本發(fā)明涉及鲌魚的四倍體培育方法，具體涉及一種提高鲌魚雄性四倍體育成率的方法。
背景技術(shù)：
鲌魚，有翹嘴鲌、蒙古鲌等，背部和體側(cè)上部為淺灰色，腹部為銀白色，下顎肥厚向上突出上翹，其中翹嘴鲌是我國(guó)鲌亞科最大的一種魚，其它幾種體型較小，但均肉肉鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。三倍體鲌魚的不育特征，使其在生長(zhǎng)速度、抗逆性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有技術(shù)中，不育三倍體魚是通過(guò)四倍體魚與二倍體魚倍間雜交獲得，但要獲得98%以上的三倍體魚，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體魚系。
在魚類遺傳育種中，通常利用冷/熱休克，或通過(guò)雜交等方法抑制受精卵的第一次有絲分裂或直接異源染色體加倍，制備出同源或異源四倍體魚，其中冷休克一般是與靜水壓處理一起，難以獲得較高純度的四倍體系，而熱休克的方式雖然易于操作，同樣，難以獲得純度高的四倍體系；而雜交的方法雖然純度高，但成功率低、周期長(zhǎng)。此外，上述這些方法制備的四倍體魚，有些可育、有些又不可育，同時(shí)也可能存在基因混雜現(xiàn)象（異源四倍體），容易造成生物危險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高受精率和孵化率、且方法穩(wěn)定、種群純度高達(dá)100%的鲌魚四倍體的育成方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
提高鲌魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為60～120mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到240～600ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用；催產(chǎn)劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用0.7～0.9%生理鹽水稀釋配制而成，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素的劑量為5～10 IU/g；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對(duì)母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為40～160μg/kg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過(guò)注射處理的母本與不經(jīng)過(guò)任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1～1.0℃的冷水中，靜水壓壓力為240～330Kg/cm2，持續(xù)時(shí)間為3～5min；
（5）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80～200mg/l，睪酮的濃度為20～80mg/l；
（6）取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10～30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得100%鲌魚雄性四倍體純系。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的雙重作用的同時(shí)，推延了受精卵第一次卵裂的時(shí)間（3-5min）和提高了同步程度（高達(dá)99%），為染色體加倍和提高其四倍體率提供了時(shí)間保障和奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；2、在受精卵一次卵裂采用冷休克與較低的靜水壓（低于常用的350kg/cm2），以及較短的處理時(shí)間（低于5min），不僅有效降低因?yàn)槔湫菘藭r(shí)間過(guò)長(zhǎng)、壓力過(guò)高對(duì)受精卵的破壞程度，提高受精卵的成活率，而且降低了操作難度和加壓成本；3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強(qiáng)化與保證雄性轉(zhuǎn)化率。因而通過(guò)此方法，可獲得100%的鲌魚雄性四倍體純系，提高了四倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，為培育對(duì)自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無(wú)污染的不育三倍體純系打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例一
提高翹嘴鲌雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為60mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到240ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的濃度約為0.25mg/ml，待用；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對(duì)母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為120μg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注射液120μg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過(guò)注射處理的母本與不經(jīng)過(guò)任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為0℃的冷水中，靜水壓壓力為240Kg/cm2，持續(xù)時(shí)間為3min；
（5）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為160mg/l，睪酮的濃度為60mg/l；
（6）取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得100%翹嘴鲌雄性四倍體純系。
實(shí)施例二
提高蒙古鲌雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為120mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到400ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的濃度為0.3mg/ml，待用；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對(duì)母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為160μg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注射液160μg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過(guò)注射處理的母本與不經(jīng)過(guò)任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1℃的冷水中，靜水壓壓力為300Kg/cm2，持續(xù)時(shí)間為3min；
（5）雌激素抑制劑溶液配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為200mg/l，睪酮的濃度為80mg/l；
（6）取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得100%蒙古鲌雄性四倍體純系。
上述兩個(gè)實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，任意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式及結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
附：鲌魚雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計(jì)
注：上述結(jié)果是在注射液中他莫昔芬的濃度為0.3mg/ml的條件下一次卵裂時(shí)靜水壓處理3分鐘，并在雌激素抑制劑溶液中常溫浸泡10S，所取得的結(jié)果。