本發(fā)明屬于雜交水稻育種領(lǐng)域，具體涉及一種三系不育系抗螟雜交水稻的選育方法。

背景技術(shù)：

水稻是中國(guó)最重要的糧食作物之一，我國(guó)是雜交稻生產(chǎn)大國(guó)，每年的水稻種植面積約占農(nóng)作物種植面積的近1/3，產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的40％左右。

水稻也是蟲害最多的糧食作物之一，田間蟲害種類達(dá)624種以上，鱗翅目害蟲二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等一直是水稻生產(chǎn)的主要害蟲，螟蟲在我國(guó)每年危害面積達(dá)1000萬(wàn)公頃，每年僅螟蟲造成的產(chǎn)量損失多達(dá)1.0×10¹³kg。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)主要是通過化學(xué)農(nóng)藥防治螟蟲，不但增加水稻生產(chǎn)成本，而且造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題。

現(xiàn)有技術(shù)中的非轉(zhuǎn)基因三系雜交稻不育系和恢復(fù)系都不具備抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的能力，由它們所配置的雜交稻也都不抗螟蟲性能，農(nóng)民主要通過使用大量農(nóng)藥來(lái)防止蟲害，而大量農(nóng)藥的使用不僅導(dǎo)致水稻生產(chǎn)成本提高，影響稻米品質(zhì)，而且加大了環(huán)境污染，嚴(yán)重影響人民健康。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種三系不育系抗螟雜交水稻的選育方法，把抗螟蟲基因通過雜交及回交育種方法快速、穩(wěn)定地導(dǎo)入三系不育系中，育成遺傳背景與保持系完全相同的抗螟水稻三系不育系，與育成的不育系配置的三系雜交組合抗性好，每畝產(chǎn)量可增16.2-39.7％，后代都具有抗蟲性。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種三系不育系抗螟雜交水稻的選育方法，包括如下步驟：

1)以攜帶抗螟基因Cry1Ac1的抗螟水稻保持系為輪回親本，與粳稻不育系進(jìn)行連續(xù)成對(duì)回交5-7代，利用轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙檢測(cè)抗螟基因的蛋白表達(dá)，結(jié)合田間螟蟲抗性測(cè)定，篩選出不育性穩(wěn)定、柱頭外露率高的、且導(dǎo)入抗螟蟲基因的抗螟蟲不育系；

2)以步驟1)獲得的抗螟蟲不育系為母本，以高配合力的恢復(fù)系為父本，進(jìn)行雜交，獲得高產(chǎn)、抗螟蟲、米質(zhì)優(yōu)的抗螟雜交水稻。

進(jìn)一步，步驟1)所述的抗螟水稻保持系攜帶Cry1Ac1基因，優(yōu)選‘秀水134Bt’，步驟1)所述的粳稻不育系具有產(chǎn)量高、柱頭外露率高的特點(diǎn)。

又，步驟2)中所述的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條為Cry1Ab/Cry1Ac基因的檢測(cè)試紙條。

進(jìn)一步，步驟2)中的恢復(fù)系為R7、R8、R64、R248、R250或R251。

本發(fā)明中的水稻品系‘秀水134Bt’是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將人工改造后的cry1Ac1基因?qū)敫弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)粳稻品種‘秀水134’中，通過分子手段篩選出具有cry1Ac1轉(zhuǎn)錄活性的單拷貝的、整合了完整目的基因且T-DNA插入位點(diǎn)未打斷已知功能基因的獨(dú)立轉(zhuǎn)化體，并通過后代自交分離篩選獲得純系。

本發(fā)明中的水稻品系‘銀玉A’為優(yōu)質(zhì)粳稻不育系，具有柱頭外露率高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良以及米質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)。

本發(fā)明利用攜帶抗螟基因cry1Ac1(GenBank accession no.AY126450)的保持系與不育系進(jìn)行回交，將抗螟蟲基因?qū)肴挡挥抵?，育成遺傳背景與保持系完全相同的三系不育系，期間，采用轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)合田間抗螟蟲表觀特征，篩選出選出農(nóng)藝性狀與保持系親本基本一致，同時(shí)具有抗螟基因的不育系，再以該不育系為母本，以強(qiáng)優(yōu)恢復(fù)系為父本，雜交后得到抗螟雜交水稻，該抗螟雜交水稻可抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗螟蟲的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明節(jié)省了成本，提高了雜交稻產(chǎn)量，減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，是當(dāng)前解決雜交稻螟蟲危害的最有效方法之一，是保證高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)重要途徑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明把抗螟蟲基因通過雜交及回交育種方法導(dǎo)入三系不育系中，育成遺傳背景與保持系完全相同的三系不育系，選育過程中利用轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條和田間抗螟蟲相結(jié)合進(jìn)行篩選，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，省時(shí)省力，選擇高配合力的恢復(fù)系R7、R8、R64、R248、R250、R251為父本分別與本發(fā)明選育的抗螟蟲不育系配置，得到的三系雜交水稻組合抗蟲性好，可抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等，畝產(chǎn)量增加16.2-39.7％。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中的134BtA不育系抗螟蟲蛋白檢測(cè)結(jié)果。

