本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種低劑量電離輻射生物誘變方法及應用和植物育種方法。

背景技術：

通常的輻射誘變，是利用χ、γ、α、β射線和中子、紫外光等輻射處理生物體，誘發(fā)遺傳物質的改變，使后代出現新的變異類型。在植物誘變中，一般采用60Co-γ射線對植物種子進行處理，所采用的劑量通常為50-300Gy，根據不同植物種類或品種，適宜的輻射劑量有所不同。其主要特征是，(1)誘導產生新的基因序列變異；(2)輻射劑量大；(3)變異方向不可控，多數為劣變；(4)致死率高。

目前農業(yè)育種(包括工業(yè)微生物菌種)中常用的育種材料，包括一般品種、親本、自交系和自然種，雖然通過多代篩選，在表型上已經具有很高的一致性，但是群體內都存在著大量的隱匿性遺傳變異(遺傳多樣性)，這些變異來自于長期的自然突變。基于最新提出的遺傳緩沖理論，在生物群體中，多數性狀都存在大量的隱匿性遺傳變異，在正常條件下，遺傳緩沖阻止了這些遺傳變異的表達，保證生物發(fā)育和表型的穩(wěn)定性，當發(fā)生某些環(huán)境脅迫或其他變化時，遺傳緩沖被抑制或干擾，正常發(fā)育被破壞，生物中隱藏的遺傳變異得到表達，產生了新的表型變異。

目前，尚未有利用該理論進行生物誘變或植物育種的應用方法。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的生物誘變方法及應用和植物育種方法。本發(fā)明的方法利用群體中積累的隱匿性變異，不產生新的遺傳變異；變異頻率高；可產生有利或綜合性的變異性狀；通過篩選富集變異可穩(wěn)定遺傳。并且簡便、可大批量進行；輻射劑量小，不會對植物正常生長產生顯著影響，便于變異篩選。

本發(fā)明的第一方面是提供一種低劑量電離輻射生物誘變方法，該方法包括：利用低劑量電離輻射處理休眠態(tài)生物體，使其發(fā)生表型變異。根據本發(fā)明，所述低劑量電離輻射只要能實現休眠態(tài)生物體的表型變異即可。優(yōu)選地，所述低劑量電離輻射的劑量為1Gy以下。進一步優(yōu)選為5-200mGy。

根據本發(fā)明，優(yōu)選地，所述低劑量電離輻射的劑量率為100mGy/天以下，進一步優(yōu)選為10mGy/天以下，可長時間連續(xù)或間斷處理。

本發(fā)明的原理基于此：Hsp90是一種分子伴侶，其在生物的遺傳緩沖中起著核心作用。Hsp90遺傳緩沖抑制了這些變異的表達并積累變異。利用低劑量電離輻射干擾Hsp90基因表達和遺傳緩沖，生物群體中會產生各種表型變異，由于這些變異多數是由許多微小變異控制的，可以通過篩選和雜交將其富集，成為穩(wěn)定遺傳性狀。

Hsp90家族非常保守，在動物、植物、真菌和細菌中都已發(fā)現Hsp90的同源基因。因此，根據本發(fā)明，所述休眠態(tài)生物體可以為生長和代謝處于暫時停頓狀態(tài)的任何生物體，優(yōu)選為植物種子或其他植物繁殖體、微生物孢子和動物卵中的至少一種。所述植物種子可以為植物干種子或濕種子。所述其他植物繁殖體優(yōu)選包括：用于繁殖的球莖、塊莖、塊根、根莖、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細胞組織、懸浮細胞系或原生質體。其中，所述植物種子例如為擬南芥種子，所述微生物孢子例如為細菌芽孢，所述動物卵例如為果蠅卵。

