫；

1.4通過對種魚F1基因庫與親本F0基因庫進(jìn)行對比確定實驗群中優(yōu)良基因魚苗個體對應(yīng)的親魚基礎(chǔ)群親本F0。

本實施例中，所述步驟1.1具體如下：

1.11對所述親魚基礎(chǔ)群親本F0進(jìn)行選育，選育的標(biāo)準(zhǔn)為：體型均勻、無畸形，游動活潑，個體體重高于群平均體重10％-20％，雌雄搭配比為2:3-2:4之間；

1.12親魚基礎(chǔ)群親本F0養(yǎng)殖區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)為：單個養(yǎng)殖池面積為3-4畝，水深1.5-2米，池底平坦；

1.13親魚基礎(chǔ)群親本F0投放密度標(biāo)準(zhǔn)為：按照重量計算每畝投放100-130千克親魚；

1.14通過采用PIT電子標(biāo)記為每條親魚設(shè)置不同的編號并剪取部分鰭條，用無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.15在交配期間采用注射或投放催產(chǎn)激素，通過人工受精獲得不同家系受精卵，卵膜破裂4天后，各家系取20000尾混合統(tǒng)一池塘培育，并孵化獲得不同家系魚苗，將各家系魚苗培育至夏花階段后，平均分配到多個池塘進(jìn)行種魚F1培育。

本實施例中，所述步驟1.2具體如下：

1.21將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能優(yōu)良，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的20％-30％、健康無病、無畸形的個體，對生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，剪取魚種F1-A的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.22將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行不同溫度的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高溫耐受實驗存活下來魚種F1-B的部分胸鰭和低溫耐受實驗存活下來的魚種F1-b，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.23將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行高鹽度的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高鹽耐受實驗存活下來魚種F1-C的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.24將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行不同溶氧的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取高溶氧耐受實驗存活下來育種F1-D的部分鰭條和低溶氧耐受實驗存活下來育種F1-d的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.25將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取4000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行水體PH的耐受實驗，實驗結(jié)束后剪取耐酸性PH實驗存活下來育種F1-E的部分鰭條和耐堿性PH實驗存活下來育種F1-e的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.26將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行饑餓耐受實驗，實驗結(jié)束后對實驗魚進(jìn)行形態(tài)測量和體重稱量，剪取存活下來減重低于平均減重15-20％的魚種F1-F的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆茫?/p>

1.27將步驟1.15中所述的種魚F1培育6-8個月后選取2000尾生長性能能良好，體型勻稱、游動活潑、體重高于平均體重的10-20％、健康無病、無畸形、生長數(shù)據(jù)差異小于5％的個體進(jìn)行抗病能力實驗，實驗結(jié)束后剪取抗病能力實驗存活下來魚種F1-G的部分鰭條，無水乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

本實施例中，所述步驟1.3具體包括：將所述步驟1.21-1.27步驟中獲得的F1基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)F1-A、F1-B、F1-b、F1-C、F1-D、F1-d、F1-E、F1-e、F1-F、F1-G作為優(yōu)良基因魚苗個體F1基因庫。

本實施例中，所述步驟1.4具體包括：通過魚種親子鑒定的多重PCR微衛(wèi)星序列和Cervus3.0軟件根據(jù)F1-A、F1-B、F1-b、F1-C、F1-D、F1-d、F1-E、F1-e、F1-F、F1-G確定對應(yīng)的親本個體基因F0-A、F0-B、F0-b、F0-C、F0-D、F0-d、F0-E、F0-e、F0-F、F0-G，確定優(yōu)質(zhì)親本魚苗，其余未被選擇的親本標(biāo)記為F0-remain。

所述用于草魚親子鑒定的多重PCR微衛(wèi)星序列如表1所示：

表1

值得特別說明的是，通過多重PCR技術(shù)根據(jù)上述表1所述內(nèi)容獲得F1對應(yīng)親本的方法及步驟屬于現(xiàn)有技術(shù)，故而，在此不再詳述。

將上述獲得的優(yōu)質(zhì)品種F1的親本F0選出，作為飼養(yǎng)優(yōu)質(zhì)親本，依然通過人工受精的方式獲得養(yǎng)殖水域所需魚種進(jìn)行定數(shù)養(yǎng)殖，經(jīng)過反復(fù)驗證得知，其優(yōu)質(zhì)魚種的生長較普通魚種生長平均快10％以上的(重量比)占投放數(shù)量的90％-92％之間，體現(xiàn)出良好的生長性能和抗逆性。

一種魚類生長和多個抗逆性能綜合選育的驗證方法，包括以下步驟：

6.1第二年將F0-A、F0-B、F0-b、F0-C、F0-D、F0-d、F0-E、F0-e、F0-F、F0-G分別與F0-remain進(jìn)行人工受精，建立對照群體f1-A、f1-B、f1-b、f1-C、f1-D、f1-d、f1-E、f1-e、f1-F、f1-G和f1-remain；

6.2從步驟6.1所述的對照群體f1-A、f1-B、f1-b、f1-C、f1-D、f1-d、f1-E、f1-e、f1-F、f1-G和f1-remain中選取6-8月齡魚種各2000尾進(jìn)行生長數(shù)據(jù)測量，并進(jìn)行抗逆性實驗，按照所述步驟1.21-1.27進(jìn)行，對比選擇培育的親本后代與非選育親本后代的生長性能能，抗病性能和抗逆性能，以驗證確定選育親本的后代較非選育后代之間存在明顯的生長和抗逆性差異。

6.3所述步驟6.2中生長穩(wěn)定、抗逆性好的品系對應(yīng)親本F0為目標(biāo)選育種魚，淘汰生長慢抗逆性不好的品系。

值得說明的是，通過本發(fā)明中所述選育方法得出的優(yōu)質(zhì)魚種的準(zhǔn)確率在90％以上，經(jīng)過所述驗證方法驗證后將遺傳不穩(wěn)定(隔代遺傳變異或偏差較大)的魚種進(jìn)行進(jìn)一步淘汰，獲得的魚種優(yōu)質(zhì)率達(dá)到95％以上，大大提高了魚的單位產(chǎn)量，同時因環(huán)境因素導(dǎo)致的死亡明顯降低，提高了養(yǎng)殖的安全性，降低了養(yǎng)殖的技術(shù)要求。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。