圖2-圖7為本發(fā)明實(shí)施例中134BtA不育系與不同恢復(fù)系測(cè)交得到的精米外觀品質(zhì)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白檢測(cè)試紙條為上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Cry1Ac轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條。

實(shí)施例

1.抗螟蟲不育系的選育

用攜帶抗螟基因Cry1Ac1的粳稻保持系‘秀水134Bt’與優(yōu)質(zhì)粳稻不育系A(chǔ)雜交，以秀水134Bt為輪回親本，與優(yōu)質(zhì)粳稻不育系‘銀玉A’連續(xù)回交6代，采用Cry1Ab/Cry1Ac轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條快速檢測(cè)及田間螟蟲抗性測(cè)定，篩選得到抗螟蟲的不育系134BtA。

其中，應(yīng)用Cry1Ab/Cry1Ac轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙條檢測(cè)抗螟蟲蛋白，基于雙抗體夾心免疫層析的原理，待檢測(cè)樣本中的抗原在側(cè)向移動(dòng)過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體1結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，繼續(xù)向前方流動(dòng)，與NC膜檢測(cè)線上的特異性單克隆抗體2結(jié)合，形成雙抗夾心復(fù)合物，如果待檢測(cè)樣本中轉(zhuǎn)基因蛋白占可溶性蛋白的含量大于1％，檢測(cè)線顯紅色，結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)線不顯色，結(jié)果為陰性。

水稻葉片中的蛋白質(zhì)抽提和試紙條檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書中描述的步驟進(jìn)行，檢測(cè)步驟如下：

a)準(zhǔn)備待測(cè)樣品：取水稻葉片0.1g于1.5ml，搗碎，加入0.2ml PBS緩沖液，蓋好蓋子，振蕩提取管20-30s，確保樣品與緩沖液充分混勻，快速離心10s；

b)快速檢測(cè)：將試紙條取出，直接插入待測(cè)樣品中，開始計(jì)時(shí)，10-15分鐘后讀取數(shù)據(jù)。

結(jié)果分析：若質(zhì)控線未出現(xiàn)，則檢測(cè)結(jié)果判定為無(wú)效；若有質(zhì)控線，又有檢測(cè)線，則為陽(yáng)性；若有質(zhì)控線，沒有檢測(cè)線，則判定為陰性，蛋白檢測(cè)結(jié)果見圖1，其中，‘秀水134Bt’為陽(yáng)性對(duì)照，CK是非轉(zhuǎn)基因一般常規(guī)水稻作為陰性對(duì)照，134BtA為本發(fā)明篩選獲得的抗螟蟲不育系雜交水稻。

從圖1可以看出，本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因抗螟蟲不育系134BtA可以明顯檢測(cè)到Bt抗螟蟲蛋白的表達(dá)。

2.配置抗螟雜交水稻

以步驟1獲得的不育系134BtA為母本，分別以現(xiàn)有的6個(gè)高配合力的強(qiáng)優(yōu)恢復(fù)系R7、R8、R64、R248、R250和R251為父本，測(cè)交組配，篩選出6個(gè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗螟蟲的強(qiáng)優(yōu)質(zhì)抗螟蟲雜交組合。

對(duì)獲得的6個(gè)測(cè)交組合的田間農(nóng)藝性狀及螟蟲抗性進(jìn)行調(diào)查，以秀水134Bt為對(duì)照組，對(duì)田間農(nóng)藝性狀的進(jìn)行調(diào)查時(shí)，每組調(diào)查3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)調(diào)查10株；田間抗蟲性調(diào)查以稻縱卷葉螟危害情況為準(zhǔn)，葉片上有昆蟲啃噬的白色條斑，或者有明顯的縱向卷葉、葉緣有白絲、卷葉地步有白色條斑的植株視為稻縱卷葉螟受害株，各測(cè)交組合的農(nóng)藝性狀及蟲害率調(diào)查結(jié)果見表1，各雜交組合稻米的精米外觀品質(zhì)見圖2-圖7。

由表1可以看出，利用現(xiàn)有的強(qiáng)恢復(fù)系品系R7、R8、R64、R248、R250、R251分別與選育的134BtA配置雜交組合，抗蟲性好，蟲害株率均為0％，測(cè)交的各組合單株重量比對(duì)照組134Bt提高16.2-39.7％，而株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率、糙米率和精米率等性狀差異不顯著。

稻米外觀品質(zhì)是指米粒的性狀、大小、透明度和堊白(又稱心白、腹白)大小等，強(qiáng)恢復(fù)系品系R7、R8、R64、R248、R250、R251分別與選育的134BtA配置雜交組合的外觀分別參見圖2-7。由圖2-7可以看出，以恢復(fù)系R251為父本，與選育的抗螟蟲不育系134BtA配組得到的雜交組合米粒透明、堊白粒率和堊白度最低，因此，綜合田間農(nóng)藝性狀及外觀品質(zhì)，以恢復(fù)系R251為父本與134BtA選配的雜交組合最好，與對(duì)照組相比，增產(chǎn)約39.7％，命名為‘滬克螟1號(hào)’。