本發(fā)明的第二方面是提供上述生物誘變方法在生物育種中的應用。

其中，本發(fā)明的所述生物可以包括植物、卵生動物或微生物。

本發(fā)明的第三方面是提供一種植物育種的方法，該方法包括：

(1)根據上述方法對植物種子或其他植物繁殖體進行生物誘變，得到表型變異體；

(2)篩選并雜交所述表型變異體，使其遺傳性狀穩(wěn)定。上述雜交的方法可以為本領域常規(guī)的雜交方法。

根據本發(fā)明，通過低劑量電離輻射可能同時獲得多種不同變異的表型變異體。因此，篩選同種表型變異體進行雜交。

本發(fā)明中，所述植物種子可以為植物干種子或濕種子。所述其他植物繁殖體優(yōu)選包括：用于繁殖的球莖、塊莖、塊根、根莖、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細胞組織、懸浮細胞系或原生質體。

優(yōu)選地，所述植物種子為干種子，進一步優(yōu)選為擬南芥干種子。

根據本發(fā)明，所述電磁輻射可以為本領域常規(guī)的射線輻射，包括但不限于χ、γ、α、β射線、中子、紫外光。

目前已知抑制Hsp90基因功能的方法有：熱激、抑制劑、基因工程方法。其中，熱激是將動物、植物、微生物在較高的溫度下進行培養(yǎng)，使之處于熱激脅迫，細胞內大量蛋白變性，從而造成Hsp90分子伴侶的相對短缺；抑制劑，是將Hsp90蛋白的特異性抑制劑格爾德霉素加入到動物的食物或植物的培養(yǎng)基中；基因工程方法是通過基因突變或轉基因對Hsp90基因序列進行突變或對其表達進行抑制。以上三種方法進行誘變處理時，都存在較大的局限性，其中，熱激脅迫會對動、植物的生長產生嚴重影響，導致生長不良；抑制劑格爾德霉素見光易分解(48小時內)，只能對植物進行短期避光處理；基因工程方法難度較高，費時費力，不便于應用。

與常規(guī)輻射誘變和已知抑制Hsp90功能方法比較，本發(fā)明進行低劑量輻射處理方法的優(yōu)勢包括：

(1)利用群體中積累的隱匿性變異，不產生新的遺傳變異。

(2)變異頻率高。

(3)群體內積累的變異，多數已經過篩選，剩下的多為微效或有利變異，通過富集可產生有利或綜合性的變異性狀。

(4)方法簡便，可大批量進行。僅需對種子進行低劑量γ輻照處理，后續(xù)無需特殊培養(yǎng)條件即可誘導變異，一次可處理大量不同種類、品種的種子。

(5)輻射劑量小，不會對植物正常生長產生顯著影響，便于變異觀察。本發(fā)明所用輻射劑量約為通常輻射育種所用劑量的幾千-幾十萬分之一。處理后，植物的正常生長不會受到顯著影響，僅有少數植株會發(fā)生一些形態(tài)變異，非常方便觀察與篩選。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

圖1顯示的是Greenville生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導突變體。

圖2顯示的是Col-PRL生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導突變體。

具體實施方式

一、植物低劑量輻射誘變及選育方法

1、誘變材料的選擇

誘變材料的選擇是低劑量輻射誘變育種能否成功的關鍵之一，應根據育種目標，選擇綜合性狀優(yōu)良、穩(wěn)定、一致的品種作為誘變材料，它們可以是推廣品種、地方品種、野生種、自交系、雜交種的親本、甚至雜交種。所選品種材料已具有育種目標所要求的大部分性狀，僅需改良某些方面的性狀，例如：提高產量、改良品質、增強抗性等。所選材料應具有通過有性雜交繁殖后代的能力。用于誘變的材料可以是干種子、濕種子；也可以是用于繁殖的休眠態(tài)營養(yǎng)體，如球莖、塊莖、塊根、根莖等；休眠的接穗或芽；花粉粒；以及植物組織培養(yǎng)的外植體、化藥、小孢子、體細胞組織、懸浮細胞系和原生質體等，優(yōu)選為植物干種子。

2、低劑量輻射誘變

選取一定數量的上述植物材料，優(yōu)選地，每種材料的數量大于1000個。利用χ、γ、α、β射線和中子、紫外光對所選材料進行輻照處理，優(yōu)選地，使用60Co-γ射線進行輻照處理。輻照的總劑量小于1Gy，優(yōu)選地，總劑量小于200mGy，大于5mGy。輻照處理可以長時間連續(xù)或間斷進行，每天輻照劑量小于100mGy，優(yōu)選地，每天輻照劑量小于10mGy，輻照周期大于5天，優(yōu)選地，輻照周期大于10天。輻射處理后可以立即進行萌發(fā)，也可低溫儲藏一定時間后再進行萌發(fā)，優(yōu)選為30天以內。

3、變異的選育

低劑量輻射誘變當代即可表現突變性狀。在輻照當代，從幼苗期開始，篩選植株形態(tài)、發(fā)育、果實等各種性狀變異，并按性狀的相似性對變異株進行分類。根據育種目標挑選感興趣的變異株進行自交留種，或與性狀相近的變異株進行雜交留種。在自交和雜交后代中選取目標性狀突出的變異株，再進行自交和雜交留種。重復進行幾代后即可獲得具有穩(wěn)定性狀的突變體。

多數變異株的前幾代自交或雜交后代群體，表現父代變異性狀的頻率較低，通過自交或雜交可以使變異性狀表現頻率逐漸升高。一般經過3-5代自交或雜交即可獲得具有較高表現率的性狀穩(wěn)定的突變群體。

二、微生物孢子低劑量輻射誘變方法

1、誘變材料的選擇

用于誘變的微生物可以是用于工業(yè)、農業(yè)、林業(yè)、醫(yī)學、藥用等各種行業(yè)的微生物菌種，誘變的材料可以是真菌的孢子或細菌的芽孢。

2、低劑量輻射誘變

輻照的劑量與方法與植物低劑量輻射誘變方法相同。

3、突變體篩選

將輻照過的菌種，在通用或篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，通過對菌落形態(tài)的觀察、染色鑒定以及生理生化試驗，篩選變異菌株，再通過分離純化和繼代培養(yǎng)，獲得具有穩(wěn)定表型的變異株。

三、動物卵低劑量輻射誘變方法

1、誘變材料的選擇

用于誘變的動物可以是各種卵生動物，包括一般的鳥類、爬蟲類，大部分魚類和昆蟲。如：雞、鴨、魚、青蛙、烏龜、蝴蝶、果蠅等。誘變材料為各種動物的卵。

2、低劑量輻射誘變

輻照的劑量與方法與植物低劑量輻射誘變方法相同。

3、變異的選育

具體選育方法與植物低劑量輻射變異的選育方法相同。。

實施例

用低劑量的60Co-γ射線對擬南芥干種子(Greenville生態(tài)型和Col-PRL生態(tài)型)進行輻照處理，輻照的總劑量為100mGy，輻照處理間斷進行，每天輻照劑量為8mGy。分析表明，處理擬南芥在萌發(fā)后的較長時期內Hsp90基因的表達發(fā)生持續(xù)性變化，并且，一些處理群體產生新的表型變異。圖1顯示的是Greenville生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導突變體。由圖1可以看出，星號所標識的擬南芥植株發(fā)生了表型變異。圖2顯示的是Col-PRL生態(tài)型擬南芥低劑量輻射誘導突變體。由圖2可以看出，框線內的擬南芥植株發(fā)生了表型變異。

根據育種目標挑選感興趣的變異株進行自交留種，或與性狀相近的變異株進行雜交留種。在自交和雜交后代中選取目標性狀突出的變異株，再進行自交和雜交留種。重復進行3代后即可獲得具有穩(wěn)定性狀的突變體。

由此可見，對植物種子進行低劑量電離輻射處理可以作為一種干擾Hsp90功能，誘導變異的有效手段。

以上已經描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術領域的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。